激素性股骨头缺血坏死与Dickkopf-1及细胞凋亡的关系

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.28.002

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (28): 4436-4441.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.28.002

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激素性股骨头缺血坏死与Dickkopf-1及细胞凋亡的关系

孔令跃¹，刘万林²，任逸众¹

内蒙古医科大学第二附属医院，¹关节镜与运动医学外科，²小儿骨科，内蒙古自治区呼和浩特市 010030

修回日期:2017-08-15 出版日期:2017-10-08 发布日期:2017-11-10
通讯作者: 刘万林，教授，内蒙古医科大学第二附属医院小儿骨科，内蒙古自治区呼和浩特市 010030
作者简介:孔令跃，主治医师。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81360273，81460331)

Implication of Dickkopf-1 and cell apoptosis in steroid-induced avascular necrosis of the femoral head

Kong Ling-yue¹, Liu Wan-lin², Ren Yi-zhong¹

¹Department of Arthroscopy and Sports Medicine Surgery, ²Departemnt of Pediatric Orthopedics, the Second Affiliated of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Revised:2017-08-15 Online:2017-10-08 Published:2017-11-10
Contact: Liu Wan-lin, Professor, Departemnt of Pediatric Orthopedics, the Second Affiliated of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Kong Ling-yue, Attending physician, Department of Arthroscopy and Sports Medicine Surgery, the Second Affiliated of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81360273 and 81460331

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
细胞凋亡：随着分子生物学的发展，细胞凋亡理论已成为研究器官组织损伤和衰老发生机制的重要研究方向，受到众多国内外学者的重视。细胞凋亡是由基因控制的细胞主动死亡，是多种细胞有机体为维护内环境稳定、调控机体发育进行的程序化细胞死亡，为细胞衰老自然死亡的主要方式之一。虽然细胞凋亡是一种生理过程，但或多或少都会引起疾病发生。细胞凋亡的发生主要与氧化应激、线粒体损伤及钙稳态失衡等有关；凋亡信号转导通路受基因调控及许多诱导因素(如激素和生长因子的失衡等)的影响。
Dickkopf-1：可以通过Wnt信号传导通路调控survivin基因，通过间接途径启动肿瘤细胞的凋亡信号；此外，其还可以选择性的控制Bax与Bcl-2之间的浓度比例，使抗凋亡因子Bcl-2表达下调，促凋亡因子Bax表达上调。因此可以得出结论：Dickkopf-1可以调控凋亡控制基因。

摘要
背景：近年来已有许多学者开始探讨骨细胞和成骨细胞凋亡在激素性股骨头缺血坏死中的作用，对其发病机制有了新的认识。但遗憾的是，这些研究还尚未深入到对骨细胞、成骨细胞凋亡机制的研究中。有学者指出激素可以增加Wnt信号途径中的拮抗分子Dickkopf-1。
目的：通过探索Dickkopf-1与细胞凋亡在激素性股骨头缺血坏死中的作用，了解Dickkopf-1及细胞凋亡与激素性股骨头缺血坏死的关系。
方法：收集经全髋关节置换术取下的激素性股骨头缺血坏死股骨头标本14例作为实验组，新鲜股骨颈骨折髋关节置换术后标本8例作为对照组。电镜观察骨细胞形态变化，苏木精-伊红染色计数空缺骨陷窝，TUNEL法检测骨细胞凋亡，免疫组织化学法检测Dickkopf-1表达。采用Spearman线性相关分析法分析实验组的Dickkopf-1表达率与骨细胞凋亡指数的相关性。
结果与结论：①实验组空缺骨陷窝率明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；②实验组Dickkopf-1水平明显高于对照组, 差异有显著性意义(P < 0.05)；③实验组细胞凋亡指数明显高于对照组, 差异有显著性意义(P < 0.05)；④实验组中Dickkopf-1表达率与骨细胞凋亡指数呈正相关(r=0.623)；⑤结果表明，Dickkopf-1与细胞凋亡共同参与了激素性股骨头缺血坏死的过程，Dickkopf-1水平升高可能是激素性股骨头缺血坏死发病的重要促进因素；骨细胞凋亡在股骨头缺血坏死过程中起重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-2277-1485(孔令跃)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 激素, 骨坏死, 细胞凋亡, Dickkopf-1, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The roles of osteocyte and osteoblast apoptosis in steroid-induced avascular necrosis of the femoral head (ANFH) have arouse much attention, and its pathogenesis has been understood gradually. But there is a lack of knowledge about the mechanisms underlying osteocyte and osteoblast apoptosis. Meanwhile, hormones have been shown to enhance the Dickkopf-1 expression in Wnt signaling pathway.
OBJECTIVE: To investigate the roles of Dickkopf-1 and cell apoptosis in steroid-induced ANFH, and to understand their correlations with steroid-induced ANFH.
METHODS: Necrotic femoral head samples were removed from 14 patients with steroid-induced ANFH after total hip arthroplasty (experimental group), and normal femoral heads were from 8 patients with femoral neck fracture (control group). The cellular morphology was observed using transmission electron microscope; the number of empty lacunae was counted through hematoxylin-eosin staining; the cell apoptosis was detected by TUNEL assay; the expression level of Dickkopf-1 was detected by immunohistochemistry. Moreover, the correlation between the Dickkopf-1 positive rate and apoptosis index of osteocytes was analyzed by Spearman rank correlation analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: The number of empty lacunae, expression level of Dickkopf-1, and apoptosis index of osteocytes in the experimental group were significantly higher than those in the control group (P < 0.05). In the experimental group, the Dickkopf-1 positive rate was positively correlated to the apoptosis index of osteocytes (r=0.623). These results indicate that Dickkopf-1 and osteocyte apoptosis both play key roles in steroid-induced ANFH, and increased Dickkopf-1 level may promote the development of ANFH.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Arthroplasty, Replacement, Hip, Femur Head Necrosis, Prosthesis Implantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

孔令跃，刘万林，任逸众. 激素性股骨头缺血坏死与Dickkopf-1及细胞凋亡的关系[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(28): 4436-4441.

Kong Ling-yue, Liu Wan-lin, Ren Yi-zhong. Implication of Dickkopf-1 and cell apoptosis in steroid-induced avascular necrosis of the femoral head[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(28): 4436-4441.

图/表（结果） 1

2.1 大体形态学观察 实验组和对照组股骨头大体形态无明显差异。

2.2 苏木精-伊红染色结果

实验组：在实验组的病理切片上可以很清楚地看见非常具有特征性的骨坏死，光镜下可以看见骨小梁失去原有的形态，稀疏、变细，有些甚至出现断裂，结构紊乱，有碎片出现；造血细胞数量减少；成骨细胞排列不规则；空缺骨陷窝明显增加；骨髓内脂肪细胞体积增大，有的融合成泡状(图1A)。

对照组：在对照组的病理切片上可以观察到形态完整的骨小梁，这些骨小梁排列非常整齐，致密而且饱满，骨小梁中的骨细胞清晰可见，核大并且位于中央；骨髓内造血细胞丰富，形态正常(图1B)。

实验组空缺骨陷窝率均明显高于对照组，经统计分析，差异有显著性意义(t=28.18，P=0.00，P < 0.05)，见表1。

2.3 超薄切片透射电镜结果

实验组：股骨头切片表现为胞膜完整，细胞核固缩，染色质边集，细胞器消失，凋亡小体出现(图2A)；

对照组：骨细胞、骨髓细胞超微结构均正常(图2B)。

2.4 TUNEL骨细胞凋亡情况 TUNEL染色阳性在切片中的表现为：细胞核着色呈棕黄褐色，极为少数的细胞浆内可以出现阳性颗粒。实验组的切片上可见骨细胞的细胞核中有棕黄褐色的阳性颗粒，并且在骨髓组织中可见有大量的骨细胞凋亡(见图3)。实验组的骨细胞凋亡指数明显高于对照组，经统计分析，差异有显著性意义(Z=2.26，P=0.00， P < 0.05)，见表1。

2.5 Dickkopf-1表达率 实验组Dickkopf-1表达率高于对照组，经统计分析，差异有显著性意义(t=24.77，P=0.00，P < 0.05)，见表1及图4。

2.6 实验组中Dickkopf-1表达率与骨细胞凋亡指数的线性相关分析 实验组中Dickkopf-1表达率与骨细胞凋亡指数经统计分析，二者呈正相关性(r=0.623，P < 0.05)。

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引言

激素性股骨头缺血坏死(steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH)是指短期大量使用或长期使用肾上腺皮质激素(简称激素)后，致使股骨头活性成分死亡，从而引起的病理过程。既往研究发现，大量使用激素可导致股骨头坏死。目前SANFH临床比例数的大幅度增加与糖皮质激素的广泛应用密切相关^[1-2]。SANFH为非创伤性股骨头坏死中发病率最高的一种类型。SANFH主要累及中青年人群，多为双侧性，其坏死率和致残率远高于一般的特发性股骨头缺血坏死^[3]。2003年“非典”以后，又涌现出大量SANFH病例。激素引起的SANFH是一个非常复杂的生物学过程，具体的发病机制仍然不是很清楚，因此，探明SANFH的发病机制，仍然是该领域的研究重点。只有对其发病机理深入了解，才能为临床预防、治疗SANFH提供理论依据。

作为发病率最高的非创伤性股骨头坏死，自20世纪60年代起，众多学者便致力于对其发病机制的研究，但目前仍未得到确切结论，目前存在多种比较分散的学说，其中具有代表性的包括激素的细胞毒作用、脂肪代谢紊乱、骨内压增高、血管内凝血等^[4-18]。但确切的病理生理机制尚不明确。最近的一些实验研究可以发现SANFH和细胞凋亡有着密切关系。随着分子生物学的发展，细胞凋亡理论已成为研究器官组织损伤和衰老发生机制的重要研究方向，受到众多国内外学者的重视。细胞凋亡是由基因控制的细胞主动死亡，是多种细胞有机体为维护内环境稳定、调控机体发育进行的程序化细胞死亡，为细胞衰老自然死亡的主要方式之一。虽然细胞凋亡是一种生理过程，但或多或少都会引起疾病发生。细胞凋亡的发生主要与氧化应激、线粒体损伤及钙稳态失衡等有关；凋亡信号转导通路受基因调控及许多诱导因素(如激素和生长因子的失衡等)的影响。近年来已有许多学者开始初步探讨骨细胞和成骨细胞的凋亡在SANFH中的作用^[19-22]，对其发病机制有了新的认识。但遗憾的是，这些研究还尚未深入到对骨细胞、成骨细胞凋亡机制的研究中。同时，也有研究表明，在肝癌、胃癌等其他疾病中，细胞凋亡与WNT信号途径有密切关系^[23-24]，但在骨细胞内尚无研究。有学者指出激素可以增加Wnt信号途径中的拮抗分子Dickkopf-1。

课题通过收集经全髋置换术取下的SANFH的股骨头标本14例作为实验组，股骨颈骨折髋关节置换术后标本8例作为对照组。切取股骨头标本经固定、脱钙，制作切片，电镜观察骨细胞形态变化，光镜观察其病理变化，并用苏木精-伊红染色计数空缺骨陷窝，免疫组织化学染色法检测Dickkopf-1的表达，用TUNEL凋亡检测试剂盒检测骨细胞凋亡，探索Dickkopf-1与细胞凋亡在SANFH中的作用。为进一步探讨SANFH的发病机制提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计 对比观察实验。

1.2 材料 实验标本均来自于全髋置换术取下的股骨头，经手术取下股骨头后，-80 ℃冰箱保存。SANFH股骨头标本14例作为实验组，男10例，女4例；年龄45-68岁，平均54岁。新鲜股骨颈骨折股骨头标本8例(受伤3 d内手术者)作为对照组，男6例，女2例；年龄54-80岁，平均年龄68岁；对照组患者排除心血管及免疫系统疾患，无烟酒嗜好及服用激素史。

1.3 实验方法

1.3.1 标本制作 将取下的股骨头自冠状面对半剖开，切取股骨头软骨0.2 cm下0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的骨块，用40 g/L多聚甲醛固定12 h(含0.1%DEPC)后，13%乙二胺四乙酸(EDTA pH 7.0)脱钙，脱钙完全后(针刺无阻力为准，需要6-14 d)，常规石蜡包埋。

1.3.2 光镜下组织形态学观察 将切片分别置于100倍及400倍光镜下观察组织病理学改变。用空缺骨陷窝率来表示骨细胞坏死的病理变化，即在100倍光镜下，随机挑选出5个高倍镜视野，每个视野内计数50个骨陷窝，分别数出空缺骨陷窝数，计算出空缺骨陷窝所占的百分数。

1.3.3 透射电子显微镜观察 在股骨头坏死区切取四至五块0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm的骨块，2.5%戊二醛液前固定，10% EDTA脱钙，1%锇酸后固定，环氧树脂包埋，瑞典LKB2800型制作超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铝染色，日立700型电镜观察。

1.3.4 TUNEL法检测骨细胞凋亡情况 TUNEL染色，当细胞核中出现棕黄色颗粒的为阳性细胞，即为凋亡的细胞。在光镜下，随机在每张玻片上找5个高倍视野，每个高倍视野下计数50个骨细胞，

1.3.5 免疫组织化学法检测Dickkopf-1表达 ①各蜡块连续4 μm切片，置于涂有APES防脱片剂的载玻片上，置60 ℃烤箱中烘烤50 min；②切片常规二甲苯脱蜡两次，每次20 min；梯度乙醇脱水：无水乙醇5 min，体积分数95%乙醇5 min，85%乙醇5 min，75%乙醇5 min，蒸馏水水化1 min；③切片置于体积分数3%H₂O₂10 min以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次；④热修复抗原：将切片浸入枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)，微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10 min后，反复一至两次，冷却后PBS(pH 7.2-7.6)洗涤3次，每次5 min；⑤滴加5%BSA封闭液，室温20 min，甩去多余液体，不洗；⑥在每张切片上滴加相应的第一抗体50 μL，即兔抗人Dickkopf-1多克隆抗体，20 ℃2 h。PBS(pH 7.2-7.6)洗3次每次5 min；⑦滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室温20 min。PBS洗3次，每次3 min；⑧滴加试剂SABC，室温下20 min，PBS冲洗4次，每次5 min；⑨制备DAB显色剂，室温显色约8 min(在显微镜下掌握显色程度)。蒸馏水洗涤5次；⑩苏木精复染，自来水冲洗反蓝；?梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固；?显微镜下观察结果。

1.4 主要观察指标 电镜观察骨细胞形态变化；苏木精-伊红染色计数空缺骨陷窝；TUNEL法检测骨细胞凋亡；免疫组织化学法检测Dickkopf-1；实验组的Dickkopf-1表达率与骨细胞凋亡率采用Spearman线性相关分析。

1.5 统计学分析 数据均以x(_)±s表示，用SPSS 13.0软件行统计分析，空缺骨陷窝率、Dickkopf-1表达率符合正态性资料因此采用t 检验，骨细胞凋亡指数不符合正态性资料因此采用秩和检验，实验组的Dickkopf-1表达率与骨细胞凋亡指数采用Spearman线性相关分析，-1≤r≤+1表示2个变量呈直线相关关系，r为正数表示正相关，r为负数表示负相关。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

自1957年Pietrograndi首次报道1例激素性股骨头缺血性坏死病例以来，该病的临床病例屡见不鲜，患病人群大多为中青年，两侧股骨头均坏死者居多，其坏死率和致残率远高于一般的特发性股骨头缺血坏死。2003年“非典”后调查，使用大剂量激素治愈的SARS患者中三至四个月内发生SANFH者高达35.7%^[25]。激素引起的SANFH是一个非常复杂的生物学过程，因此该病具体的发病机制仍然不是很清楚。尽管这几十年来有许多国内外学者始终致力于对激素性股骨头缺血性坏死发病机制的研究，并且提出了像血管内凝血、激素的细胞毒作用、脂肪代谢紊乱、骨内压增高等这样比较经典的学说，但是其详细的发病机制至今还不是很清楚。近几年来，细胞凋亡理论逐渐进入了许多学者的视线，他们认为骨细胞的凋亡在SANFH中起着重要的作用。

本课题通过TUNEL法观察，实验组切片在镜下出现了大量的阳性细胞，而对照组却未见阳性细胞，证实在SANFH病例中确实存在细胞凋亡。

细胞凋亡是体内、体外因素触发细胞内预存的死亡程序，从而导致细胞死亡，又称细胞程序性死亡^[26-28]，其过程设计精确地基因转录及蛋白质的合成，与坏死不同，是一种主动的细胞死亡。到目前为止发现细胞凋亡至少存在着3条通路，分别是线粒体通路、死亡受体通路、内质网通路。这3条通路可以分别被凋亡刺激信号激活，也可以在一些条件下发生联系。通过对激素性股骨头缺血性坏死的细胞及分子生物学的深入研究，发现该病与成骨细胞、骨细胞的凋亡关系密切^[29]。过量激素导致骨细胞和成骨细胞凋亡导致激素性的骨坏死，而且过量的激素可延长破骨细胞寿命。Moraes等^[30]研究发现激素可以和骨细胞、成骨细胞及破骨细胞的某种表面受体结合，导致该受体的空间构象发生变化，从而影响细胞核内基因的表达。早在1998年便有学者就通过原位缺口末端标记法技术检测SANFH标本与酒精性股骨头坏死标本中的细胞凋亡情况^[31]，通过检测发现激素导致的股骨头坏死标本中存在大量的骨细胞凋亡，而酒精导致的股骨头坏死标本中则有少量的骨细胞凋亡；但其他原因引起的股骨头坏死的检测结果未发现有骨细胞凋亡。Weinstein等^[32]学者通过研究发现过量的激素应用可以影响到骨髓内成骨细胞以及破骨细胞的形成机制，从而减少了骨的成形率和骨密度，同时过量的激素可以导致成熟的骨细胞以及成骨细胞凋亡，因此他们认为激素在SANFH中的主要作用是：诱导骨细胞以及成骨细胞的凋亡，使破骨细胞生成减少、更新率降低，细胞凋亡持续发展，最终引起股骨头坏死^[33-34]。Weinstein等^[32]也通过原位缺口末端标记法技术检测激素导致的股骨头坏死标本，发现标本细胞内出现大量棕黄色DNA片断，说明DNA有降解，且碎片较规则。通过以上学者的研究，可以得出结论，在SANFH中，存在细胞凋亡现象。而国内学者王坤正等^[35]在SANFH的动物模型组织学上观察到的结果更加证实了这一点。王坤正等^[35]在光镜下观察到病变股骨头发生如下改变：骨髓水肿、造血细胞明显减少脂肪细胞肥大、空缺骨陷窝增加、有骨细胞坏死碎片。电镜观察其变化主要有：骨细胞多为退变相，吸收相细胞减少；可见凋亡的成骨细胞；成骨细胞粗面内质网上多聚糖体脱粒，解聚，线粒体肿胀。

本实验中实验组的平均骨细胞凋亡指数为35.57± 2.68，而对照组的平均骨细胞凋亡指数为2.13±0.83，实验组的骨细胞凋亡指数明显高于对照组，经统计分析，差异有显著性意义(Z=2.26，P=0.00，P < 0.05)，从而可以近一步证实在SANFH中确实存在着细胞凋亡。

大量研究表明，在如肝癌、胃癌等疾病中，Wnt信号与细胞凋亡关系密切，但在骨细胞方面目前尚未见相关研究，且实验证实，激素可以明显增加Wnt信号途径中起拮抗作用的分子Dickkopf-1，而对Wnt受体LRP的影响却很小。Wnt信号传导通路在机体组织动态平衡的维持方面起至关重要的作用，并且参与胚胎的形成。Dickkopf-1由Glinka等1998年首次发现于非洲蟾蜍胚胎细胞中。研究证实，人体内的Dickkopf-1基因位于10号染色体10q11上，受β-catenin调控，是它的下游靶基因^[36-37]。Dickkopf-1由靠近N端的Cys-1和靠近C端的 Cys-2两个富含半胱氨酸的保守区域组成。Cys-2在抑制Wnt经典信号传导通路方面起到决定作用，其含有10个保守的半胱氨酸残基，在所有DKKs(Dickkopfs)家族成员中呈高度保守状态^[38]。有文献记载Dickkopf-1可通过特意性的选择Wnt受体Lrp5/6与之结合，并干扰Lrp5/6与Wnt-Frizzled复合物的结合，从而起到抑制下游信号的传导。有学者通过实验发现，Dickkopf-1可以通过Wnt信号传导通路调控survivin基因，通过间接途径启动肿瘤细胞的凋亡信号；此外，其还可以选择性的控制Bax与Bcl-2之间的浓度比例，使抗凋亡因子Bcl-2表达下调，促凋亡因子Bax表达上调^[39]。因此可以得出结论：Dickkopf-1可以调控凋亡控制基因。

本实验通过免疫组织化学染色法检测Dickkopf-1，实验组中平均Dickkopf-1表达率为44.36±4.94，而对照组中平均Dickkopf-1表达率为9.87±1.25，经统计分析，t=24.77，P=0.00，差异有显著性意义(P < 0.05)，进一步说明了激素可以显著增加Dickkopf-1的表达。实验组中Dickkopf-1表达率与骨细胞凋亡指数经统计分析，r=0.623，P < 0.05，具有显著性意义，二者呈正相关，这就更加印证了Dickkopf-1可以调控凋亡控制基因这一观点。

以上这些观点从不同的角度阐述了Dickkopf-1与细胞凋亡影响SANFH发生可能的机理，但目前仍不能完全了解Dickkopf-1参与SANFH的具体过程，因而还需进一步研究。SANFH的治疗关键在于早期发现，早期诊断，早期治疗。本实验证明Dickkopf-1可能是影响SANFH发病过程的因素，临床可通过检测患者血清中Dickkopf-1浓度的改变，可能为该病早期诊断、治疗提供一定帮助。也可为今后SANFH的临床预防及治疗提供理论依据。

结论：本实验通过对SANFH标本进行组织形态学及超微结构等观察；并运用免疫组化的方法进行综合分析。得出了以下结论：①Dickkopf-1与细胞凋亡参与了SANFH的过程，Dickkopf-1水平升高可能是SANFH发病的重要促进因素；②骨细胞凋亡在股骨头缺血坏死过程中起重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

激素性股骨头缺血坏死与Dickkopf-1及细胞凋亡的关系

Implication of Dickkopf-1 and cell apoptosis in steroid-induced avascular necrosis of the femoral head

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