尾静脉注射骨髓间充质干细胞修复衰老小鼠颅骨损伤

doi:10.12307/2022.396

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (25): 3944-3950.doi: 10.12307/2022.396

• 干细胞移植 stem cell transplantation • 上一篇下一篇

尾静脉注射骨髓间充质干细胞修复衰老小鼠颅骨损伤

张静莹1，李自伊1，刘小川1，李丹1，王杨2，吴柱国1

1广东医科大学附属东莞第一医院，广东省东莞市 523808；2葫芦岛市中心医院内分泌科，辽宁省葫芦岛市 125000

收稿日期:2021-02-27 接受日期:2021-04-15 出版日期:2022-09-08 发布日期:2022-01-25
通讯作者: 张静莹，博士，副教授，广东医科大学附属东莞第一医院，广东省东莞市 523808
作者简介:张静莹，女，1978年生，河北省秦皇岛市人，汉族，2011年中国医科大学毕业，博士，副教授，主要从事骨组织工程、生物材料、干细胞相关研究。
基金资助:
广东省基础与应用基础研究基金联合基金(2020B1515120001)，项目负责人：张静莹；广东省普通高校重点领域(2020ZDZX2013)，项目负责人：张静莹；广东医科大学学科建设项目(4SG21019G)，项目负责人：张静莹；广东医科大学学科建设项目(4SG21015G)，项目负责人：吴柱国

Tail vein injection of bone marrow mesenchymal stem cells for repair of skull injury in aging mice

Zhang Jingying1, Li Ziyi1, Liu Xiaochuan1, Li Dan1, Wang Yang2, Wu zhuguo1

1The First Dongguan Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Dongguan 523808, Guangdong Province, China; 2Department of Endocrinology, Huludao Central Hospital, Huludao 125000, Liaoning Province, China

Received:2021-02-27 Accepted:2021-04-15 Online:2022-09-08 Published:2022-01-25
Contact: Zhang Jingying, PhD, Associate professor, The First Dongguan Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Dongguan 523808, Guangdong Province, China
About author:Zhang Jingying, PhD, Associate professor, The First Dongguan Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Dongguan 523808, Guangdong Province, China
Supported by:
the Basic and Applied Basic Research of Guangdong Province, No. 2020B1515120001 (to ZJY); Key Fields Foundation of Colleges and Universities in Guangdong Province, No. 2020ZDZX2013 (to ZJY); Discipline Construction Project of Guangdong Medical University, No. 4SG21019G (to ZJY), No. 4SG21015G (to WZG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
尾静脉注射骨髓间充质干细胞：选取1周龄幼鼠进行骨髓间充质干细胞分离培养，细胞经过3代纯化筛选后，以生理盐水制备1×1010 L-1细胞悬液，尾静脉途径注射0.2 mL细胞悬液，以等量生理盐水作为对照，观察尾静脉注射骨髓间充质干细胞对小鼠颅骨损伤修复能力的影响。
衰老小鼠颅骨损伤：1月龄小鼠作为年轻小鼠，12月龄小鼠作为衰老小鼠；以牙科手机在局麻下手术分离皮肤，使颅顶骨暴露，在颅顶骨中缝右侧3 mm处制备直径1 mm的圆形骨缺损，缝合封闭软组织创伤。

背景：局部应用骨髓间充质干细胞具有促进骨组织再生修复的能力，但是经静脉注射途径是否能发挥显著作用，及其对于不同生理年龄状态下的骨组织再生修复能力尚需明确。
目的：探索尾静脉注射骨髓间充质干细胞对年轻小鼠与衰老小鼠颅骨损伤修复能力的影响。
方法：取40只1月龄昆明小鼠作为年轻小鼠，40只12月龄昆明小鼠作为衰老小鼠，再随机分为年轻小鼠实验组、年轻小鼠对照组、衰老小鼠实验组、衰老小鼠对照组。构建颅骨缺损模型，术后1，8，15 d实验组小鼠尾静脉注射0.2 mL骨髓间充质干细胞悬液(1×1010 L-1)；对照组小鼠注射等量生理盐水。术后1周和3周取颅骨缺损标本，进行形态学、组织病理学、光学、免疫组织化学观察分析。
结果与结论：①Micro-CT检测：术后1周，年轻小鼠与衰老小鼠骨缺损区域大小无显著差异；术后3周，实验组骨缺损区域孔径显著缩小；②苏木精-伊红染色、Masson染色：术后1周，缺损区域内有新生胶原纤维；术后3周，缺损区域出现新生骨基质，其中实验组显著多于对照组；③非线性光学显微镜检测：术后3周，缺损区域胶原蛋白水平比较：年轻小鼠实验组 > 年轻小鼠对照组；衰老小鼠实验组>衰老小鼠对照组；④免疫组化分析：术后1周和3周，年轻小鼠实验组的Sirt1蛋白表达均低于年轻小鼠对照组；术后1周，衰老小鼠实验组的Sirt1蛋白表达高于衰老小鼠对照组；术后3周，衰老小鼠实验组的Sirt1蛋白表达低于衰老小鼠对照组；⑤结果表明，经尾静脉注射骨髓间充质干细胞明显促进不同年龄段小鼠颅骨缺损修复，其主要通过激活小鼠体内Sirt1表达而促进骨再生。

https://orcid.org/0000-0002-7971-7180 (张静莹)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 衰老, 颅骨损伤, 再生医学, 静脉注射, Sirt1, 组织修复

Abstract: BACKGROUND: Local application of bone marrow mesenchymal stem cells has the ability to promote bone tissue regeneration and repair; however, whether it could play a significant role via vein injection and its ability of bone tissue regeneration and repair at different ages still need to be clarified.
OBJECTIVE: To explore the effects of bone marrow mesenchymal stem cells on the repair ability of skull injury in young and aging mice via vein injection.
METHODS: Totally 40 1-month-old Kunming mice were obtained as young mice, and 40 12-month-old Kunming mice were obtained as aging mice. The mice were divided into young experimental group, young control group, aging experimental group, and aging control group. The bone defect was made in the cranium of the mice. At 1, 8, and 15 days after surgery, 0.2 mL bone marrow mesenchymal stem cell suspension (1×1010 L-1) was injected into the tail vein of mice in the experimental groups; meanwhile, an equal volume of saline was used in the control groups via tail vein. The mice were sacrificed at 1 and 3 weeks after surgery. The specimens were repaired for the following experiments: morphological, histopathological, optical, and immunohistochemical analyses.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Micro-CT imaging: At 1 week after surgery, there was no significant difference in the size of bone defect area between the young and aging groups, and the size of the bone defect area was reduced significantly in the experimental groups at 3 weeks after surgery. (2) Hematoxylin-eosin staining and Masson staining: The collagen fibers appeared at 1 week after surgery; meanwhile, the bone matrix emerged at 3 weeks after surgery in the defect area. The collagen fibers and the bone matrix were significantly more in the experimental groups than those in the control groups. (3) Non-linear light microscopy: At 3 weeks after the operation, the comparison of collagen content in the defect area was as follows: young experimental group > young control group; aging experimental group > aging control group. (4) Immunohistochemical analysis: At 1 and 3 weeks after operation, Sirt1 protein expression was more in the young groups than that in the aging groups. At 1 week, the Sirt1 protein expression was more in the experimental groups than that in the control groups. At 3 weeks, the Sirt1 protein expression was less in the aging experimental group than that in the aging control group. (5) It is concluded that bone marrow mesenchymal stem cells promoted the repair of skull defects in the mice of different ages significantly via the tail vein injection, which mainly promotes bone regeneration by activating Sirt1 expression in mice.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, aging, skull injury, regenerative medicine, vein injection, Sirt1, tissue repair

中图分类号:

张静莹, 李自伊, 刘小川, 李丹, 王杨, 吴柱国. 尾静脉注射骨髓间充质干细胞修复衰老小鼠颅骨损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(25): 3944-3950.

Zhang Jingying, Li Ziyi, Liu Xiaochuan, Li Dan, Wang Yang, Wu zhuguo. Tail vein injection of bone marrow mesenchymal stem cells for repair of skull injury in aging mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(25): 3944-3950.

图/表（结果） 11

2.1 骨髓间充质干细胞的形态变化倒置显微镜下观察到原代提取的小鼠骨髓间充质干细胞在培养第3天时可见少量细胞贴壁且伸展为短梭形，见图1A，B。随着培养时间的延长，细胞数量不断增加，待传至第3代时细胞伸展为长梭形或多角形并融合成片，见图 1C，D。

2.2 各组小鼠大体情况小鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥0.2 mL，半小时后进入深麻醉状态；体积分数为75%乙醇消毒颅顶，剪开颅顶处皮肤及皮下筋膜层，暴露颅顶骨；采用牙科电动手机1 mm直径球钻制备1 mm直径圆形骨缺损，逐层封闭手术伤口；实验组尾静脉注射骨髓间充质干细胞悬液，对照组注射等量生理盐水，见图2。1月龄小鼠术后一两个小时苏醒，12月龄小鼠术后两三个小时苏醒，1 d后小鼠饮食正常，精神状态良好。术区无感染、无红肿、无溃疡，无小鼠死亡，术后1周小鼠伤口完全愈合。

2.3 Micro-CT检测结果 Mimics V17.0软件进行三维立体重建，通过ImageJ软件计算骨缺损区相对面积，术后1周各组小鼠骨组织缺损区面积大小：年轻小鼠实验组<衰老小鼠实验组<年轻小鼠对照组<衰老小鼠对照组；术后3周各组小鼠骨组织缺损面积减小，且骨髓间充质干细胞注射组骨组织缺损区域面积小于生理盐水注射组，缺损区域面积大小：年轻小鼠实验组<衰老小鼠实验组<年轻小鼠对照组<衰老小鼠对照组，见图3和表1。

2.4 苏木精-伊红染色结果术后1周，各组缺损区域均有纤维状组织生成；术后3周，各组缺损区域出现新生骨组织，骨髓间充质干细胞注射组新生骨组织量显著多于生理盐水注射组，且已有板状骨的基本形态，新生骨基质量比较：年轻小鼠实验组>衰老小鼠实验组>年轻小鼠对照组>衰老小鼠对照组，见图4。

2.5 Masson染色结果骨组织中的主要成分胶原蛋白被染成蓝色，见图5。术后1周，各组缺损区域均出现新生胶原蛋白纤维；术后3周，各组出现了新生骨基质形态，且无论对于年轻小鼠还是衰老小鼠，骨髓间充质干细胞注射组的新生骨基质均多于生理盐水对照组，且骨质致密。此外，胶原蛋白染色显著增加，年轻小鼠对照组胶原蛋白(蓝色)表达多于年轻小鼠实验组，这是由于年轻小鼠对照组尚处于骨形成的早期阶段，胶原蛋白表达较多，而年轻小鼠实验组已经形成较多的骨基质，结果说明，尾静脉注射小鼠骨髓间充质干细胞有利于促进不同年龄段的骨缺损修复。

2.6 非线性光学显微镜检测结果利用多波长激光共聚焦原位高分辨拉曼成像系统对小鼠颅骨样品进行检测，FV10-ASW4.2软件进行三维立体重建，绿色荧光强度反映骨缺损区域胶原生成情况，见图6和表2。

术后1周，年轻小鼠实验组缺损区域的胶原蛋白荧光强度与年轻小鼠对照组比较无显著差异，衰老小鼠实验组缺损区域的胶原蛋白荧光强度低于衰老小鼠对照组；术后3周，年轻与衰老小鼠实验组缺损区域的胶原蛋白荧光强度显著高于对照组(P < 0.000 1)，组间胶原蛋白强度比较：年轻小鼠实验组>年轻小鼠对照组；衰老小鼠实验组>衰老小鼠对照组，结果表明尾静脉注射骨髓间充质干细胞促进不同年龄段小鼠骨缺损区域胶原蛋白生成。
2.7 Sirt1免疫组织化学染色结果利用免疫组织化学染色检测骨组织样本成骨细胞中Sirt1蛋白的表达，见图7和表3。

术后1周，各组骨缺损处均出现了棕黄色Sirt1蛋白阳性表达(图7红色箭头所指棕黄色区域)，通过ImageJ软件处理图像可得出阳性区域面积，术后1周，相同年龄段小鼠对比，衰老小鼠实验组Sirt1蛋白表达高于衰老小鼠对照组(P < 0.000 1)；而年轻小鼠实验组的Sirt1蛋白表达低于年轻小鼠对照组(P < 0.001)；不同年龄段小鼠对比，年轻小鼠的Sirt1蛋白表达高于衰老小鼠(P < 0.000 1)；术后3周，各组Sirt1蛋白阳性表达降低，相同年龄段(1月龄或12月龄)小鼠实验组Sirt1蛋白表达低于对照组(P < 0.001-0.000 1)；对于不同年龄段而言，年轻小鼠实验组Sirt1蛋白表达高于衰老小鼠实验组(P < 0.000 1)，而年轻小鼠对照组Sirt1蛋白含量低于衰老小鼠对照组(P < 0.001-0.000 1)。
2.8 生物相容性间充质干细胞因具有多向分化潜能、免疫原性低等优势，成为细胞治疗和组织工程的研究热点。研究证实，将异体骨髓间充质干细胞通过肌肉和尾静脉途径注射到大鼠体内，大鼠未出现明显的炎症及免疫反应，表现出较好的组织相容性[11-13]。

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引言

骨骼是一种复杂的组织，具有独特的性质，例如结构致密、解剖复杂、生长缓慢、功能负荷等，其损伤修复一直是临床治疗的难点[1]。近年来，骨组织工程技术的发展和进步为骨组织再生修复提供了较好的解决方案，成为骨组织缺损修复最有潜力的治疗策略之一[2]。但是，基于生物材料的组织工程方法由于生物材料与骨组织结合不佳和不能激活复杂的内源性组织愈合过程，治疗效果并不十分令人满意[3]。大块骨缺损的愈合机制受到多种诱导因子的调控，包括前期成骨细胞的活性调节和后期骨形成调控。因此，全身的功能状态是不容忽视的重要方面。随着老龄化社会的到来，由于肿瘤、创伤、炎症、牙周疾病等原因引起的老年患者骨组织缺损问题，变得日益严峻。衰老以身体功能的整体、渐进、功能性下降为特征[4]，老年人骨组织缺损愈合能力显著低于年轻人，目前研究认为其机制包括巨噬细胞与间充质干细胞之间的相互作用发生改变[5]；绝经后女性雌激素水平降低以及骨髓的转变[6]；在衰老过程中，骨髓从红骨髓转变为脂肪黄骨髓等[7]，虽然其具体机制尚未完全阐明，但是研究结论均与衰老相关。因此，对于老年患者的骨组织缺损修复问题，全身功能状态的改变也许是更应该关注的科学问题。
干细胞应用于骨组织修复的研究已经有较长的时间[8]，其不仅有自我更新和多向分化潜能，而且能够分泌生物活性分子和调节宿主其他细胞的行为，间充质干细胞与巨噬细胞之间具有交互作用，在骨愈合过程中起到关键作用[9]。干细胞直接注射的方法是将有效剂量的细胞通过静脉或动脉注射途径，使干细胞广泛分布在机体各处，从而达到治疗作用[10]。该研究从1周龄幼鼠骨髓中提取骨髓间充质干细胞，经过传代纯化后，以1×1010 L-1的细胞浓度通过尾静脉注射的方法输入小鼠体内，术后1，3周检测尾静脉注射骨髓间充质干细胞对年轻与衰老小鼠颅骨缺损修复效果的影响，并检测骨髓间充质干细胞注射治疗后不同年龄组长寿基因Sirt1表达的差异，为临床干细胞应用于老年患者骨组织缺损修复提供理论基础和治疗策略。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t法。
1.2 时间及地点实验于2020年1-12月在广东医科大学附属东莞第一医院口腔医学3D打印重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雌性清洁级健康昆明小鼠，1月龄40只，体质量(20±2) g；12月龄40只，体质量(35±2) g；1周龄15只，体质量(6.4±0.2) g，由广东医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK(粤)2015-0147。
1.3.2 实验试剂和仪器苏木精-伊红染液、改良Masson三色染色液(中国索莱宝公司)；Sirt1一抗(英国Abcam公司)；兔抗鼠二抗(中国伊莱瑞特生物科技股份有限公司)；DMEM完全培养基、胎牛血清 (美国Gibco公司)；青霉素-链霉素溶液(中国碧云天生物技术有限公司)；Trypsin-EDTA(美国Gibco公司)。牙科电动手机(型号90，中国佛山市山月医疗器械有限公司)；石蜡切片机(型号RM2235，德国徕卡公司)；Micro-CT(型号PLC_S7-200，德国西门子公司)；倒置显微镜及照相系统(型号IX73，日本奥林巴斯)；多波长激光共聚焦原位高分辨拉曼成像系统(型号XperRam35，中国ORIBA JY有限公司)。
1.4 实验方法

1.4.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养取1周龄昆明小鼠，使用3%戊巴比妥钠溶液按照150 mg/kg过量麻醉处死小鼠，体积分数为75%乙醇消毒，解剖分离股骨，放置于10 mm无菌培养皿中，以含0.1%青霉素-链霉素的1×PBS冲洗3次，5 min/次，剪开股骨两端，用PBS反复冲洗骨髓腔得到细胞悬液，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入3 mL完全培养基(体积分数为10%胎牛血清+100 U/mL青链霉素+1%谷氨酰胺+DMEM培养基)，吹打混匀，转移至新的6 cm培养皿，置于37 ℃、体积分数为5% CO2细胞箱培养，3 d后半量换液，待细胞融合度达到70%-80%进行细胞传代纯化，传至第3代时冻存细胞，以备后续实验使用。

1.4.2 动物实验取40只1月龄昆明小鼠作为年轻小鼠，40只12月龄昆明小鼠作为衰老小鼠，再分别随机分为年轻小鼠实验组、年轻小鼠对照组、衰老小鼠实验组、衰老小鼠对照组，每组20只。建立小鼠颅骨损伤模型，主要实验过程如下：称量小鼠体质量，用3%戊巴比妥溶液以0.02 mL/g剂量腹腔注射麻醉，体积分数为75%乙醇消毒，将皮肤至皮下筋膜层切开，暴露颅顶骨，于颅顶骨右侧距颅缝3 mm处作1 mm直径缺损区，手术过程中辅以生理盐水降温并冲去存留骨粉，逐层缝合皮下筋膜和皮肤，用体积分数为75%乙醇消毒手术切口，术后1，8，15 d实验组小鼠尾静脉注射0.2 mL骨髓间充质干细胞悬液(1×1010 L-1)；对照组小鼠注射等量生理盐水。术后肌肉注射40×104 U青霉素抗感染，连续注射3 d，清洁环境下单笼饲养，室温22-24 ℃，湿度60%，常规给水及饮食，小鼠可自由活动。
术后1，3周分别随机处死各组小鼠10只，分别用于micro-CT及组织切片，其中4只小鼠用于micro-CT检测后进行组织切片染色，3只小鼠用于拉曼成像系统扫描。眼科剪剪取小鼠颅骨骨片，用40 g/L多聚甲醛4 ℃浸泡固定24 h，组织样品进行Micro-CT检测、多波长激光共聚焦原位高分辨拉曼成像系统扫描，石蜡包埋切片进行苏木精-伊红及Masson组织病理学染色、Sirt1免疫组织化学染色分析。
1.5 主要观察指标 ①光学显微镜下观察小鼠骨髓间充质干细胞的形态；②Micro-CT检测骨组织缺损区域面积；③苏木精-伊红染色和Masson染色观察缺损区域新生骨基质和胶原纤维；④非线性光学显微镜检测缺损区域胶原蛋白荧光强度；⑤免疫组织化学染色观察Sirt1蛋白表达。
1.6 统计学分析应用GraphPad Prism 8统计软件分析，数据用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

创伤、感染或先天性畸形引起的骨缺损仍然是骨科领域的关键挑战之一[14]。传统的治疗方法包括自体骨移植、同种异体骨移植，面临供者有限、免疫排斥和二次创伤等不足，极大限制了骨缺损治疗的应用[15]。近年来，生物材料在骨修复领域备受关注[16-18]。磷酸钙作为一种生物相容性良好的无机材料，因其能够调节体内的钙离子与磷离子浓度而影响骨质矿化和具有成骨诱导性，被广泛应用于骨缺损支架材料的制备[19]；BOEHM等[20]通过制备聚磷酸钙碳纤维复合材料改善了骨填充物或支架材料的力学性能；CHEN等[21]将壳聚糖与羟基磷灰石通过化学改性制备得到复合材料，具有活性因子缓释性且可诱导骨髓间充质干细胞成骨分化，促进骨缺损修复；庄传记等[22]将骨形态发生蛋白9负载于胶原蛋白基材料中，提高了骨诱导能力及骨修复效果，然而单纯的生物材料难以激活内源性微环境，治疗效果并不十分理想。随着老龄化社会的到来，老年患者骨缺损问题日益严峻。衰老是身体功能下降的综合表现，具有渐进性、退行性和内在性[23]。尽管衰老的机制尚不完全清晰[24-25]，但是研究表明干细胞在抗衰老中起到关键作用，有助于维持身体的稳态和促进组织、器官的再生[26-27]，间充质干细胞因具有多向分化潜能、免疫原性低等优势成为细胞治疗和组织工程的研究热点[26]，目前间充质干细胞治疗骨缺损的方法有局部注射、复合载体支架填充等方法，对骨缺损修复有重要促进作用[28-30]。
有研究证实将异体骨髓间充质干细胞通过肌肉和尾静脉途径注射到大鼠体内，大鼠未出现明显的炎症及免疫反应，表现出较好的组织相容性[11-13]。DHIVYA等[31]制备了含有壳聚糖、聚磷酸钙和易变辉石复合支架，将间充质干细胞接种于支架上，发现复合支架有助于间充质干细胞的增殖和分化及骨组织修复。有研究将人脐带间充质干细胞和人骨髓间充质干细胞分别接种于磷酸钙水泥支架上，相对于单纯的支架材料，两种干细胞-支架材料复合物均显著促进骨组织新生和血管再生[32]，然而比较间充质干细胞对年轻和衰老机体骨缺损修复效果的研究尚未见报道。该实验构建了1月龄年轻小鼠和12月龄衰老小鼠的颅骨缺损模型，实验组通过尾静脉注射小鼠幼鼠骨髓间充质干细胞，对照组注射等量生理盐水，研究静脉注射骨髓间充质干细胞对不同年龄段小鼠骨缺损修复的影响。
目前间充质干细胞主要来源于骨髓和脐带组织，其中骨髓间充质干细胞在骨髓中大量存在，具有高度的自我更新能力和增殖能力，可旁分泌多种活性因子参与调节内源性微环境并介导免疫应答[22，26，33]，并可分化为成骨细胞，在骨形成、维持和重建中发挥着重要作用。目前骨髓间充质干细胞分离培养的方法主要有全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、免疫磁珠分选法、表型分离法和流式细胞仪分选法等。免疫磁珠分选法、流式细胞仪分选法、表型分离法存在分离过程复杂且价格高昂等缺点，应用受到限制。全骨髓贴壁法和密度梯度离心法是常使用的方法，其操作简单经济，获得目的细胞的效率较高[26]。该实验采用全骨髓贴壁法提取新生1周龄年轻小鼠双侧股骨中的骨髓间充质干细胞，再经传代纯化和扩增，这与文献报道的分离提纯方法一致[34-35]，待传至第3代时，光学显微镜下观察细胞形态均匀，呈长梭形或多角形，细胞增殖明显且融合成片，这与文献报道的典型细胞形态特征相符合[34-35]，在一定程度上说明成功提取了骨髓间充质干细胞。
由于间充质干细胞具有“归巢”特征，当组织损伤后，引入体内的外源性间充质干细胞趋于向损伤部位迁移。目前间充质干细胞向损伤部位归巢的具体机制尚不明确，但是影响间充质干细胞归巢的主要因素包括：移植途径、移植时间、移植细胞数量等。在移植途径中，动脉移植有增加毛细血管闭塞的可能性；局部移植有缺血缺氧致细胞坏死的风险，并且由于需要将间充质干细胞注射到靶器官周围，增加了手术的难度和操作的复杂性；静脉移植相对安全、简单。此外，间充质干细胞抗原性弱，能逃避免疫监视，与宿主组织及血液的生物相容性良好，直接用于组织修复及疾病治疗已有诸多报道[35-37]。因此，该研究通过尾静脉注射骨髓间充质干细胞研究其对不同年龄段小鼠骨组织修复的效果。实验选用了不同年龄段的小鼠，分别为1月龄年轻小鼠和12月龄衰老小鼠，将年轻小鼠第3代骨髓间充质干细胞通过尾静脉注射到颅骨损伤模型作为实验组，对照组注射等量的生理盐水。术后3周Micro-CT显示骨髓间充质干细胞注射组颅骨缺损区域面积均小于生理盐水注射组；术后3周苏木精-伊红和Masson染色结果显示骨髓间充质干细胞注射组缺损区域新生骨基质显著多于对照组；术后3周非线性光学显微镜检测显示骨髓间充质干细胞注射组缺损区域胶原蛋白荧光强度高于对照组。这些结果显示年轻小鼠和衰老小鼠的自身骨修复能力有限，骨髓间充质干细胞经尾静脉注射的方式有利于提高年轻小鼠和衰老小鼠的骨修复能力，这可能是由于骨髓间充质干细胞在骨缺损部位“归巢”聚集，在机体自身体液环境中有助于诱导骨髓间充质干细胞成骨分化，并且骨髓间充质干细胞旁分泌生物活性因子与周围组织微环境相互作用，营造出适宜的微环境共同调节细胞增殖和分化过程，有助于启动组织内源性修复，激发成骨细胞的活性和调控成骨机制，从而促进骨组织修复。
Sirt1是细胞存活的重要调节因子，在线粒体稳态、细胞衰老和细胞死亡等多种生物学功能调控中起着重要作用[38-39]。Sirt1蛋白表达增加可以延长细胞寿命，通过刺激多种通路蛋白促进骨祖细胞向成骨细胞分化并促进成骨细胞增殖及功能表达[40-41]。此外，有大量研究表明Sirt1 能够显著抑制炎性细胞激活，减少炎性因子的释放，改善间充质干细胞周围炎性环境，为间充质干细胞更好地发挥治疗作用奠定基础[42]。该实验通过免疫组化染色分析了损伤区骨组织中Sirt1蛋白含量，结果显示衰老小鼠骨髓间充质干细胞注射组在术后1周的Sirt1蛋白表达显著高于对照组，这说明尾静脉注射骨髓间充质干细胞到衰老小鼠体内可能刺激损伤区域产生Sirt1蛋白表达，而Sirt1蛋白表达升高可能抑制炎症反应，延长了骨髓间充质干细胞的寿命，并通过调节内源性微环境促进成骨细胞分化和骨组织形成，从而说明了尾静脉注射骨髓间充质干细胞有助于加速衰老小鼠骨再生的机制。但是，年轻小鼠骨髓间充质干细胞注射组的Sirt1蛋白表达少于对照组，而其骨修复效果优于对照组，这可能是年轻小鼠体内细胞增殖速度较快，免疫力较强，且骨髓间充质干细胞本身具有抗炎效果而使Sirt1蛋白受刺激表达减少；对不同年龄段小鼠而言，无论是注射骨髓间充质干细胞还是注射生理盐水，年轻小鼠的Sirt1蛋白表达均高于对照组，这可能归因于年轻小鼠的抗炎能力较强而使Sirt1蛋白分泌较多。此外，术后3周，各组Sirt1蛋白表达均显著下降，这可能是由于随着时间的延长，机体炎症损伤恢复导致的；对于相同年龄段，骨髓间充质干细胞注射组的Sirt1蛋白表达低于对照组，可能是骨髓间充质干细胞促进了骨组织修复与再生，炎症反应减少，Sirt1蛋白表达减少引起的，其具体机制尚有待进一步研究。
综上所述，实验以全骨髓贴壁法分离提取了年轻小鼠骨髓间充质干细胞，通过尾静脉注射的方式将其注射到1月龄年轻小鼠和12月龄衰老小鼠体内，研究其对不同年龄段小鼠尤其是衰老小鼠的颅骨缺损修复情况。Micro-CT、组织病理学分析及非线性光学检测结果说明骨髓间充质干细胞经尾静脉注射明显促进了不同年龄段小鼠颅骨缺损修复；免疫组织化学染色表明衰老小鼠骨髓间充质干细胞注射组在术后1周时Sirt1蛋白表达高于对照组，这在一定程度上说明了骨髓间充质干细胞尾静脉注射激活了衰老小鼠体内Sirt1表达而促进骨再生的机制。但由于静脉移植干细胞同时归巢于内脏器官，致使在缺损区域归巢率可能降低，因此在未来的研究中将会标记所注射的间充质干细胞，观察其分布及向损伤部位的聚集和存活情况，以更具体解释修复机制；同时对比同等细胞类型和细胞量的不同移植方式包括静脉注射移植、动脉注射移植和局部移植对损伤修复的影响，以期更能说明哪种注射方式更为安全有效。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

尾静脉注射骨髓间充质干细胞修复衰老小鼠颅骨损伤

Tail vein injection of bone marrow mesenchymal stem cells for repair of skull injury in aging mice

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