2.1  大体观察的结果  大体观察见新鲜骨块颜色偏黄，表面粗糙，脂肪大量存在于骨块内外，无法清除辨别孔隙；2组脱脂处理的骨块则颜色雪白，无明显脂肪存在，孔隙清晰且相互连通，孔壁内无其他附着物，见图2。

2.2  剩余脂质含量的测定结果  索氏提取法测定2组脱脂骨块的剩余脂质含量，梯度乙醇组剩余脂肪含量(1.28± 0.07)%，丙酮组剩余脂肪含量(1.13±0.22)%。经过SPSS软件统计分析显示，梯度乙醇组与丙酮组骨块的剩余脂质含量差异无显著性意义(P=0.385)，见图3。

2.3  红外光谱仪的测定结果  在新鲜组骨块的红外光谱(图4A)中：559 cm^-1和605 cm^-1处吸收峰是由PO₄^3-中的O-P-O键产生的；1 037 cm^-1处吸收峰是由PO₄^3-中的P-O键产生的；1 464 cm^-1和1 561 cm^-1处的吸收峰是由骨中碳酸盐成分的CO₃^2-产生的；1 637 cm^-1出现的是骨中水分的羟基产生的；3 417 cm^-1处吸收峰是由骨中羟基磷灰石成分的羟基产生的；2 853 cm^-1和2 924 cm^-1处的吸收峰，主要是由骨中饱和脂肪酸成分的C-H键产生的。

在梯度乙醇组骨块的红外光谱(图4B)中：559 cm^-1处的吸收峰是由PO₄^3-中的O-P-O键产生的；1 038 cm^-1处的吸收峰是PO₄^3-中的P-O键产生的；1 384 cm^-1处的吸收峰是由骨中碳酸盐成分的CO₃^2-产生的；1 654 cm^-1处的吸收峰是由骨中水分的羟基产生的；3 434 cm^-1处的吸收峰是由骨中羟基磷灰石成分的羟基产生的；2 853 cm^-1和2 923 cm^-1处的吸收峰，主要是由骨中饱和脂肪酸成分的C-H产生的。

在丙酮组骨块的红外光谱(图4C)中：605 cm^-1处的吸收峰是由PO₄^3-中的O-P-O键产生的；1 036 cm^-1处的吸收峰是PO₄^3-中的P-O键产生的；1 407 cm^-1处的吸收峰是由骨中碳酸盐成分的CO₃^2-产生的；1 638 cm^-1的吸收峰是由骨中水分的羟基产生的；3 415 cm^-1处的吸收峰是由骨中羟基磷灰石成分的羟基产生的；2 853 cm^-1和2 924 cm^-1处的吸收峰，主要是由骨中饱和脂肪酸成分的C-H键产生的。

观察3组红外光谱图可见，由骨中饱和脂肪酸成分的C-H键所产生的吸收峰高度存在明显差异，2组脱脂骨块在此处的吸收峰高度相近，且明显低于新鲜组骨块，证明这2种脱脂方法的脱脂效果相近，且均能有效去除骨中脂质。而其他成分，如PO₄^3-、碳酸盐及羟基磷灰石等，在3组图中不能观察到明显的差异，证明这2种脱脂处理不会破坏骨的天然结构和无机物成分。

2.4  生物力学检测的结果  梯度乙醇组骨块最大应力为(10.11±0.07) MPa，弹性模量为(118.27±0.85) MPa；丙酮组骨块最大应力为(10.09±0.39) MPa，弹性模量为(118.10± 4.52) MPa；新鲜骨块骨块最大应力为(10.09±0.67) MPa，弹性模量为(119.93±4.94) MPa。采用两独立样本t 检验对3组骨块的最大应力和弹性模量分别进行两两比较，结果如下：在最大应力方面，梯度乙醇组与丙酮组、梯度乙醇组与新鲜组、丙酮组与新鲜组之间差异均无显著性意义(P=0.988，P=0.959，P=0.973)，见图5；在弹性模量方面，梯度乙醇组与丙酮组、梯度乙醇组与新鲜组、丙酮组与新鲜组之间差异无显著性意义(P=0.660，P=0.596，P=0.763)，见图6。

在同种异体骨移植材料中，脂质的存在会影响移植的安全性与有效性^[1-3]。脂质成分会导致免疫排斥反应，骨内脂肪及细胞膜上的脂蛋白和脂溶性糖肽均被证实为骨移植中的重要抗原成分^[4-6]。此外，由于骨组织中含有大量脂肪，脂肪填充于骨髓腔和其他管腔的孔隙中，脂肪的疏水性导致部分化学试剂很难进入骨基质孔隙中，影响材料的可湿性，从而导致脱细胞及脱蛋白等降低免疫原性的重要程序无法有效进行^[7]。大量脂肪的存在使异体骨的骨传导能力下降从而影响其成骨能力，附着在骨小梁表面的脂肪形成屏障阻碍细胞长入，还可引起巨噬细胞反应而导致骨组织的过度吸收形成纤维组织填充^[8]。骨内脂质成分经过辐照后会生成氧化或过氧化脂质，且辐照后骨中过氧化脂质含量较辐照前增加两三倍，这些成分的大量生成会增加移植材料的细胞毒性^[9-11]。因此，脱脂成为获取同种异体骨移植材料的首要程序。

脱脂的方法主要分为化学和物理两大类。化学方法主要以有机溶剂萃取脂肪为主，有机溶剂萃取是用挥发性有机溶剂将异体骨中脂质成分浸提出来。常用溶剂有石油醚、乙醇、甲醇、氯仿、二氯乙烷、丙酮等。丙酮作为一种经典的脱脂溶剂，已经被证实取得了很好的脱脂效果，也是目前较为常用的一种方法^[12-13]。物理方法主要以超声波清洗为主，通过高频振动将骨组织表面和孔隙内脂肪清除，单纯使用该方法并不能有效去除骨组织中的脂肪，一般需配合有机溶剂共同使用。因此，仍需要寻找一种安全、有效且操作简单的脱脂方法。GARDIN等^[14]在研究牛骨脱脂技术时，采用梯度乙醇进行脱脂处理，结果发现使用梯度乙醇脱脂处理的骨块脂含量明显低于未使用梯度乙醇的骨块，该作者认为梯度乙醇对脱脂具有积极的作用。梯度乙醇处理可以同时造成脂肪细胞的破裂和脂质的溶解，达到脱脂的目的。

此次研究比较梯度乙醇脱脂与丙酮脱脂对同种异体松质骨的脱脂效果，并观察该脱脂方法是否会降低骨的力学性能。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  组间比较实验。

1.2  时间及地点  2019年7至9月北京赛瑞美科生物科技有限公司完成。

1.3  材料  

1.3.1  人体股骨  于中国人民解放军总医院骨组织库获取，实验过程中人体骨组织的处置符合国家卫生健康委员会颁发的《人体捐献器官获取与分配管理规定》^[15]。研究方案的实施符合天津医院的相关伦理要求。

1.3.2  主要试剂与设备  见表1。

1.4  实验方法

1.4.1  同种异体松质骨块的获取方式如下  ①新鲜人股骨髁放入无菌塑料袋中置入-80 ℃冰箱中冷冻超过4周；②从股骨髁中获取5 mm×5 mm×5 mm的松质骨块60粒；③获取的松质骨块放入去离子水中使用超声波清洗机清洗  4 h，每小时更换1次去离子水。

1.4.2  分组  处理完毕后将60粒骨块根据脱脂处理的不同平均分为3组，每组20粒：梯度乙醇组进行梯度乙醇脱脂处理；丙酮组进行丙酮浸泡脱脂处理；新鲜组未进行脱脂处理的骨块作为对照。

1.4.3  梯度乙醇脱脂处理过程  使用无水乙醇与去离子水配置体积分数为50%的乙醇溶液，之后依次使用体积分数50%，75%，95%，100%乙醇浸泡骨块，同时使用机械搅拌器进行搅拌，转速设定为200 r/min。

1.4.4  丙酮脱脂处理过程  使用无水乙醇与去离子水配置体积分数为50%的乙醇溶液，之后使用丙酮浸泡骨块   3 h，之后使用体积分数50%乙醇浸泡1 h，该过程进行2次，同时使用机械搅拌器进行搅拌，转速设定为200 r/min。

1.4.5  剩余脂质含量测定  采用索氏提取法测定脱脂处理后骨块的剩余脂质含量。每组取10粒骨块，使用高速粉碎机将骨块粉碎至粒径<900 μm的骨粒。将定性滤纸折叠成滤纸包，分析天平精密称质量，每组骨粒平均分成5份，放入滤纸包后再次精密称质量，得到每份骨粒质量，记作m₁。将滤纸包放入虹吸管内，加入150 mL石油醚。按顺序连接好索氏提取仪，将连接好的仪器放入恒温水浴锅中，设定水温为50 ℃，待第1次虹吸时开始计时，持续提取  24 h，保持石油醚每10 min冲洗1次样品。索氏提取完成后取出滤纸包，于50 ℃烘干6 h，放入干燥器中至室温。精密称量烘干后的滤纸包总质量、滤纸质量，计算出脱脂后骨粒质量，记作m₂。

骨粒剩余脂肪含量计算：剩余脂肪含量=(m₁-m₂)/ m₁×100%。

剩余脂质含量是计量资料，该数值越低，则证明该脱脂方法对骨块的脱脂效果越好。

1.4.6  红外光谱仪测定  实验采用红外光谱法观察2组脱脂骨块内脂质及其他成分的变化。将新鲜骨组织和2组脱脂骨组织各取2 mg充分研磨，之后加入200 mg的KBr继续研磨，将研磨好的混合颗粒放置于压片机上完成压片。制片完成后将含有骨组织的压片放置于红外光谱仪的光路中，选择4 000-400 cm^-1红外光波段进行扫描并制图。与新鲜骨组织的红外光谱图相比，脂质成分的特征性吸收峰越低，则证明该脱脂方法的脱脂效果越好。

1.4.7  生物力学测试  在3组中分别取6个骨块使用电子万能试验机进行生物力学测试(见图1)。

实验前确保加载装置力线垂直于骨块表面，进行位移控制加载(1 mm/min)力学测试，当骨组织发生变形、破裂时停止测试，得到骨块的最大应力与弹性模量。最大应力和弹性模量为计量资料，该数值越大，则代表该脱脂骨块的力学性能越好。

1.5  主要观察指标  ①大体观察骨块的大体形状以及材料的形态和色泽；②骨块的剩余脂质含量；③骨块内各种成分的变化；④骨块最大应力和弹性模量。

1.6  统计学分析  数据分析使用SPSS 20.0统计学软件处理，计量资料(剩余脂质含量、最大应力和弹性模量)以 x(_)±s的形式表示，两组间比较采用两独立样本t 检验，双尾检验，P < 0.05时为差异有显著性意义。

同种异体移植，首要任务就是解决不同个体间的免疫排斥反应。脱脂处理是降低同种异体骨免疫原性的重要方法^[16-17]。骨移植中，受体对异体骨的反应主要是T淋巴细胞介导的针对异体骨细胞表面抗原的反应。T细胞识别的抗原位于细胞表面，而不是矿物质或骨基质^[18-20]。细胞表面抗原为镶嵌于细胞膜表面的糖蛋白、糖脂和糖肽，是细胞的区分标志，也是免疫识别的位点。要降低异体骨的免疫原性，就必须减少细胞表面抗原或改变其结构。通过去除骨内脂肪及细胞膜上的脂蛋白和脂溶性糖肽，破坏细胞性抗原的完整性，从而降低异体骨的免疫原性^[21-23]。CHAPPARD等^[7]将未经脱脂的骨块植入新西兰兔体内，植入后不久即可观察到移植物周围出现广泛的非特异性炎症，在骨小梁和新生成的巨细胞之间出现了明显的纤维化。这些巨细胞的出现与在急性胰腺炎病灶周围观察到朗格汉斯巨细胞的出现过程相似，而急性胰腺炎的病理特征主要为胰腺中脂肪酶释放到血液中而酶解脂肪组织。

骨组织中含有大量脂肪，脂肪填充于骨髓腔和其他管腔的孔隙中，脱脂处理可以将这些脂肪清除，不仅可以增加异体骨的可湿润性，还可以为新骨的生成留出孔隙。THOREN等^[8，24]对冷冻异体骨脱脂处理后植入兔体内观察移植物的免疫原性和成骨能力，结果发现，与未脱脂对照组相比，氯仿/甲醇脱脂组免疫反应显著降低，移植物周围新骨出现早、生成量大，作者认为脱脂可降低冷冻异体骨移植的免疫反应，增加异体骨移植后的成骨能力。经脱脂处理的异体骨植入动物体内1周后可观察到，清除脂质留下的空隙中有骨髓间充质干细胞长入，同时新骨也有少量生成；而未经脱脂处理的异体骨在植入后出现周围组织坏死，炎性细胞大量出现并包裹在坏死组织周围。这一研究证实，脂肪的存在使异体骨的骨传导能力下降从而影响其成骨能力，附着在骨小梁表面的脂肪形成屏障阻碍细胞长入，还可引起巨噬细胞反应而导致骨组织的过度吸收形成纤维组织填充。而脂肪脱除程度高的植骨材料植入体内后很容易被体液浸润，宿主骨周围的血管和组织更容易长入，有利于新骨生成。

辐照是一种常用的同种异体骨灭菌方法，即使是在无菌条件下获取的同种异体骨，在存入骨库之前也需要接受辐照灭菌^[25-26]。γ射线辐照是一种强氧化过程，骨内脂质成分经过辐照后会生成氧化或过氧化脂质，这些具有很强细胞毒性^[27-29]。脱脂处理可以降低同种异体骨的细胞毒性作用。MOREAU等^[30]将辐照后的人松质骨与成骨细胞共培养，结果显示死亡的成骨细胞大量出现在移植物周围，而未经辐照的移植物周围未出现明显的细胞死亡，辐照后移植物内过氧化脂质含量显著高于未经辐照组，辐照氧化脂质被认为是这成骨细胞大量死亡的主要原因。因此，在制备同种异体骨时，应增加脱脂处理以降低移植物的细胞毒性。

既往采用的脱脂方法，主要以物理和化学脱脂为主。物理脱脂以超声波清洗为主，但单纯使用超声波和去离子水的组合并不能实现脱脂的目标。化学脱脂以氯仿和丙酮为主，利用有机溶剂对脂质成分的萃取，实现将骨组织和脂质分离的目标，但有机溶剂的残留以及骨组织可湿润性差均是影响脱脂效果的重要因素^[31]。虽然有人提出使用脂肪酶和超临界流体萃取的方法解决这一问题，但在实际的制备和生产过程中，脂肪酶的种类繁多，获取工艺和价格不一，这是标准化生产的一大困难；而超临界流体萃取的设备造价高，维护成本昂贵，显然不能作为首选的标准化生产的脱脂方法。

为了寻找安全、有效且花费较少的脱脂程序，作者提出了梯度乙醇这一脱脂方法。大体观察梯度乙醇脱脂处理的骨块，颜色雪白，无明显脂肪存在，孔隙清晰且相互连通，孔壁内无其他附着物。通过索氏提取法2组脱脂骨块的剩余脂质含量测定，2组剩余脂质含量不存在差异，也就是说，可以认为梯度乙醇法达到了与丙酮法相同的脱脂效果。进一步通过观察红外光谱图发现，梯度乙醇可以有效去除骨内脂质成分，且不破坏骨的天然结构和无机物成分。为了梯度乙醇脱脂是否会降低骨块的力学性能，对3组骨块进行了生物力学检测，主要观察其最大应力和弹性模量的改变，结果发现，3组骨块的最大应力和弹性模量之间均不存在统计学差异，可以认为梯度乙醇脱脂不会降低骨块的力学性能。此外，乙醇的清除方法也十分简单，只需要对脱脂骨块进行高温干燥处理即可。因此，梯度乙醇，无论是从脱脂的有效性和安全性还是从操作简便等角度来考虑，均是一种极佳的脱脂方法。

此次实验结果表明，梯度乙醇脱脂与传统的丙酮溶剂萃取脱脂效果相似，且该方法不会降低骨的力学性能。梯度乙醇脱脂为下一步构建可供移植的异体骨组织打下了良好的基础。但该方法仍需进一步的体外细胞实验、体内植入实验及动物实验验证其安全性和有效性。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

异体骨：异体骨即同种异体骨，是指从患者以外的人体中获取的骨组织。在骨科领域应用广泛，异体骨是重建肿瘤切除后骨缺损的重要方式之一。当自体骨发生缺损需要植骨时，首先取自体骨进行移植，如果自体骨量有限，或者患者不愿意取自体骨时，需要取异体骨。

脱脂：脱脂指利用物理或化学方法去除骨内脂肪及细胞膜上的脂蛋白和脂溶性糖肽。同种异体骨中的脂质成分会导致免疫排斥反应，大量脂肪的存在使异体骨的骨传导能力下降从而影响其成骨能力，骨内脂质成分经过辐照后会生成氧化或过氧化脂质，这些成分的大量生成会增加移植材料的细胞毒性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

既往采用的脱脂方法，主要以物理和化学脱脂为主。物理脱脂以超声波清洗为主，但单纯使用超声波和去离子水的组合并不能实现脱脂的目标。化学脱脂以氯仿和丙酮为主，利用有机溶剂对脂质成分的萃取，实现将骨组织和脂质分离的目标，但有机溶剂的残留以及骨组织可湿润性差均是影响脱脂效果的重要因素^[31]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程