咪喹莫特抑制病理性瘢痕成纤维细胞迁移及作用靶点的相关机制

doi:10.12307/2022.616

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (20): 3173-3177.doi: 10.12307/2022.616

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咪喹莫特抑制病理性瘢痕成纤维细胞迁移及作用靶点的相关机制

王瑞1，吕涛1，霍晶1，刘振东1，2，宋建波1

1德州市人民医院，山东省德州市 253000；2扬州大学临床医学院/苏北人民医院，江苏省扬州市 225001

收稿日期:2021-03-29 修回日期:2021-04-02 接受日期:2021-05-20 出版日期:2022-07-18 发布日期:2022-01-19
通讯作者: 刘振东，博士，主治医师，德州市人民医院，山东省德州市 253000；扬州大学临床医学院/苏北人民医院，江苏省扬州市 225001 宋建波，硕士，副主任医师，德州市人民医院皮肤性病科，山东省德州市 253000
作者简介:王瑞，女，1986年生，山东省德州市人，汉族，2013年中国医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事皮肤美容相关研究。
基金资助:
山东省医药卫生科技发展计划面上项目(202004121375) ，项目负责人：王瑞；山东省医药卫生科技发展计划面上项目(2019WS017) ，项目负责人：吕涛

Mechanism by which imiquimod inhibits the migration of fibroblasts in pathological scars and its targets

Wang Rui1, Lyu Tao1, Huo Jing1, Liu Zhendong1, 2, Song Jianbo1

1Dezhou People’s Hospital, Dezhou 253000, Shandong Province, China; 2Clinical School of Yangzhou University/Subei People’s Hospital, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China

Received:2021-03-29 Revised:2021-04-02 Accepted:2021-05-20 Online:2022-07-18 Published:2022-01-19
Contact: Liu Zhendong, MD, Attending physician, Dezhou People’s Hospital, Dezhou 253000, Shandong Province, China; Clinical School of Yangzhou University/Subei People’s Hospital, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China Song Jianbo, Master, Associate chief physician, Dezhou People’s Hospital, Dezhou 253000, Shandong Province, China
About author:Wang Rui, Master, Attending physician, Dezhou People’s Hospital, Dezhou 253000, Shandong Province, China
Supported by:
the General Projects of Shandong Provincial Medical and Health Technology Development Plan, Nos. 202004121375 (to WR) and 2019WS017 (to LT)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
咪喹莫特：为咪唑喹啉胺类药物，是一种人工合成的非核苷类异环胺类外用免疫调节剂，可诱导细胞产生多种细胞因子，发挥抗病毒和抗肿瘤活性，广泛用于治疗外生殖器、肛周疣、基底细胞癌等多种皮肤科疾病。
细胞迁移：是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的刺激作用后而产生的移动，细胞迁移是活细胞普遍存在的一种运动形式，涉及到胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、癌症转移等过程。

背景：研究表明咪喹莫特对病理性瘢痕具有一定的防治作用，但其作用靶点及确切机制尚未明确。
目的：探索咪喹莫特作用于病理性瘢痕的靶点基因并进行验证，观察咪喹莫特对瘢痕成纤维细胞迁移能力的影响。
方法：从 GEO 在线数据库中下载并分析数据集，整合筛选出咪喹莫特作用于瘢痕组织的靶点基因。提取瘢痕来源的成纤维细胞，采用划痕实验及 Transwell实验检测咪喹莫特对细胞迁移能力的影响，免疫印迹法检测Ⅰ型胶原及作用靶点PCOLCE的蛋白表达水平。
结果与结论：①通过筛选数据集整合结果，获得2个作用靶点基因，分别为PCOLCE和ARHGEF25；②体外细胞实验结果显示，同对照组相比，咪喹莫特处理组可明显降低细胞划痕愈合率和细胞迁移数目(P < 0.05)，瘢痕成纤维细胞Ⅰ型胶原和PCOLCE的蛋白表达水平也明显下降(P < 0.05)；③结果证实，咪喹莫特抑制瘢痕的作用可能与其下调PCOLCE表达水平、减少细胞外基质以及降低细胞迁移率相关。

https://orcid.org/0000-0001-8002-2733(刘振东)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 咪喹莫特, 病理性瘢痕, 成纤维细胞, 胶原蛋白, 细胞迁移

Abstract: BACKGROUND: Studies have shown that imiquimod has a certain prevention and therapeutic effect on pathological scar, but its target and exact mechanism are not clear yet.
OBJECTIVE: To explore and verify the target genes of imiquimod acting on pathological scar, and to observe the effect of imiquimod on the migration ability of scar fibroblasts.
METHODS: Data sets were downloaded from GEO online database and analyzed to screen out the target genes of imiquimod acting on scar tissue. Scar-derived fibroblasts were extracted. The effect of imiquimod on cell migration was detected by cell scratch test and Transwell test. The expression of type 1 collagen and PCOLCE was detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: By screening the results of data set integration, two target genes, PCOLCE and ARHGEF25, were obtained. The results of cell experiment in vitro showed that compared with the control group, imiquimod treatment group significantly decreased the scratch healing rate and the number of migrated cells (P < 0.05), and the protein expression levels of type I collagen and PCOLCE in scar fibroblasts were also significantly decreased (P < 0.05). The results confirmed that the inhibitory effect of imiquimod on scar may be related to its down-regulation of PCOLCE expression, reduction of extracellular matrix, and reduction of cell migration rate.

Key words: imiquimod, pathological scar, fibroblast, collagen, cell migration

中图分类号:

王瑞, 吕涛, 霍晶, 刘振东, 宋建波. 咪喹莫特抑制病理性瘢痕成纤维细胞迁移及作用靶点的相关机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(20): 3173-3177.

Wang Rui, Lyu Tao, Huo Jing, Liu Zhendong, Song Jianbo. Mechanism by which imiquimod inhibits the migration of fibroblasts in pathological scars and its targets[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(20): 3173-3177.

图/表（结果） 5

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计基因学水平的体外细胞学实验，采用单因素方差分析和F检验进行数据间比较。
1.2 时间及地点于2020年9月至2021年3月在德州市人民医院和扬州大学临床医学院/苏北人民医院医学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 资料来源从 GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中搜索所有咪喹莫特及病理学瘢痕相关的基因芯片数据，分别下载符合实验设计要求的数据集：GSE151153糖皮质激素处理增生性瘢痕与对照未干预组的差异对比；GSE101177咪喹莫特外涂皮肤与对照外涂甘油组皮肤组织的差异对比；GSE92566瘢痕组织与邻近正常皮肤组织的差异对比。
1.3.2 瘢痕成纤维细胞此次研究方法经德州市人民医院医学伦理委员会批准(2021007)。选取德州市人民医院5例手术患者切除的增生性瘢痕组织提取瘢痕成纤维细胞，其中男3例，女2例，年龄19-42岁，实验方法经患者同意并签署“知情同意书”。
1.3.3 主要试剂咪喹莫特(MCE公司，纯度：99.96%，美国)，DMEM培养液、胎牛血清(Gibco公司，美国)，青霉素链霉素混合液、0.25%胰蛋白酶(碧云天生物科技研究所，上海)，PBS(Hyclone公司，美国)，Transwell小室以及细胞培养板(Corning公司，美国)，划痕实验插件(Ibidi公司，德国)，Ⅰ型胶原抗体、PCOLCE抗体(Abcam公司，英国)，β-actin抗体、二抗(爱必信生物科技有限公司，上海)。
1.4 方法
1.4.1 差异基因表达分析通过使用 GEO在线分析工具 GEO2R 分组对比、整合分析并下载数据样本数据进行差异比较，筛选条件为 P < 0.05，|log2FC|≥1。差异结果用火山图进行可视化呈现。然后针对差异基因进一步筛选，选取GSE101177与GSE151153的上调基因和GSE92566的下调基因进行整合，同时GSE101177与GSE151153的下调基因和GSE92566的上调基因进行整合，分别绘制韦恩图。
1.4.2 瘢痕成纤维细胞的分离培养手术室无菌条件下，切取瘢痕组织，修除表皮和皮下组织，盐水反复冲洗后在实验室超净工作台上反复剪切制成0.5-1.0 mm3的组织块，接种于培养瓶壁上，培养箱内培养三四小时后加入含体积分数10%胎牛血清的完全培养基继续培养，每周换液一两次。待原代培养细胞生长基本融合成片时，吸除培养液，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例分瓶传代[14]。此次实验均在第3-5代进行。
1.4.3 细胞划痕实验提前在备用的6孔板内每孔放入3个消毒后的插入元件(Culture-Insert)，每块培养板内实验组与对照组各占3个孔，黏附在培养皿表面后，在每个插件小孔中加入70 μL细胞悬液，37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内过夜。待细胞形成单层融合状态时，轻轻提起插件，PBS冲洗去除死细胞。空白对照组加入新鲜无血清培养基，实验组内加入等量含咪喹莫特的无血清培养基。咪喹莫特干预浓度选用
10 mg/L[15]，分别在划痕后0，12和24 h进行拍照，在每孔划痕中随机选1个，每组各选3个孔，采用Image J软件测量采集图片的划痕面积，创面愈合率计算方法：创面愈合率= (开始划痕面积-时间点划痕面积)/开始划痕面积×100%。
1.4.4 Transwell实验将生长状态良好的瘢痕成纤维细胞进行消化、离心、细胞计数，采用无血清培养基制备成细胞浓度为5.0×108 L-1的细胞悬液，然后在24孔板内的Transwell小室内接种100 μL细胞悬液，咪喹莫特组内加入咪喹莫特使得终质量浓度为10 mg/L，空白对照组加入等量无血清培养基，下室内加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基600 μL，然后在37 ℃和体积分数5%CO2培养箱内分别孵育48 h后取出小室，PBS轻柔洗掉培养基，用棉签轻轻拭去小室内滤膜上层的细胞，然后40 g/L多聚甲醛室温下固定10 min，0.1%的结晶紫染色10 min，PBS轻洗后在倒置显微镜下拍照，随机取3个视野计数着色的迁移细胞数目。
1.4.5 Western Blot印迹检测对生长状态良好的瘢痕成纤维细胞分组进行处理，实验分为4组，分别为空白对照组、咪喹莫特组(加入10 mg/L咪喹莫特)、转化生长因子β1组(加入10 μg/L转化生长因子β1细胞因子)及混合组(加入10 mg/L咪喹莫特+10 μg/L转化生长因子β1)。培养48 h后收集细胞并加入细胞裂解液，冰上裂解10 min，4 ℃离心机12 000 r/min离心10 min后取上清，将得到的细胞总蛋白用BCA法进行蛋白定量，按比例加入5×Loading Buffer，振荡混匀，煮沸5 min使蛋白变性，取60 μg蛋白上样，进行SDS-PAGE电泳(10%分离胶、5%浓缩胶)，湿法转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗Ⅰ型胶原、PCOLCE于4 ℃冰箱过夜。第2天TBST洗涤，加入二抗室温孵育1 h，采用ECL发光液显影，Image J软件扫描条带灰度值，计算各组蛋白与β-actin的灰度比值(相对表达量)。
1.5 主要观察指标 ①咪喹莫特作用于成纤维细胞后对其增殖和细胞迁移的影响；②咪喹莫特作用于成纤维细胞后Ⅰ型胶原和PCOLCE蛋白的表达变化。
1.6 统计学分析采用SPSS 23.0软件对数据进行统计学分析，各组数值以x±s表示，采用单因素方差分析和F检验进行数据间比较，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

伤口愈合过程按时间顺序一般分为炎症阶段、增殖阶段和组织重塑阶段[16]。炎症阶段开始于组织损伤后，一般持续两三天；而增殖阶段发生在组织损伤后两三天，并且可能持续3–6周，活跃的细胞增殖和迁移是该阶段的主要特征，其中成纤维细胞和成肌纤维细胞主要以胶原蛋白的形式产生细胞外基质，这种积累的胶原蛋白形成了最终的大部分瘢痕[17-18]；第三阶段就是在伤口闭合后进行组织的重塑，该阶段的主要特征是降解过度增生的组织，将不成熟的愈合产物转化为成熟形式。增生性瘢痕和瘢痕疙瘩都是纤维增生性疾病，其发生机制一般认为是皮肤创伤愈合过程中，成纤维细胞异常增生、胶原合成分泌和降解失衡紊乱，最终造成伤口皮肤组织异常过度增生，而成纤维细胞是细胞外基质代谢异常的关键效应细胞[19-20]。
咪喹莫特(imiquimod)是一种人工合成的小分子免疫调节剂，目前已在皮肤科用于治疗生殖器尖锐湿疣、日光性角化病以及浅表性基底细胞癌等，随着对其临床研究的不断探索，不少学者将其应用于治疗瘢痕类皮肤疾病[11]。最早报道见于2003年JACOB等[21]认为咪喹莫特是一种快速有效的干扰素有效诱导剂，而干扰素-α2b可减少瘢痕疙瘩切除后的复发，因此尝试应用5%的咪喹莫特乳膏连续每天外涂于瘢痕疙瘩，而后切除标本进行分析，结果显示咪喹莫特可以显著改变瘢痕疙瘩中凋亡标记物的表达。而后STASHOWER[22]和BERMAN等[12]的临床试验对照研究中发现，应用5%的咪喹莫特乳膏治疗瘢痕疙瘩能够有效减少瘢痕疙瘩复发。
DE MESQUITA等[23]通过大鼠背部烧伤模型进行动物实验研究，结果显示短期局部应用咪喹莫特治疗大鼠背部烧伤虽然没有改善临床表现，但是降低了烧伤创面的纤维化，且胶原沉积在不同处理组之间观察到显著差异，结论认为咪喹莫特在大鼠深度烧伤愈合过程中对胶原成熟过程有抑制作用。而国内学者吴霞等[15]及董达科等[24]进行体外细胞实验，通过应用咪喹莫特处理瘢痕成纤维细胞，观察细胞增殖的活性表现，结果均认为咪喹莫特可以有效抑制瘢痕成纤维细胞的增殖活性。上述临床及基础研究均对咪喹莫特在瘢痕中的治疗价值给予肯定，但其中涉及到的分子生物学机制尚未详细阐述，且未对瘢痕成纤维细胞的迁移能力进行相关研究，而细胞迁移对于伤口愈合具有一定的调节作用。异常的成纤维细胞增殖和迁移可能在瘢痕疾病中起重要作用，瘢痕疙瘩成纤维细胞比正常皮肤成纤维细胞的增殖和迁移速率更快[25-27]。
基于此作者设计了此项实验研究，通过分析GEO数据库，进行基因靶点的筛选，将咪喹莫特处理皮肤后的下调基因与瘢痕组织内的上调基因进行交集筛选共同差异基因，同时鉴于激素类作用于瘢痕的明确效果，因此又整合了咪喹莫特与激素类作用的同步下调基因，最终筛选出PCOLCE和ARHGEF25两个基因。为了验证筛选结果，进行了基础实验研究，选择了其中一个基因PCOLCE作为验证目标，同时探讨咪喹莫特作用于瘢痕成纤维细胞，对其迁移能力的作用效果。最终实验结果显示，咪喹莫特可以降低瘢痕成纤维细胞的迁移能力，且减少瘢痕成纤维细胞内Ⅰ型胶原和PCOLCE的表达水平。
PCOLCE又称为前胶原C-内肽酶增强剂，是一种分泌性糖蛋白，通过调节骨形态发生蛋白1的前胶原C-蛋白酶活性，在胶原形成过程中发挥重要作用，参与细胞外基质的重建[28]。已有研究显示，PCOLCE的失调与多种疾病有关，如PCOLCE的表达与肌肉纤维化、肝纤维化呈正相关[29]，敲除PCOLCE基因可导致小鼠胚胎成纤维细胞中胶原形成减少[30]。
WONG等[31]采用mTOR特异性抑制剂雷帕霉素作用于人瘢痕成纤维细胞，通过全基因组微阵列检测分析，发现其可以降低成纤维细胞中胶原生物合成基因PLOD、PCOLCE和P4HA的表达，因此推测病理性瘢痕可以通过调节前胶原和胶原加工来改善甚至消除。最近一项研究发现，骨肉瘤组织中PCOLCE的高表达与患者预后不良相关，敲除PCOLCE基因可以减少骨肉瘤细胞的迁移、侵袭和肺转移；而PCOLCE的过表达促进了迁移、侵袭和转移[32]，此次实验结果也与上述研究相一致。此次研究结果显示，咪喹莫特不仅可以降低PCOLCE的表达水平，同时可以抑制瘢痕成纤维细胞的迁移能力；其中PCOLCE的表达水平下降，可降低胶原形成，进而减少细胞外基质，因此具有改善病理性瘢痕的潜力，而同样PCOLCE的低表达也与细胞迁移率的下降相一致，因此也有利于减少瘢痕形成。
既往研究显示，咪喹莫特可诱导多种细胞因子的增加，例如白细胞介素10、白细胞介素8和α-干扰素等[23，33-35]，而其中干扰素细胞因子同样在防治瘢痕中具有抑制瘢痕形成及调控瘢痕成纤维细胞增殖的作用[36-38]。因此，咪喹莫特治疗瘢痕的作用机制不仅可以直接抑制细胞增殖和迁移，减少细胞外基质，还可以通过调控其他细胞因子的分泌表达起到间接干预的作用。此次研究尚有不足之处，目前仅进行了细胞实验部分的探索，未做临床课题及动物模型验证，因此尚需下一步进行更深入的探索研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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