活血通络胶囊促进骨髓间充质干细胞成骨中的ERα-Wnt/β-catenin信号通路

doi:10.12307/2022.395

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (25): 3937-3943.doi: 10.12307/2022.395

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活血通络胶囊促进骨髓间充质干细胞成骨中的ERα-Wnt/β-catenin信号通路

吴忠书1，韦雨柔2，陈哓俊1 , 乌日莎娜2，何伟3，4，魏秋实3，4

1广州中医药大学第一临床医学院，广东省广州市 510405；2广州中医药大学第三临床医学院，广东省广州市 510378；3广州中医药大学第三附属医院关节科，广东省广州市 510378；4广东省中医骨伤研究院，广东省广州市 510378

收稿日期:2021-01-27 接受日期:2021-03-31 出版日期:2022-09-08 发布日期:2022-01-25
通讯作者: 魏秋实，博士，博士研究生导师，副主任医师，广州中医药大学第三附属医院关节科，广东省广州市 510378；广东省中医骨伤研究院，广东省广州市 510378
作者简介:吴忠书，男，1995年生，贵州省六盘水市人，侗族，2021年广州中医药大学毕业，硕士，主要从事股骨头坏死研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81473697，81873327)，项目负责人：何伟；广东省科技厅-广东省中医药科学院联合科研专项项目(2016A020226028)，项目负责人：魏秋实；广东省自然科学基金项目(2017A030313698)，项目负责人：魏秋实

Huo Xue Tong Luo capsule improves osteoblastogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells through the ERα-Wnt/β-catenin signaling pathway

Wu Zhongshu1, Wei Yurou2, Chen Xiaojun1, Wuri Shana2, He Wei3, 4, Wei Qiushi3, 4

1First Clinical School of Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405; 2Third Clinical School of Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510378; 3Department of Arthritis, Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510378; 4Guangdong Research Institute for Orthopedics & Traumatology of Chinese Medicine, Guangzhou 510378

Received:2021-01-27 Accepted:2021-03-31 Online:2022-09-08 Published:2022-01-25
Contact: Wei Qiushi, MD, Doctoral supervisor, Associate chief physician, Department of Arthritis, Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510378, Guangdong Province, China; Guangdong Research Institute for Orthopedics & Traumatology of Chinese Medicine, Guangzhou 510378, Guangdong Province, China
About author:Wu Zhongshu, Master, First Clinical School of Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (General Project), No. 81473697, 81873327 (to HW); Guangdong Provincial Science and Technology Department-Guangdong Academy of Chinese Medicine Joint Research Special Project, No. 2016A020226028 (to WQS); Guangdong Natural Science Foundation, No. 2017A030313698 (to WQS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
活血通络胶囊：由木豆、当归、芍药、藁本、桃仁、红花、地黄7种草本植物组成，具有活血化瘀、补肾固本、通络止痛的作用，常用于治疗股骨头坏死等。近年来随着对该药的深入研究，发现其可以从根本上改善股骨头缺血并促进骨再生，然而，活血通络胶囊发挥其功能的潜在机制仍未被揭示。
ERα-Wnt/β-catenin通路：Wnt/β-catenin信号通路是复杂而庞大的Wnt信号转导途径中最经典的一条通路，目前已有大量实验证明该通路具有促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的作用；ERα是雌激素受体的一种亚型，可介导配体调控成骨细胞增殖和分化、矿化。目前已有部分实验证明二者间的交互作用对成骨细胞增殖、分化和骨形成具有积极作用，但具体机制尚不明确。

背景：活血通络胶囊在临床上可预防无症状股骨头坏死的进展，但其相关机制尚不明确。
目的：探讨活血通络胶囊对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及ERα-Wnt/β-catenin通路的作用。
方法：将第3代人骨髓间充质干细胞加入含不同质量浓度活血通络胶囊(0，1，5，10 mg/L)的成骨诱导基培养14 d，采用茜素红染色和碱性磷酸酶活性检测确定活血通络胶囊促进人骨髓间充质干细胞成骨分化的最佳质量浓度。然后将第3代人骨髓间充质干细胞进一步分成4组：对照组、活血通络胶囊组、活血通络胶囊+ICI 182780组、活血通络胶囊+ICI 182780+DKK1组，采用qRT-PCR、Western blot及免疫荧光染色等方法观察活血通络胶囊、雌激素受体抑制剂ICI 182780和重组人DKK1蛋白对人骨髓间充质干细胞成骨的影响。
结果与结论：①活血通络胶囊(10 mg/L)能显著促进人骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化，并促进成骨基因Runx2、OPN、DLX5、BGLAP和ERα的mRNA表达，以及Wnt/β-catenin通路相关靶点β-catenin、TCF7、Lef1、C-MYC、CYCLIN D和C-JUN的mRNA表达；②活血通络胶囊的成骨作用受到ERα抑制剂ICI 182780和Wnt/β-catenin通路抑制剂DKK1的抑制；③结果表明，ERα-Wnt/β-catenin信号通路参与了活血通络胶囊对人骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的促进作用。
缩略语：雌激素受体α：estrogen receptor alpha，ERα

https://orcid.org/0000-0003-0626-953X (吴忠书)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 激素性股骨头坏死, 活血通络胶囊, ERα, Wnt, β-catenin, 通路

Abstract: BACKGROUND: The Huo Xue Tong Luo capsule has been found to prevent the progression of asymptomatic osteonecrosis of the femoral head, but the mechanism is not clear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of Huo Xue Tong Luo on the osteoblast differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells, and the effect of ERα-Wnt/β-catenin pathway.
METHODS: The third generation of human bone marrow mesenchymal stem cells was cultured in different concentrations of Huo Xue Tong Luo capsule (0, 1, 5, 10 mg/L) for 14 days. Alizarin red staining and alkaline phosphatase activity assay were used to determine the optimal concentration of Huo Xue Tong Luo in promoting osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Human bone marrow mesenchymal stem cells were further divided into four groups: control group, Huo Xue Tong Luo group, Huo Xue Tong Luo + ICI 182780 group, and Huo Xue Tong Luo + ICI 182780 + DKK1 group. qRT-PCR, western blot assay, and immunofluorescence staining were used to investigate the effect of Huo Xue Tong Luo, ICI 182780 and recombinant human DKK1 protein on osteogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Huo Xue Tong Luo capsule (10 mg/L) could significantly promote the proliferation and osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells, and promote the mRNA expression of osteogenic genes Runx2, OPN, DLX5, BGLAP, and ERα, as well as the mRNA expression of Wnt/β-catenin pathway related targets β-catenin, TCF7, Lef1, C-MYC, CYCLIN and C-JUN. (2) The osteogenesis of Huo Xue Tong Luo capsule was inhibited by ICI 182780 and DKK1. (3) The results showed that ERα-Wnt/β-catenin signaling pathway was involved in the promoting effect of Huo Xue Tong Luo capsule on the proliferation and osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, hormone-induced femoral head necrosis, Huo Xue Tong Luo capsule, ERα, Wnt, β-catenin, pathway

中图分类号:

吴忠书, 韦雨柔, 陈哓俊, 乌日莎娜, 何伟, 魏秋实. 活血通络胶囊促进骨髓间充质干细胞成骨中的ERα-Wnt/β-catenin信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(25): 3937-3943.

Wu Zhongshu, Wei Yurou, Chen Xiaojun, Wuri Shana, He Wei, Wei Qiushi. Huo Xue Tong Luo capsule improves osteoblastogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells through the ERα-Wnt/β-catenin signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(25): 3937-3943.

图/表（结果） 6

2.1 人骨髓间充质干细胞的形态及鉴定结果原代人骨髓间充质干细胞在第7天时贴壁密度达到90%，第2代和第3代人骨髓间充质干细胞在第3天时贴壁密度达到90%，细胞多呈细长的梭形或多角形，见图1A。流式细胞术检测结果表明，CD73、CD44和CD29阳性表达率分别为99.9%，100%，99.0%，而CD11b、CD45和HLA-DR阳性表达率仅为0.3%，0.4%，0.4%，见图1B。

2.2 活血通络胶囊促进人骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化 MTT实验分析表明，在培养1，2，3，7，14 d时，10 mg/L活血通络胶囊显著促进人骨髓间充质干细胞增殖(P < 0.05)，见图2A。培养14 d，茜素红染色显示活血通络胶囊促进钙沉积和钙结节形成，尤其10 mg/L活血通络胶囊作用效果显著，见图2B。碱性磷酸酶活性测定结果与茜素红染色结果一致，见图2C。qRT-PCR进一步证实活血通络胶囊在mRNA水平的促进作用。干预后14 d，活血通络胶囊显著促进了成骨标志基因的表达，包括β-catenin、RUNX2、BGLAP、ERα，见图2D。总之，活血通络胶囊可促进人骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化。以下实验采用10 mg/L活血通络胶囊进行干预。

2.3 活血通络胶囊通过Wnt/β-catenin信号通路促进成骨基因表达人骨髓间充质干细胞使用Wnt信号通路特异性抑制剂DKK1和雌激素受体抑制剂ICI 182780处理，以此确定活血通络胶囊是否通过Wnt/β-catenin途径促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化。qRT-PCR检测人骨髓间充质干细胞中Wnt通路成骨基因的表达水平。与对照组比较，10 mg/L活血通络胶囊在第3，7，14天显著增强RUNX2、DLX5、OPN、BGLAP、COL1和ERα mRNA的表达(P < 0.05)，见图3。值得注意的是，活血通络胶囊介导的mRNA表达增加受到DKK1和ICI 182780的显著抑制。

进一步检测活血通络胶囊对以下Wnt/β-catenin通路直接靶点的增强作用：TCF7、LEF1、β-catenin、C-MYC、CYCLIN D和C-JUN。与对照组相比，10 mg/L活血通络胶囊在第3，7，14天明显促进了β-catenin、TCF7、LEF1、C-MYC和CYCLIN D的mRNA表达(P < 0.01)。此外，在第3天和第14天C-JUN的mRNA表达也增强。DKK1和ICI 182780处理显著降低了上述基因的mRNA水平，见图4。

基于以上结果，可以认为活血通络胶囊通过关键分子ERα激活Wnt/β-catenin信号通路，促进人骨髓间充质干细胞成骨。
2.4 活血通络胶囊促进人骨髓间充质干细胞中β-catenin蛋白表达与对照组相比，活血通络胶囊能显著促进β-catenin在各时间点的表达。然而，ERα抑制剂ICI 182780和Wnt信号通路抑制剂DKK1的干预可能会阻碍活血通络胶囊的促进作用，见图5。

与预期一样，活血通络胶囊组在3个不同时间点的p-β-catenin表达水平均低于对照组。DKK1和ICI 182780处理可上调其在第3，7，14天的表达水平，见图5。总之，Western blot结果表明活血通络胶囊通过Wnt/β-catenin途径增强β-catenin的表达。
2.5 活血通络胶囊促进人骨髓间充质干细胞中β-catenin的核易位采用免疫标记和荧光显微镜观察β-catenin核易位在活血通络胶囊诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用，结果发现活血通络胶囊(10 mg/L)促进了人骨髓间充质干细胞中β-catenin(红色)的核(蓝色)易位，见图6，当用DKK1和ICI 182780处理细胞时，这种易位受到阻碍。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2019年6月至2020年1月在桂林医学院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞和药物人骨髓间充质干细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(中国上海)；活血通络胶囊购自广州中医药大学第一附属医院(机构批准号：Z20071224)，该药已在先前的研究中进行了全面介绍[13-14]。
1.3.2 实验试剂胎牛血清、青霉素-链霉素和低糖DMEM培养基(Gibco BRL，美国)；Wnt信号通路特异性抑制剂重组人DKK1蛋白(PeproTech，美国)；ERα抑制剂ICI 182780(Sigma，美国)；MTT检测试剂盒、L-抗坏血酸-2-磷酸、β-甘油磷酸、地塞米松和二甲基亚砜(Sigma-Aldrich，德国)；甲基强的松龙(辉瑞公司，中国)；茜素红染色试剂盒(阿拉丁公司，中国)；碱性磷酸酶活性试剂盒(南京建成公司，中国)；Prime ScriptTM RT Master Mix和SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(Takara Biotechnology，中国)；抗β-catenin抗体、p-β-catenin抗体和二抗(Santa Cruz，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 人骨髓间充质干细胞培养将细胞置于37 ℃，体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内静置半天，以稳定细胞状态，倒掉培养基，PBS轻轻冲洗细胞1次，加入完全培养基(DMEM-LG、体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g/L链霉素)培养24 h后传代，按细胞浓度为1×108 L-1接种于25 cm2培养瓶内，倒掉培养基，PBS轻洗2次，加入0.25%胰蛋白酶消化液1 mL，培养箱静置2 min左右，显微镜下观察大部分细胞回缩呈游离的圆形或成片漂浮于培养基时，终止消化，反复吹打瓶壁上细胞，使其彻底从培养瓶壁脱落，收集细胞液，1 000 r/min离心8 min，按1∶3传代，每3 d更换培养液1次，待细胞贴壁达80%后传下一代，培养过程中观察细胞生物学形态。
1.4.2 流式细胞术检测细胞表型使用第3代状态良好的人骨髓间充质干细胞，PBS洗涤2次，加入0.25%胰蛋白酶消化后离心，计数，用DMEM-LG完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度为1×108 L-1，接种到6孔板中，每孔加入2 mL细胞悬液，待细胞贴壁后，加入10 g/L多聚甲醛固定，应用流式细胞术检测CD73、CD44、CD29、CD11b、CD45及HLA-DR的表达水平。
1.4.3 活血通络胶囊对人骨髓间充质干细胞的促增殖作用将第3代对数生长期的人骨髓间充质干细胞以1×104/孔的密度接种于96孔板，在完全培养基中培养24 h，细胞达到80%融合，血清饥饿12 h，加入不同质量浓度的活血通络胶囊(0，1，5，10 mg/L)，培养1，2，3，7，14 d时，每孔加入MTT(5 g/L) 37 ℃培养3 h，小心吸去孔内培养基，每孔加入200 μL二甲基亚砜，置于摇床上室温低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，使用酶标仪在570 nm波长下处测量各孔吸光度值。
1.4.4 活血通络胶囊对人骨髓间充质干细胞的成骨作用
(1)茜素红染色：将第3代人骨髓间充质干细胞以细胞浓度为1×108 L-1接种在24孔板，每孔1 mL细胞悬液，待细胞贴壁后，加入成骨诱导培养基和不同质量浓度的活血通络胶囊(0，1，5，10 mg/L)[14]，每3 d换液1次，培养14 d后进行茜素红染色，小心吸除培养液，PBS清洗2次，体积分数为10%甲醛4 ℃固定10 min，PBS清洗2次，每孔加入茜素红染液0.5 mL，室温避光静置12 h，去掉未完全结合的染料，PBS振荡漂洗5 min，重复4次，吸去多余的PBS，室温下干燥1 d，最后在倒置相差显微镜下观察。
(2)碱性磷酸酶活性检测：将第3代人骨髓间充质干细胞以2×104/孔接种于48孔板，待细胞贴壁后，加入成骨诱导培养基和不同质量浓度的活血通络胶囊(0，1，5，10 mg/L)培养1，2，3，7，14 d，严格按照碱性磷酸酶活性试剂盒说明进行碱性磷酸酶活性检测，使用酶标仪在450 nm波长处测量各孔吸光度值。

(3)实时定量PCR检测β-catenin、RUNX2、BGLAP、ERα的表达：将第3代人骨髓间充质干细胞以1×106/孔接种于6孔板，待细胞贴壁后，加入成骨诱导培养基和不同质量浓度的活血通络胶囊(0，1，5，10 mg/L)培养14 d，根据Takara Mini-BEST Universal RNA extraction kit的说明，提取细胞总RNA，然后将其反转录为cDNA，在实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)中进行qPCR，以GAPDH为内参将数据标准化，然后使用ΔΔCt法计算。所有的实验均重复3次。引物序列见表1。

1.4.5 实验细胞分组根据上述实验确定活血通络胶囊促进人骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的最佳质量浓度。将第3代人骨髓间充质干细胞进一步分成4组，观察活血通络胶囊、雌激素受体抑制剂ICI 182780和Wnt信号通路特异性抑制剂重组人DKK1蛋白对人骨髓间充质干细胞成骨的影响。
对照组：用PBS和成骨诱导培养基培养；活血通络胶囊组：用最佳质量浓度的活血通络胶囊和成骨诱导培养基培养；活血通络胶囊+ ICI 182780组：用最佳质量浓度的活血通络胶囊、1 μmol/L ICI 182780和成骨诱导培养基培养[15]；活血通络胶囊+ICI 182780+DKK1组：用最佳质量浓度的活血通络胶囊、1 μmol/L ICI 182780、0.2 mg/L重组人DKK1蛋白和成骨诱导培养基培养[16]。
1.4.6 实时定量PCR分析成骨基因和Wnt/β-catenin通路靶基因的表达各组细胞干预第3，7，14天提取总RNA，然后将其反转录为cDNA，在实时PCR系统中进行qPCR，检测β-catenin、TCF7、LEF1、C-JUN、C-MYC、CYCLIN D、RUNX2、DLX5、OPN、COL1、BGLAP和ERα的表达水平，以GAPDH为内参将数据标准化，然后使用ΔΔCt法计算。所有的实验均重复3次。引物序列见表1。
1.4.7 Western blot检测β-catenin蛋白的表达各组细胞干预第3，7，14天，使用适当体积的RIPA裂解缓冲液(加入蛋白酶抑制剂)充分分离蛋白，使用BCA蛋白定量试剂盒测定样品蛋白浓度。将20 mg蛋白样品与5×SDS上样缓冲液按 4∶1 比例混合，100 ℃加热5 min后立即置于冰上放置3 min，使用10%SDS-PAGE电泳，然后转膜至NC膜，将转好的膜于室温下脱色摇床上用1%牛血清白蛋白封闭1 h；加入一抗(稀释比为1∶1 000) 4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次5 min；加入辣根过氧化物酶结合的二抗(1∶5 000稀释)室温孵育1 h，TBST在脱色摇床上洗3次，每次5 min，加入发光工作液，在凝胶成像仪中显像，使用Image J软件处理系统分析目标条带的灰度值。
1.4.8 免疫荧光染色各组细胞干预第7天，加入40 g/L多聚甲醛固定15 min，加入1%牛血清白蛋白封闭20 min，加入β-catenin一抗(1∶200稀释) 4 ℃孵育过夜，加入FITC标记的山羊抗兔IgG(1∶100稀释)孵育30 min，细胞核用DAPI(1∶1 000稀释)染色5 min，吸除DAPI染色液，用TBST、PBS或生理盐水洗涤两三次，每次3-5 min，在荧光显微镜下观察。
1.5 主要观察指标 ①活血通络胶囊促进人骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的最适质量浓度；②活血通络胶囊、雌激素受体抑制剂ICI 182780和Wnt信号通路特异性抑制剂重组人DKK1蛋白对人骨髓间充质干细胞成骨相关基因或Wnt通路靶基因表达的影响。
1.6 统计学分析采用SPSS 16.0(IBM，美国)进行统计分析，实验重复3次，计量数据以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

激素型股骨头坏死是糖皮质激素治疗的常见骨科并发症，多发于青壮年；9%-40%的受影响人群接受过高剂量的糖皮质激素治疗[17]，从而显著增加了家庭和社会的经济负担。激素型股骨头坏死患者骨髓间充质干细胞的增殖和成骨能力严重受损，这可能是长期暴露于糖皮质激素所致[18-19]。多向分化能力是骨髓间充质干细胞的显著特征之一，它们可以分化成不同类型的细胞，如成骨细胞、软骨细胞等[20-21]，因此，骨髓间充质干细胞被认为是有望治疗多种人类骨科疾病的种子细胞[22]。干细胞为股骨头坏死的治疗提供了光明的前景[23]。动物实验结果表明，骨髓间充质干细胞成骨有助于坏死骨的修复[24]。然而，骨髓间充质干细胞并不总是表现出预期的修复效果。干细胞治疗联合髓芯减压术与单纯髓芯减压术相比没有明显优势，甚至在某些联合病例中没有明显的坏死修
复[25]。干细胞的增殖和分化能力可能是出现这些情况的关键因素[26]。
由于激素型股骨头坏死患者的骨髓间充质干细胞增殖和成骨能力受损[18]，刺激骨髓间充质干细胞成骨的药物可能成为治疗激素型股骨头坏死或提高当前联合细胞治疗有效性的新方法。
值得注意的是，越来越多的研究表明，中药可以有效增强骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化潜能[27]。此外，最近的一项系统综述报道，中医药作为辅助治疗，可能会提高髓芯减压的疗效[28]。
ERα和Wnt/β-catenin信号的激活可能与活血通络胶囊的成骨能力有关。Wnt信号通路已成为骨髓间充质干细胞的关键调控因子，促进成骨基因转录，通过其调控骨髓间充质干细胞的成骨、成脂肪和成软骨分化[29-31]。典型的Wnt信号通路由卷曲蛋白受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)共同调节，后者分泌Wnts(如Wnt3a)，然后从糖原合成酶激酶3β(GSK3β)复合物中释放关键元件β-catenin、APC和Axin；其次，在β-catenin与TCF/LEF相互作用后，β-catenin的核易位导致Wnt靶基因转录增加[32]。成骨细胞中ERα缺乏会导致雌性小鼠骨量减少及骨组织结构变化[33]。此外，ERα能够增强对机械应力改变的骨应答，并调节雌性和雄性小鼠的骨小梁形成[34]。
课题组对55例股骨头坏死患者进行为期2-12年随访的前瞻性研究，证明了活血通络胶囊能抑制股骨头坏死向塌陷的发生和发展[13]，同时活血通络胶囊可以显著上调ALP、Runx2和OCN的表达，并增强大鼠骨髓间充质干细胞的矿化作用[14]。
因此，有必要在体外进一步研究活血通络胶囊对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。虽然活血通络胶囊显著促进了人骨髓间充质干细胞的成骨作用，但其潜在的调控机制尚不清楚。活血通络胶囊处理人骨髓间充质干细胞后激活了骨形成的关键转录因子β-catenin和RUNX2；反过来，这些转录因子诱导成骨细胞标记基因DLX5、OPN和BGLAP的表达[35]。活血通络胶囊诱导的成骨能力上升被Wnt信号通路抑制剂DKK1显著减弱。Wnt/β-catenin信号通路调控人骨髓间充质干细胞成骨细胞分化。当β-catenin缺失时，人骨髓间充质干细胞的成骨作用被成软骨作用所取代。累积的β-catenin易位到细胞核中并与转录因子LEF/TCF形成复合物，以增强参与调节细胞增殖的基因表达，包括C-MYC、CYCLIN D和C-JUN[36]。活血通络胶囊增加了β-catenin的表达并促进其核易位，从而促进成骨基因的表达，而DKK1对上述效应均有抑制作用。
雌激素受体被雌激素激活，可在成骨细胞、骨细胞和破骨细胞中检测到[37]。WINDAHL等[34]证实，骨细胞中ERα的缺失降低了早期(Runx2)和晚期(Ibsp)成骨细胞标志物的mRNA表达水平，从而阻碍了成骨细胞的分化。重要的是，ERα基因敲除小鼠的骨细胞标志物Dmp1也降低。最近，ERα也被发现与Wnt/β-catenin通路协同作用，通过促进骨髓间充质干细胞的成骨分化来调节骨发育[7]。在该研究中，作者发现活血通络胶囊能够上调ERα mRNA的表达；此外，ERα抑制剂ICI 182780也可以降低Runx2以及其他成骨细胞靶基因的mRNA表达水平。因此，活血通络胶囊可能通过上调ERα-Wnt/β-catenin信号通路促进人骨髓间充质干细胞的成骨作用。
结论：活血通络胶囊在体外对人骨髓间充质干细胞增殖和成骨有促进作用，且10 mg/L为最佳干预质量浓度，这可能与ERα-Wnt信号通路的激活以及β-catenin的积累和核易位有关，为进一步的临床研究和活血通络胶囊治疗股骨头缺血性坏死提供了基础依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

活血通络胶囊促进骨髓间充质干细胞成骨中的ERα-Wnt/β-catenin信号通路

Huo Xue Tong Luo capsule improves osteoblastogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells through the ERα-Wnt/β-catenin signaling pathway

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