2.1  退火处理对材料表面形貌的影响  各组试样表面形貌的扫描电镜观察：抛光试样在较低放大倍数时可见抛光划痕，5，20 V阳极氧化电压制备出管径分别为30，100 nm的TiO₂纳米管(图1)，退火处理对钛表面纳米管形貌及管径无明显影响。

2.2  退火处理对材料表面成纤维细胞黏附的影响  各组试样表面成纤维细胞的黏附数目，见图2。

60 min时，抛光纯钛组与退火处理抛光纯钛组的黏附成纤维细胞数分别为520.78±11.56和590.67±13.18，两组间比较差异有显著性意义(P < 0.01)；120 min时，抛光纯钛组与退火处理抛光纯钛组的黏附细胞数分别为633.00± 17.79和705.45±16.08，两组间比较差异有显著性意义(P < 0.01)。两个时间点，退火处理抛光纯钛表面黏附细胞数较退火处理前分别增加了13.42%和11.44%，退火处理促进了抛光纯钛表面成纤维细胞的黏附。

60 min时，5，20 V纳米管组黏附细胞数分别为 388.33±14.31和433.78±15.64，退火处理5，20 V纳米管组黏附细胞数分别为368.54±13.43和399.00±14.83，5，20 V纳米管退火后的黏附细胞数均少于退火前(P < 0.01)。   120 min时，5，20 V纳米管组成纤维细胞数分别为489.33±14.94和579.67±14.45，退火处理5，20 V纳米管组黏附细胞数分别为466.56±17.93和543.00±15.58，5，20 V纳米管退火后的黏附细胞数均少于退火前(P < 0.01)。退火处理抑制了钛纳米管表面成纤维细胞的黏附。60，120 min时，退火处理5 V纳米管组组黏附细胞数为各组中最少。

相同时间点下，5，20 V纳米管组黏附细胞数少于抛光纯钛组(P < 0.01)。

2.3  退火处理对材料表面成纤维细胞伸展形态的影响  培养1 d时各组试样表面成纤维细胞伸展形态，见图3。未行退火处理抛光纯钛表面的成纤维细胞多数呈现出典型长梭形，退火处理抛光纯钛表面的细胞呈现出更明显的板状伪足；与退火处理的纳米管相比，未行退火处理各纳米管表面的细胞伸展较宽，充满大量细胞质，板状伪足和丝状伪足更明显，呈现较强的细胞生物活性。

2.4  退火处理对材料表面成纤维细胞增殖的影响  各组试样表面1，3，5 d时成纤维细胞增殖情况，如图4所示。1，3，5 d时，退火处理抛光纯钛组A_{490 nm}分别为0.44±0.02，0.70±0.02和1.14±0.03，均显著高于同时间点其余各组  (P < 0.01)，说明退火处理促进了抛光纯钛表面成纤维细胞的增殖。

1，3，5 d时，退火处理5 V纳米管组A_{490 nm}分别为0.24±0.01，0.52±0.02，0.77±0.01，均低于同时间点5 V纳米管组的0.25±0.01，0.53±0.01，0.91±0.01，且均低于同时间点其余各组，其中3，5 d时这种差异有显著性意义(P < 0.01)；退火处理20 V纳米管组A_{490 nm}分别为0.28±0.01，0.58±0.02，0.91±0.01，均显著低于同时间点20 V纳米管组的0.29±0.01，0.62±0.01，0.97±0.01(P < 0.01)，说明退火处理抑制了TiO₂纳米管表面成纤维细胞的增殖。与抛光纯钛相比，TiO₂纳米管不同程度抑制了成纤维细胞的增殖，退火处理协同增强了这种抑制作用。

2.5  退火处理对材料表面成纤维细胞胶原分泌功能的影响  细胞培养3 d后各组试样表面成纤维细胞胶原纤维天狼星红/苦味酸液染色结果，见图5。抛光纯钛组表面染色较浅，20 V纳米管组表面染色最深。

各组试样表面成纤维细胞的相对胶原分泌功能，见图6。细胞培养3 d后，退火处理抛光纯钛组细胞的相对胶原分泌为0.35±0.04，显著高于抛光纯钛组的0.29±0.01(P < 0.01)，说明退火处理提高了抛光纯钛表面成纤维细胞的相对胶原分泌功能。退火处理5，20 V纳米管组细胞的相对胶原分泌分别为0.35±0.02和0.53±0.02，5，20 V纳米管组分别为0.54±0.01和0.75±0.02，退火处理各组的相对胶原分泌均低于对应的未退火处理组(P < 0.01)，说明退火处理抑制了纳米管表面成纤维细胞的相对胶原分泌功能。抛光纯钛组的相对胶原分泌功能显著低于5，20 V纳米管组(P < 0.01)，说明纳米管不同程度促进了成纤维细胞的胶原分泌功能。抛光纯钛组的相对胶原分泌功能最小(P < 0.01)，20 V纳米管组的相对胶原分泌功能最大(P < 0.01)。

钛表面纳米管可促进体外骨改建相关细胞的黏附、增殖和成骨分化及体内种植体骨整合，显示出在种植材料领域的应用前景。形貌、晶型、化学组分等理化特征均可对钛表面纳米管表面的组织细胞产生影响^[1-2]。同时钛纳米管也可作为一种药物载体，便于实现药物的长期稳定缓慢释放。退火处理的温度不同形成的TiO₂晶型不同，但不改变其纳米管的结构^[3-5]。大量研究表明，退火处理形成的锐钛矿钛纳米管可促进成骨相关细胞的黏附、增殖和成骨分化^[6-11]，有利于种植体周围骨的形成，作为种植体表面优化处理技术得到学者的广泛关注。种植体作为一种特殊的穿龈结构，与口腔组织接触有两种截然不同的界面，即种植体根部的种植体骨组织界面与种植体颈部的种植体软组织界面，这两种不同界面对种植体表面的形貌及理化性能要求也不同。种植体颈部的表面处理对实现种植体颈部良好的软组织封闭至关重要，也显著影响种植体的长期使用寿命。

近年来关于种植体颈部表面的优化处理成为研究热 点^[12-18]。成纤维细胞是种植体颈部软组织的重要组成细胞之一，研究种植体颈部材料表面优化处理，可通过研究材料表面成纤维细胞的生物学行为来进行评估。研究显示与粗糙的钛表面相比，光滑钛表面更有利于成纤维细胞的生长，同时又相对减少口腔细菌的附着，有利于种植体颈部的软组织长期健康稳定。相对于机械抛光的纯钛表面，阳极氧化形成TiO₂纳米管结构的表面粗糙度更小，亲水性也更好^[19]，同时纳米管的管状结构可加载抗菌药物等。退火处理TiO₂纳米管可能更有利于成纤维细胞的黏附和增殖，有利于实现种植体颈部软组织长期稳定的屏障作用。目前退火处理TiO₂纳米管对种植体颈部软组织细胞的影响却鲜有报道。课题前期研究不同管径纳米管对小鼠成纤维细胞L-929影响结果显示，不同管径钛纳米管对植体表面细胞的黏附和生长的影响不同^[20-21]。实验选择5，20 V阳极氧化电压下制备TiO₂纳米管并进行退火处理，观察退火处理前后TiO₂纳米管对成纤维细胞黏附、伸展、增殖和胶原纤维分泌的影响，筛选有利于成纤维细胞生长的TiO₂纳米管环境，为种植体颈部表面优化处理提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  细胞分子生物学体外实验。

1.2  时间及地点  实验于2014年10月至2015年6月在空军军医大学组织工程研发中心实验室完成。

1.3  材料  医用纯钛板材(TA2，西北有色金属研究院，见表1)；小鼠成纤维细胞L-929系(空军军医大学组织工程研发中心提供)；达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM)；赫斯特荧光染料33342(Hoechst33342，碧云天)；正置荧光显微镜(LEICA DMI6000B，德国)；S-4800场发射扫描电子显微镜(Hitachi，日本)；马费炉A-1750(Neytech，美国)。

1.4  实验方法

1.4.1  试样制备与分组  将10 mm×10 mm×1 mm纯钛试样经碳化硅砂纸打磨至1 500目，丙酮、体积分数95%乙醇及双蒸水超声清洗，自然干燥后备用。以钛试样为阳极、铂片为阴极，在1 mol/L磷酸和质量百分比为0.3%的氢氟酸电解液中，控制电压分别为5 V和20 V，常温反应1 h，制备5，20 V纳米管试样。将试样放入马弗炉中进行450 ℃维持2 h的退火处理。试样共分为6组：抛光纯钛组、5 V纳米管组、20 V纳米管组、退火处理抛光纯钛组、退火处理   5 V纳米管组、退火处理20 V纳米管组，每组12个试样。

1.4.2  试样表面形貌分析  每组试样各任取1个，超声清洗后真空干燥，场发射扫描电子显微镜分析试样表面形貌。

1.4.3  细胞培养  将成纤维细胞L-929培养于含体积分数10%胎牛血清、1%抗生素(青霉素和链霉素)的DMEM培养基中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂细胞培养箱中，隔天换液1次，细胞层生长至70%-80%时传代。

1.4.4  细胞黏附计数  将6组试样经⁶⁰Co辐照消毒后置入24孔培养板内(每组9个试样，每孔1个试样)，将成纤维细胞L-929以1×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于该24孔板，每孔   1 mL，置于37 ℃、体积分数5%CO₂细胞培养箱中培养。60，120 min后每组各取3孔终止细胞培养，PBS漂洗3次，40 g/L多聚甲醛固定，Hoechst 33342染色后在荧光显微镜下任选5个视野拍照，利用ImageJ软件进行计数。

1.4.5  细胞形态  试样放置同上。将成纤维细胞L-929细胞以2×10⁷ L^-1的细胞浓度接种于各组试样表面，每孔1 mL。细胞培养1 d后，每组取2个试样，PBS清洗3遍，2.5%戊二醛4 ℃24 h，之后梯度乙醇(体积分数50%，70%，80%，90%和100%)脱水，临界点干燥法干燥后喷金，扫描电镜观察细胞形态。

1.4.6  细胞增殖  试样放置和细胞接种同1.4.5。细胞培养1，3，5 d后，每组各取3孔终止细胞培养，PBS清洗3次，每孔加入MTT(5 g/L) 200 μL和无血清无酚红DMEM   800 μL，37 ℃孵育4 h后吸弃上清，加入DMSO(1 mL/孔)溶解生成的结晶物，每孔分别取3份200 μL溶解液转移至96孔培养板，空白孔调零，测490 nm处测其吸光度A值。

1.4.7  胶原分泌功能  试样放置和细胞接种同1.4.5。细胞培养3 d后，每组取6个试件，PBS漂洗3次，40 g/L多聚甲醛固定过夜，PBS漂洗3次，室温下1%天狼星红/苦味酸液染色2 h，0.1 mol/L醋酸轻轻漂洗，室内自然干燥后备用。量化分析，每孔加入500 mL/孔去染液(0.2 mol/L NaOH溶液和99%甲醇按体积比1∶1混合配制)，室温静置30 min，每孔取3份150 μL染液分别转移到96孔培养板，空白孔加入150 μL去染液，空白孔调零，540 nm处测量其吸光度A值。结果用3 d时细胞增殖A_{490 nm}值进行标准化。

1.5  主要观察指标  各组试样表面的细胞形态、黏附、增殖及胶原分泌功能。

1.6  统计学分析  采用SPSS 17.0统计软件包，对同时间点不同组试件表面黏附的细胞数目进行双因素方差分析和Student-Newman-Keuls(SNK)两两比较，检验水准为0.05。

       实验结果表明，退火处理对钛表面TiO₂纳米管形貌及管径无明显影响。与抛光纯钛相比，退火处理促进了抛光纯钛表面成纤维细胞的黏附、增殖、伸展和相对胶原分泌功能。与抛光纯钛相比，TiO₂纳米管不同程度抑制了成纤维细胞的黏附、增殖和伸展，退火处理则协同增强了这种抑制作用；TiO₂纳米管显著增强了成纤维细胞的相对胶原分泌功能，退火处理减弱了这种增强作用。

钛种植体表面经阳极氧化形成的钛纳米管结构特殊、尺寸可控，受到国内外研究者的广泛关注。实验采用在5，20 V电压下阳极氧化形成了直径分别为约30，100 nm的TiO₂纳米管。钛纳米管的特殊形貌、尺寸大小、晶型结构、表面化学组分等理化特性可影响其周围组织细胞的生长^[1，2，9]，同时这些表面理化特性可通过其制备要素来进行精确控制。退火处理的温度、时间和空气环境均可影响钛纳米管表面的TiO₂晶型^[22-23]，进而对钛纳米管表面组织细胞产生影响。TiO₂有3种不同的晶型结构—非晶态、锐钛型和金红石型。常温下空气中阳极氧化制备的TiO₂纳米管为非晶态，空气中450 ℃退火处理后由非晶型结构变为锐钛型，表面纳米管结构特征基本上没有变化，但氟含量减少^[6，24-25]。实验采用空气中450 ℃维持2 h的退火处理，保持了原有纳米管的结构和管径大小。有研究报道退火不改变纳米管的管状结构，但纳米管管壁的厚度有增加^[3]，也有研究报道高温退火处理除了增加纳米管管壁厚度外，还会减少纳米管管径和管长^[5]。退火处理作为纳米管形成之后的后续处理方式，影响了纳米管表面晶型、亲水性及耐腐蚀性等理化特性，进而可进一步影响其生物学活性。450 ℃退火处理形成的锐钛矿TiO₂纳米管，最大程度地提高了血小板的黏附和活性^[3，26]，也有文献报道锐钛矿相的TiO₂对羟基磷灰石沉积具有最好诱导作用^[5，27]，这些都说明退火处理形成的锐钛型TiO₂纳米管具有良好的生物活性。空气中450 ℃维持2 h的退火处理使得抛光纯钛表面也形成了一薄层锐钛型TiO₂薄膜，可影响其表面生物学性能。

TiO₂纳米管因其管状结构可加载抗炎药物及生物因子并在体内缓慢释放^[28-30]，为临床种植体周围炎的防治提供了新方法，成为种植体颈部的优化设计的新思路。钛纳米管对种植体颈部周围软组织的影响近年来也成为研究的重点。体内外研究显示，退火处理形成的锐钛矿TiO₂纳米管表现出更佳的诱导羟基磷灰石沉积和成骨特性^{[6-10，31-34]}，而退火处理钛纳米管对种植体周围软组织细胞的影响鲜有报道。种植体颈部周围软组织封闭对种植体长期有效使用具有至关重要的作用，而成纤维细胞作为种植体周围软组织的重要组成细胞，其在材料表面的生物学行为研究是评价种植体材料性能的重要方面。目前，尚无关于退火处理前后钛纳米管对成纤维细胞生物活性影响的研究报道。实验对退火处理前后的纳米管及抛光纯钛进行表面形貌观察，发现退火处理未改变纳米管的管状结构。实验观察退火处理前后TiO₂纳米管及抛光纯钛对成纤维细胞黏附、伸展、增殖和胶原分泌功能的影响，结果发现退火处理抑制纳米管表面成纤维细胞的黏附、伸展、增殖和相对胶原分泌功能；退火处理促进了抛光纯钛表面细胞的黏附、伸展、增殖和胶原分泌功能。室温下制备的抛光纯钛和钛纳米管表面均为无定型的TiO₂，退火处理后表面TiO₂晶型均转变为锐钛矿，但二者的表面形貌结构、电荷及化学组分等有很大差异，退火处理对钛纳米管和抛光纯钛生物学效应的影响不同可能与这些差异有关。

课题前期研究表明，纳米管不同程度抑制了成纤维细胞的黏附、伸展和增殖。实验结果显示60，120 min时，退火处理20 V纳米管表面的细胞黏附数较未行退火处理的20 V纳米管表面减少，但还是比同时间点未退火处理的5 V纳米管表面细胞黏附数要多；退火处理20 V纳米管表面的细胞的A_{490 nm}值减少，但还是比同时间点未退火处理的5 V纳米管表面细胞增殖A_{490 nm}值要高。这说明退火处理不同管径TiO₂纳米管均对其表面成纤维细胞的行为有抑制作用，但这种抑制作用并不能改变或者遮掩纳米管管径对细胞行为的影响。这提示在纳米管对成纤维细胞行为的影响上，TiO₂晶型是次于纳米管管径的影响因素。锐钛矿TiO₂比其他晶型如金红石相更有利于骨骼生长，可能是由于与羟基磷灰石较好的晶格匹配^[4，6，27]。退火处理改变了钛纳米管表面TiO₂晶型，同时也影响了钛纳米管表面亲水性及化学键和表面电荷等^{[9，31，35]}。有研究指出退火处理TiO₂纳米管表面氟含量降低，纳米管的管壁厚度也受到影响，进而会影响退火处理TiO₂纳米管的生物学性能^[3，8-9]。退火处理前后TiO₂纳米管对成纤维细胞行为影响的改变，晶型毫无疑问是其重要影响因素，具体机制尚不清楚。退火处理TiO₂纳米管后，表面由无定型TiO₂转变为锐钛矿，晶型结构的改变是引起TiO₂纳米管生物学性能改变的主要因素。另外，表面氟含量^{[6，8，25，28]}、亲水性^{[9，11，35]}、Ti-OH的变化^[31]，也可能是引起退火处理纳米管抑制成纤维细胞活性的原因。这些可能是导致实验中退火处理前后钛纳米管表面成纤维细胞行为改变的因素。

与抛光纯钛相比，TiO₂纳米管形貌不同程度抑制了成纤维细胞的黏附、伸展和增殖；与未行退火处理的TiO₂纳米管相比，450 ℃退火处理TiO₂纳米管抑制成纤维细胞的黏附、伸展、增殖和胶原分泌。实验结果进一步表明，纳米管形貌为影响TiO₂纳米管表面细胞生物学行为的主要因素，而晶型结构为影响TiO₂纳米管表面细胞生物学行为的另一重要独立因素。有研究认为纳米管可促进成纤维细胞的黏附和增 殖^[18]，可能与其采用的钛合金材料有关，而此次实验采用了纯钛材料。PARK等^[25]的研究认为影响纳米管表面内皮细胞反应的主要是纳米管管径，而晶型没有明显影响，与此次实验结果不一致，可能与所选择的细胞类型不同有关。有研究认为TiO₂纳米管的晶型是血小板黏附和活性的主要影响因素^[3]，退火处理形成的TiO₂晶型可影响人类神经胶质瘤和骨肉瘤细胞^[36]、骨膜源型细胞^[37]、成骨细胞的生物学行为^[6，8]，TiO₂晶型对不同组织类型细胞产生不同的生物学效应，这也是不同组织细胞特异性的一方面。与抛光纯钛相比，退火处理促进了抛光纯钛表面成纤维细胞的黏附、增殖、伸展和相对胶原分泌功能。提示在对种植体颈部表面优化处理时，机械抛光表面可能更有利于成纤维细胞的生长，对机械抛光表面进一步行退火处理可促进成纤维细胞的生长和胶原分泌，更有利于形成种植体颈部的软组织封闭；若需设计钛纳米管形貌加载药物，不进行退火处理更有利于成纤维细胞的黏附、伸展、增殖和胶原分泌。

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文题释义：

TiO₂纳米管阵列：利用阳极氧化方法在纯钛板表面生成的一薄层TiO₂结构。即以钛或钛合金为阴极以铂片为阳极，在含氟电解液中通过电化学方法产生的自组装TiO₂纳米管层，可通过控制阳极氧化的电压来精确控制纳米管的管径，阳极氧化的时间会影响纳米管的长度。与光滑的钛表面相比，TiO₂纳米管显著增大了表面积，提高了材料的亲水性和表面能，增加了对纤维粘连蛋白和玻璃粘连蛋白等胞外蛋白大分子的吸附，同时纳米管状结构具有加载药物和生物因子等潜能。

退火处理：退火是一种金属热处理工艺，即将金属缓慢加热到一定温度保持足够的时间，然后以适宜速度冷却。TiO₂存在3种不同的晶型结构：非晶态、锐钛矿和金红石相态。常温制备的TiO₂纳米管为非晶态，经过退火处理，控制退火处理的温度，TiO₂晶型结构转变为锐钛矿或金红石。一般情况下，400-600 ℃的退火可形成锐钛矿，600-750 ℃的退火可形成金红石相。

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通过实验观察分析退火处理不同管径钛纳米管及抛光纯钛对成纤维细胞生物学行为的影响，结果表明TiO₂纳米管不同程度地抑制成纤维细胞的黏附、伸展和增殖，退火处理可增强这种抑制作用；TiO₂纳米管不同程度增强成纤维细胞的胶原分泌功能，退火处理抑制了这种增强效果。退火处理抛光纯钛及钛纳米管对其表面的理化特性和生物性能的影响不同，为种植体颈部的退火处理提供理论依据。

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