2.1  实验动物数量分析  实验选用新西兰雄兔12只，均为同体对照，实验过程中兔无脱失，全部进入结果分析。

2.2  建模后动物情况  建模后动物生命体征平稳，术后  1 h内麻醉苏醒，给予常规饲养，行为行动无异常，建模后各切口愈合时间分析结果见表1。进一步两两比较结果显示：除了移植物A，B术后切口愈合时间无显著差异(P > 0.05)，其他各组术后切口愈合时间均差异有显著性意义 (P < 0.05)，切口C愈合时间明显短于切口A，B(P < 0.05)，说明改良型富血小板纤维蛋白可以促进切口愈合，所有切口无感染及溃烂，切口周围毛发生长正常。

2.3  各组一般形态变化  见图4。 术后4个月，兔背部刮毛备皮后可触及皮下移植物，移植物质地较硬，呈扁平状，表面光滑，与皮肤粘连紧密，随皮肤活动度可，3种移植物大小、轮廓不同。通过精细解剖取出移植物可见，所有移植物与皮下组织粘连紧密、均呈扁平状，同体表触感一致。移植物A(颗粒软骨)：表面较不平整，轮廓不规则，呈饼状，软骨颗粒分散，无包膜，厚度为(2.51±0.23) mm；移植物B(筋膜包裹颗粒软骨)：表面平滑，可见筋膜包被，颗粒软骨相对集中，轮廓近似鹅卵石状扁圆型，质地较硬，厚度为(4.71±0.33) mm；移植物C(改良型富血小板纤维蛋白包裹颗粒软骨)：表面稍平整，可见表面软骨颗粒相互融合、未见明显包膜，颗粒软骨相对集中，轮廓规则与筋膜包裹移植物类似，硬度与筋膜包裹颗粒软骨移植物相当，厚度为(3.77±0.35) mm；说明颗粒软骨经包裹后移植可显著增加移植物厚度，移植物A，B，C厚度比差异有显著性意义(P < 0.05)，临床可根据患者对鼻梁高低、鼻基底凹陷改善程度需求选择适当包裹材料包裹颗粒软骨进行移植填充。

2.4  各组移植物组织学形态变化

2.4.1  苏木精-伊红染色结果  此3种移植物组织学参数等级评价结果见表2。苏木精-伊红染色切片光镜下观察均未见明显炎症细胞浸润，移植术后4个月，颗粒软骨间以软骨成分相互融合，颗粒软骨周边可见新生软骨细胞，移植物C的切片中可见软骨颗粒周边有较多的新生软骨细胞，部分颗粒软骨被纤维结缔组织包裹并连接为一整体组织，见图5。

组织学参数的比较采用Kruskal-Wallis H 检验，结果显示，此3组仅在存活率和再生潜力方面差异有显著性意义(存活率：χ²=13.327，P=0.001；再生潜力：χ²=17.969，     P < 0.001)，进一步利用Nemenyi法进行两两比较。结果见表3。在软骨细胞存活率方面，移植物C(改良型富血小板纤维蛋白膜包裹颗粒软骨)平均为70.08%，明显优于移植物A(53.50%)，B(58.41%)，移植物A(颗粒软骨)和移植物B(自体筋膜包裹颗粒)之间差异不显著，说明改良型富血小板纤维蛋白对移植后的软骨组织在存活率方面具有一定的促进作用。在炎症反应方面3种移植物镜下均未见明显的炎症细胞，分析主要是由于所有移植物及包裹介质均为自体组织，组织相容性较好；在血管化方面通过对比镜下单位面积视野中的血管数量发现移植物C的新生血管较移植物A，B稍多，但整体统计后发现并无显著差异，分析主要原因可能是术后4个月移植物已与周围组织相互融合稳定。

2.4.2  Masson三色染色结果  Masson染色结果显示3种移植物标本均呈红蓝相间染色，图中红色为肌纤维，蓝色为胶原纤维，根据胶原纤维所占单位镜下面积百分比进行分析显示3种移植物的胶原纤维含量相当，差异无显著性意义，见图6。

2.4.3  免疫组织化学染色结果  胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学染色见图7，统计学分析见表3。免疫组织化学染色显示：阳性表达为细胞质中的棕色沉积，表明细胞具有再生潜力，阴性表达为蓝色，位于细胞核中。缺乏棕色沉积为不能再生的成熟细胞。术后4个月3种移植物切片染色中，颗粒软骨移植物和自体筋膜包裹颗粒软骨移植物差异无显著意义；颗粒软骨移植物和自体筋膜包裹颗粒软骨移植物与改良型富血小板纤维蛋白包裹颗粒软骨移植物存在组间差异有显著性意义(P < 0.01)。

颗粒软骨具有来源广泛、组织相容性好、感染率低等优点，作为一种较为理想的自体材料在鼻整形术中被广泛应用^[1-3]。长期研究发现，单独应用颗粒软骨移植后会不可避免伴发软骨移植物吸收、可塑性差等问题，为此常采用自体或人工膜状材料包裹颗粒软骨进行移植^[1-3]。目前，常用的膜状包裹材料有自体筋膜、氧化再生纤维素膜、脱细胞异体真皮和乳酸纤维膜等材料，但是这些材料均有其自身缺点，自体筋膜伴有供区瘢痕问题，氧化再生纤维素膜和脱细胞异体真皮等工材料包裹颗粒软骨吸收率较高，存在排异反应且费用昂贵^[7]，因此若能探寻一种无供区损伤且性能优良的自体包裹材料将有益于颗粒软骨移植技术的临床应用推广。

GHANAATI等^[8]于2014年通过低速延时离心自体静脉血的方法制备了第三代血小板制品：改良型富血小板纤维蛋白，与前两代血小板制品相比，改良型富血小板纤维蛋白组织相容性好、无排异反应、质地柔韧、富有弹性，其内部网状纤维蛋白结构更加疏松，同时含有更多的生长因子(如血小板源性生长因子、转化生长因子β1、胰岛素样生长因子、表皮生长因子和血管内皮生长因子等)和细胞因子(如白细胞介素和肿瘤坏死因子α)，这些生长因子和细胞因子对创面愈合、软组织修复再生、骨及软骨细胞的增殖分化均有促进作用^[9-11]。JONITZ  等^[12]通过体外分离及培养人体软骨细胞研究发现胰岛素样生长因子1和转化生长因子β1可以影响软骨细胞再分化能力；CHEN等^[13]研究发现胰岛素样生长因子1具有促进软骨细胞增殖的能力。YÜCE等^[14]将改良型富血小板纤维蛋白凝胶应用于第三磨牙拔除术后牙槽骨炎的创面修复发现，改良型富血小板纤维蛋白可明显促进牙周软硬组织的愈合，同时可以减轻患者术后疼痛。因此如果将改良型富血小板纤维蛋白制成膜后包裹颗粒软骨是否可以在促进颗粒软骨存活的同时又起到包裹作用以达到对移植物塑形的效果？

目前已经明确了改良型富血小板纤维蛋白的制备和组成成分，并有相关实验证实改良型富血小板纤维蛋白具有促进软硬组织再生的作用^[15-17]，但国内外均无其联合颗粒软骨移植应用的长期实验研究。因此实验拟制备改良型富血小板纤维蛋白膜，用其包裹颗粒软骨建立颗粒软骨移植模型，对比改良型富血小板纤维蛋白膜和自体筋膜包裹颗粒软骨移植后移植物的组织学变化，观察改良型富血小板纤维蛋白对颗粒软骨移植的影响，为临床应用改良型富血小板纤维蛋白膜联合颗粒软骨移植用于鼻整形术提供参考。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  同体对照动物实验。

1.2  时间及地点  于2018年9月至2019年4个月在湖北医药学院实验动物中心及病理教研室完成。

1.3  材料  3月龄新西兰雄兔12只，平均体质量3 kg，动物使用许可证：SYXK(鄂)2016-0031，由湖北医药学院实验动物中心提供饲养及管理，自然昼夜光照条件下，单笼、全价颗粒饲料喂养，术前1周进行适应性喂养，以确认动物健康。

实验中所有对动物的处置均符合湖北医药学院实验动物伦理委员会要求，伦理批准号：2018-125，审查时间：2018-11-15。

1.4  实验方法

1.4.1  改良型自体富血小板纤维蛋白膜制备  兔术前禁食水8 h，保定盒固定，体积分数75%乙醇消毒兔左耳背侧，用一次性采血针和10 mL不含任何试剂的真空无菌采血管于兔耳中动脉处采血10 mL，采用GHANAATI等^[8]的方法将采血管迅速置于低速离心机(Eppendorf 5810R，德国)离心，1 500 r/min，14 min。后用无菌镊取出管中凝胶状改良型富血小板纤维蛋白凝胶，手术刀片切除多余红细胞层，于纱块上压制膜状后备用，见图1。

1.4.2  麻醉及术前准备  保定盒固定实验兔，经耳缘静脉注射体积分数3%戊巴比妥钠1 mL/kg。麻醉成功后用电动剃毛器对兔背部和左侧大腿外侧毛发进行剃除，碘伏及体积分数75%乙醇清洗消毒兔左耳、背部术区及左侧大腿外侧，记号笔标记：左耳软骨供区(1 cm×3 cm)、左大腿外侧切口2 cm、背部3个纵行切口1 cm(间距5 cm)。

1.4.2  软骨制备和筋膜切取  耳软骨供区皮下注射局麻药(5 mL利多卡因+1∶20 000肾上腺素)，沿切口线切开皮肤，钝性分离皮下组织，切取耳软骨1 cm×3 cm，均分为3等份并用11号手术刀片切成3等份颗粒软骨备用，见图2；皮肤切口用7-0丝线间断缝合。采用11号刀片沿切口线切开大腿皮肤，钝性分离后切取1 cm×2 cm大小的筋膜。皮肤切口用6-0丝线缝合，见图2。

1.4.3  软骨移植物制备及取材  制备3种移植物：A：单纯颗粒软骨；B：自体筋膜包裹颗粒软骨，将切取的筋膜组织适当修剪约1 cm×2 cm大小，将筋膜组织垂直于1 mL注射器长轴上平铺，7-0可吸收性缝线间断缝合注射器体部的两侧筋膜端，将卷筒状筋膜向前推至注射器口处，间断缝合一侧漏口，将一份颗粒软骨从另一侧开放漏口放置其中，最后间断缝合开放漏口即可；C：改良型富血小板纤维蛋白膜包裹颗粒软骨，将压制好的改良型富血小板纤维蛋白膜适当修剪为1 cm×2 cm大小，同上法缝合成圆筒状后闭合一端漏口，从另一端漏口置入一份软骨颗粒，缝合漏口，检查有无漏针，若有间断补针，见图3。在兔背部中线上从头侧至尾侧分别做切口A，B，C，分离皮下腔隙(每个腔隙间隔5 cm)，分别将移植物A，B，C经切口A，B，C置入对应的腔隙内后缝合伤口。每只兔均接受相同手术流程，手术过程严格无菌操作。术后4个月取出A，B，C种软骨移植物进行一般形态观察和组织病理学检查。

1.5  主要观察指标

1.5.1  一般形态观察  观察软骨移植物术前和术后4个月的形态变化、皮下粘连情况、质地软硬、是否有包膜，游标卡尺测量移植物厚度、记录术后切口愈合时间。

1.5.2  切片制备及染色  将取出的移植物标本用体积分数10%甲醛溶液固定，并进行脱钙，石蜡包埋切片后分别进行苏木精-伊红染色(北京Solarbio公司)、Masson三色染色(武汉Bioswamp公司)、胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色(美国Abcam公司)。利用KIM等^[18]软骨移植物组织学评估方法分别从软骨存活率、纤维化、炎症反应、血管化程度、胶原纤维及再生潜力6个方面进行评价。数码摄像显微镜观察(日本Olympus公司)每张组织切片在10倍物镜下随机选取5个视野观察并拍照，以含有核软骨细胞占总软骨细胞百分比计算移植物存活率。

通过图像分析软件(Image-Pro Plus 6.0，美国Media Cybernetics公司)观察并定量分析每张图片视野下纤维化、炎症反应、血管化程度、胶原纤维含量、再生潜力等情况。记录每个标本各参数的平均值并进行等级评价：0-25%为1+，26%-50%为2+，51%-75%为3+，75%以上为4+，其中1+记为1分，2+记为2分，3+记为3分，4+记为4分。

1.6  统计学分析  应用SPSS 22.0软件进行数据统计分析。计量资料以x(_)±s表示，多组间数据差异通过单因素方差分析和SNK-q 检验进行统计学分析。组织学参数等计数资料以百分比表示，通过Kruskal-Wallis H 检验和Nemenyi法检验进行分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

软骨组织在整形外科中应用广泛，是一种不可或缺的自体移植材料^[19]，其中颗粒软骨由于制备简单、无排异反应、灵活多变，在鞍鼻畸形、驼峰鼻矫正术后鼻梁凹凸畸形、鼻翼基底填充等矫形手术中取得了良好的手术效果^[20-23]。但是随着生活水平的提高和技术的发展，人们对于整形手术效果的期望值越来越高，单纯应用颗粒软骨移植由于术后软骨吸收明显、塑形效果有限导致术后颗粒软移植受区形态仍不够理想^[24-25]。

为了提高颗粒软骨存活率和移植物的塑形效果，学者们开始使用各种自体或异体材料包裹颗粒软骨进行移植。自从EROL等^[26]首次使用氧化再生纤维素包裹软骨颗粒移植用于鼻整形术以来，包裹颗粒软骨移植技术经历了20余年的发展，包裹介质也有了众多的选择，目前主要有：自体筋膜、异体脱细胞真皮和氧化再生纤维素等。YILMAZ等^[27]分析认为，使用氧化再生纤维素包裹颗粒软骨移植后阻断了软骨组织的营养供给，从而导致了移植后软骨细胞再生能力的丧失。BRENNER等^[28]通过对比研究氧化再生纤维素和颞深筋膜包裹颗粒软骨移植发现2种移植物在软骨细胞存活率方面无统计学差异，但是筋膜包裹的移植物整体轮廓更加圆滑平整。然而，在切取自体筋膜时会增加机体创伤同时导致供体部位的瘢痕，延长手术时间，增加了患者的费用负担^[29-30]。因此寻找一种能够弥补自体筋膜的缺陷，而又能综合其优点的包裹介质就显得极有意义。

GHANAATI等^[8]于2014年通过降低离心速度、延长离心时间对静脉血进行离心后制备了第三代血小板制品：改良型富血小板纤维蛋白。与上一代的富血小板纤维蛋白相比，等量的静脉血可以制备更大体积的改良型富血小板纤维蛋白，而且改良型整体网状纤维结构更加疏松，营养物质更容易扩散，同时富有更多的血小板及各种生长因子^[31]，因此，实验推断改良型富血小板纤维蛋白可能更具有诱导软硬组织修复与再生的能力。焦立志等^[32]通过兔动物实验发现改良型富血小板纤维蛋白具有诱导新生骨的能力。CAYMAZ等^[33]将改良型富血小板纤维蛋白凝胶置于第三磨牙拔出术后创面发现其不仅可以促进创面愈合，亦可减轻术后疼痛，提高患者舒适度。多位学者研究表明，改良型富血小板纤维蛋白可以促进软骨细胞的分化增殖、诱导骨细胞再生及骨化形     成^[34-35]。预实验中发现，改良型富血小板纤维蛋白凝胶具有良好的柔韧性，可通过适当挤压形成改良型富血小板纤维蛋白膜，其厚度类似于自体筋膜，可反折缝合成口袋状包裹颗粒软骨移植使用。经验发现在制备过程中，务必在30 s内将采集完毕的静脉血进行离心操作，以此可以制备更多的改良型富血小板纤维蛋白。查阅文献发现目前暂无改良型富血小板纤维蛋白联合颗粒软骨移植的相关实验研究，因此实验首次将改良型富血小板纤维蛋白膜作为包裹介质联合自体筋膜建立颗粒软骨移植模型，研究改良型富血小板纤维蛋白膜对颗粒软骨移植的影响。

已有研究指出改良型富血小板纤维蛋白所含的生长因子和细胞因子可以促进血管新生和组织细胞增殖迁移，促进受损部位组织的修复愈合。一般形态观察中实验发现，自体筋膜和改良型富血小板纤维蛋白膜包裹颗粒软骨移植，术后移植物外形更圆润，移植物平均厚度均在3 mm以上，可以满足常规隆鼻术对鼻梁高度的调整需求，提高了颗粒软骨移植的塑形效果。有研究显示，改良型富血小板纤维蛋白膜在体内4周开始液化，8周时已与周围组织完全融合难以辨认，完全降解的时间为一两个月。在此期间改良型富血小板纤维蛋白膜可以作为细胞支架为颗粒软骨在受区建立营养供给及代谢提供一个良好的环境。实验还发现，兔背部切口C在愈合速度方面明显优于切口A，B，分析主要是由于改良型富血小板纤维蛋白内的血管内皮生长因子、白细胞相关因子加速了切口附近的血供恢复，同时介导相关免疫反应，发挥抗炎的作用，说明改良型富血小板纤维蛋白膜对创面愈合有一定帮助。

缺乏血供和局部炎症反应是移植后的颗粒软骨吸收的主要原因。实验发现，在存活率方面，与改良型富血小板纤维蛋白膜包裹颗粒软骨移植物相比，自体筋膜包裹颗粒软骨移植物的存活率较低，通过分析考虑主要是因为筋膜包裹颗粒软骨移植后较长时间阻断了移植物的血液供应，颗粒软骨在一个相对封闭的环境中缺血缺氧导致了存活率降低。而改良型富血小板纤维蛋白疏松的纤维网状结构可以为血管内皮生长因子提供细胞支架促进新生血管的生成从而尽早恢复移植物周边的血供，其内富含的血小板能释放凝血因子、P-选择素、纤维连接蛋白、血管内皮生长因子、血小板源性内皮生长因子和纤维蛋白原等分子，在这些不同的生长因子、黏附分子和其他介质的作用下，血小板能通过影响中性粒细胞、单核细胞、内皮细胞以及淋巴细胞来启动和调节宿主的免疫应答促进了组织的修复与再生。在炎症反应、纤维化、血管化及胶原纤维含量方面3种移植物镜下未观察到显著差异。实验的免疫组织化学染色结果中，胞质内的棕色沉积为阳性表达，反映了软骨细胞的再生潜力。实验结果可见，改良型富血小板纤维蛋白包裹颗粒软骨移植物组染色切片的阳性表达明显多于颗粒软骨组和筋膜包裹颗粒软骨移植组。也有学者研究富血小板纤维蛋白对软骨缺损修复的影响发现富血小板纤维蛋白可以提高软骨细胞的再生潜力，并有效促进软骨细胞的再生与修复。

结合以上分析讨论，改良型富血小板纤维蛋白膜包裹颗粒软骨移植物远期形态类似于自体筋膜包裹颗粒软骨移植物，但在厚度上较筋膜包裹颗粒软骨移植物稍薄，表明改良型富血小板纤维蛋白膜拥有与自体筋膜类似的包裹性能，在起到聚合颗粒软骨的同时，也可通过其特有的纤维网状结构及各种生长因子为颗粒软骨的存活提供一个良好的外界环境。改良型富血小板纤维蛋白组中颗粒软骨存活率优于另外两组，但在术后远期的移植物切片中，此3种移植物在炎症、纤维化、血管化及胶原纤维含量方面无显著差异，提示自体血制备的改良型富血小板纤维蛋白膜植入体内后具有较好的生物相容性。实验通过建立兔颗粒软骨移植模型对移植物进行远期的观察和组织学检测，客观反映了改良型富血小板纤维蛋白膜对颗粒软骨移植的促进作用。

实验因经费、时间有限，动物数量样本较小，时间节点不充足，导致统计结果可能有偏差；动物之间的个体差异及应激反应有可能影响实验结果；经费、时间充足的条件下可于纳入更多实验动物进一步对比研究术后中长期移植物组织学变化，以模拟推测颗粒软骨移植隆鼻术后的形态变化过程。

实验表明，改良型富血小板纤维蛋白对软骨移植的存活率有显著的益处，应用改良型富血小板纤维蛋白膜作为包裹材料包裹颗粒软骨较为实用，作为一种自体生物材料，暂未发现改良型富血小板纤维蛋白对颗粒软骨移植和受区产生任何负面效应。未来实验计划进行一项临床研究来验证改良型富血小板纤维蛋白膜包裹软骨颗粒移植用于鼻整形的临床实际效果。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

改良型富血小板纤维蛋白膜：是第二代富血小板浓缩制品富血小板纤维蛋白通过低速延时的方法得到的改良型富血小板纤维蛋白凝胶，再经过压制后得到的一种具有一定韧性的膜状物，可起到包裹作用，有利于细胞的增殖分化。

颗粒软骨移植：将自体软骨切成1.0-2.0 mm的颗粒状后移植于受区，但术后远期存在移植物吸收、变形等风险，目前国内外关于有效减少颗粒软骨移植后并发症等风险的报道仍然较少。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

应用改良型富血小板纤维蛋白膜作为包裹材料对短期内稳定的包裹颗粒软骨是很实用的，作为一种自体生物材料，暂未发现改良型富血小板纤维蛋白对颗粒软骨移植和受区产生任何负面效应。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程