雌激素刺激下人牙周膜干细胞成骨分化及通路间的交叉串扰

doi:10.12307/2022.571

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (24): 3886-3891.doi: 10.12307/2022.571

• 牙髓及牙周膜干细胞 Dental pulp and periodontal ligament stem cells • 上一篇下一篇

雌激素刺激下人牙周膜干细胞成骨分化及通路间的交叉串扰

金珂1，吴晓玲2，罗小玲1，胥鹏飞1，徐晓梅1

1西南医科大学附属口腔医院正畸科，口颌面修复重建与再生实验室，四川省泸州市 646000；2阆中市人民医院，四川省阆中市 637400

收稿日期:2021-02-19 接受日期:2021-04-24 出版日期:2022-08-28 发布日期:2022-01-24
通讯作者: 徐晓梅，博士，副教授，西南医科大学附属口腔医院正畸科，口颌面修复重建与再生实验室，四川省泸州市 646000
作者简介:金珂，女，1994年生，四川省自贡市人，汉族，西南医科大学在读硕士，医师，主要从事牙周膜干细胞成骨和自噬相关研究。
基金资助:
四川省科技厅项目(2021YJ0151)，项目负责人：徐晓梅；泸州市人民政府-西南医科大学科技战略合作项目(2020LZXNYDZ06)，项目负责人：徐晓梅

Osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells under estrogen and crosstalk between the two pathways

Jin Ke1, Wu Xiaoling2, Luo Xiaoling1, Xu Pengfei1, Xu Xiaomei1

1Orofacial Reconstruction and Regeneration Laboratory, Department of Orthodontics, the Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 2Langzhong People’s Hospital, Langzhong 637400, Sichuan Province, China

Received:2021-02-19 Accepted:2021-04-24 Online:2022-08-28 Published:2022-01-24
Contact: Xu Xiaomei, MD, Associate professor, Orofacial Reconstruction and Regeneration Laboratory, Department of Orthodontics, the Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Jin Ke, Master candidate, Physician, Orofacial Reconstruction and Regeneration Laboratory, Department of Orthodontics, the Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the Project of Science and Technology Department of Sichuan Province, No. 2021YJ0151 (to XXM); the Science and Technology Strategic Cooperation Project between Luzhou Municipal People’s Government and Southwest Medical University, No. 2020LZXNYDZ06 (to XXM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
雌激素：是一类具有广泛生物学活性的类固醇类激素，是调节骨代谢和成骨诱导的重要影响因素之一。
Wnt/β-catenin信号通路：Wnt信号通路根据是否依赖β-catenin激活下游信号分子，分为经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路。经典Wnt信号通路即Wnt/β-catenin信号通路，它在进化中高度保守，参与调控细胞的增殖、凋亡等，胞浆中稳定存在的β-catenin是经典Wnt信号转导的关键。
Wnt/Ca2+信号通路：Wnt/Ca2+信号通路是非经典Wnt信号通路的重要组成部分。它的激活不依赖β-catenin，由Wnt5a类与Frizzed受体结合，在G蛋白介导下可上调细胞内Ca2+，激活下游信号分子而引起细胞效应。Wnt/Ca2+信号通路被证实可调控包括增殖、多向分化、衰老、凋亡等在内的多项细胞生命活动。

背景：以干细胞为基础的牙周组织再生工程为牙周病治疗提供了广阔前景。雌激素诱导的人牙周膜干细胞成骨分化与Wnt信号通路息息相关。
目的：探讨雌激素刺激下Wnt/β-catenin和Wnt/Ca2+信号通路对人牙周膜干细胞成骨分化的影响及通路间的交叉串扰。
方法：收集牙周状态健康的前磨牙，分离纯化培养人牙周膜干细胞，流式细胞仪检测表面标志物，茜素红和油红O染色检测成骨成脂分化潜能。取第3代人牙周膜干细胞，随机分为空白组、对照组、雌激素组、XAV939(Wnt/β-catenin通路抑制剂)组、L-690,330(Wnt/Ca2+通路抑制剂)组和XAV939+L-690,330组，除空白组外，其他组均进行成骨诱导培养。qRT-PCR和Western blot检测各组成骨标志物(Runx2、OCN)及Wnt/β-catenin和Wnt/Ca2+通路关键信号分子表达；Fluo-4荧光探针检测细胞内Ca2+浓度；碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性；茜素红染色检测成骨分化能力。
结果与结论：①胶原酶消化法分离纯化培养的人牙周膜干细胞呈纺锤形、多边形，流式检测显示其表现出类似间充质干细胞的免疫表型，且具有成骨成脂分化潜能；②10-7 mol/L雌激素可上调人牙周膜干细胞内Ca2+浓度、Wnt/Ca2+通路关键信号分子CaMKII和NLK基因及CaMKII蛋白的表达；③联合使用Wnt/β-catenin和Wnt/Ca2+通路抑制剂能有效抑制细胞成骨分化；④单独使用任一通路抑制剂会上调另一通路活性，但对细胞的成骨分化无显著影响；⑤结果表明，雌激素通过Wnt/β-catenin和Wnt/Ca2+信号通路诱导人牙周膜干细胞成骨分化，且两通路间存在交互串扰，共同促进人牙周膜干细胞的成骨分化。

https://orcid.org/0000-0003-2211-655X(徐晓梅)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 人牙周膜干细胞, 雌激素, 成骨分化, Wnt/β-catenin, Wnt/Ca2+, 串扰, 通路

Abstract: BACKGROUND: Periodontal tissue regeneration engineering based on stem cells provides a broad prospect for the treatment of periodontal diseases. Estrogen-mediated osteogenic differentiation in human periodontal ligament stem cells is closely related to the Wnt signaling pathway.
OBJECTIVE: To study the regulation of Wnt/β-catenin and Wnt/Ca2+ signaling pathways on estrogen-mediated osteogenic differentiation in human periodontal ligament stem cells, as well as the crosstalk between the two pathways.
METHODS: Premolars with healthy periodontal condition were collected to isolate and culture human periodontal ligament stem cells. Surface markers of the cells were detected by flow cytometry. The osteogenic/adipogenic differentiation potential was detected by Alizarin red S and Oil red O staining. The third-generation human periodontal ligament stem cells were randomly divided into blank group, control group, estrogen group, XAV939 (Wnt/β-catenin pathway inhibitor) group, L-690,330 (Wnt/Ca2+ pathway inhibitor) group, and XAV939+L-690,330 group. Except for the blank group, all other groups were cultured for osteogenic induction. qRT-PCR and western blot assay were performed to measure expression of osteogenic markers (Runx2, OCN) and key signal molecules of Wnt/β-catenin and Wnt/Ca2+ pathway. Intracellular Ca2+ concentration was evaluated by Fluo-4 fluorescent probe. Alkaline phosphatase assay was conducted to measure the alkaline phosphatase activity. Osteogenic differentiation potential was detected by Alizarin red S staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The human periodontal ligament stem cells isolated and purified by collagenase digestion were spindle shaped and polygonal. Flow cytometry proved that human periodontal ligament stem cells were of mesenchymal origin, and they also demonstrated the capacity to differentiate into osteogenic/adipogenic lineages. (2) Estrogen at 10-7 mol/L in the osteogenic medium can upregulate intracellular Ca2+ concentration, CaMKII and NLK gene expression and CaMKII protein expression of human periodontal ligament stem cells. (3) The usage of Wnt/β-catenin and Wnt/Ca2+ signaling pathway inhibitors can minimize osteogenic differentiation. (4) Inhibiting either of the two signaling pathways can increase crucial protein expression of the other pathway, which had no significant effect on the osteogenic differentiation of the cells. (5) In conclusion, estrogen through Wnt/Ca2+ and Wnt/β-catenin signaling pathways induces osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells. In addition, there is mutual compensation between the two pathways, thus working together to regulate osteogenic differentiation.

Key words: stem cells, human periodontal ligament stem cells, estrogen, osteogenic differentiation, Wnt/β-catenin, Wnt/Ca2+, crosstalk, pathways

中图分类号:

金珂, 吴晓玲, 罗小玲, 胥鹏飞, 徐晓梅. 雌激素刺激下人牙周膜干细胞成骨分化及通路间的交叉串扰[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3886-3891.

Jin Ke, Wu Xiaoling, Luo Xiaoling, Xu Pengfei, Xu Xiaomei. Osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells under estrogen and crosstalk between the two pathways[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(24): 3886-3891.

图/表（结果） 5

2.1 人牙周膜干细胞表面标志物及多向分化潜能鉴定结果倒置显微镜下观察，原代细胞在组织块贴壁培养约7 d后爬出，呈纺锤形或多角形，放射状生长。细胞数量逐渐增多，聚集成旋涡状，排列规律，形态均一，见图1A。纯化及传代培养后，人牙周膜干细胞呈聚集状生长，多层重叠，局部堆积成灶状，见图1B，C。流式细胞技术显示，表面抗原标志物CD90、CD29、CD146、STRO-1阳性率分别为99.25%，98.66%，79.45%，19.36%，而CD31、CD45阳性率为0.67%和0.23%，见图1D，证明细胞为间充质来源，不含淋巴系细胞或内皮细胞成分。成骨诱导培养21 d，茜素红染色观察到大量橘红色钙盐形成，见图1E。成脂诱导培养21 d，油红O染色可见细胞内脂滴数量明显增多，见图1F。

2.2 雌激素调控Wnt/Ca2+信号通路成骨诱导培养7 d后，Fluo-4检测见图2A，与空白组相比，对照组细胞内Ca2+浓度显著升高(P < 0.01)，雌激素组进一步上升(P < 0.01)。成骨诱导7 d后，对照组CaMKII和NLK基因表达水平较空白组显著升高，雌激素组进一步上升，差异有显著性意义，见图2B。CaMKII的蛋白表达水平与基因表达水平变化一致，见图2C。

2.3 Wnt/β-catenin和Wnt/Ca2+信号通路共同参与雌激素作用下人牙周膜干细胞成骨分化的调控成骨诱导7 d后，与雌激素组相比，L-690,330组和XAV939组碱性磷酸酶水平降低，但差异无显著性意义(P > 0.05)。L-690,330+XAV939组碱性磷酸酶水平明显低于雌激素组(P < 0.001)，见图3A。茜素红染色及定量分析得到了相似的变化，见图3B。
qRT-PCR检测成骨标志物Runx2和OCN的基因水平也得到类似结果：成骨诱导7 d后，L-690,330组和XAV939组的Runx2和OCN基因水平均低于雌激素组，但差异无显著性意义(P > 0.05)。而L-690,330 + XAV939组较雌激素组明显下降(P < 0.001)，见图4A。Western blot检测结果见图4B，L-690,330和XAV939组Runx2和OCN蛋白表达都低于雌激素组(P < 0.001)，而L-690,330 + XAV939组对成骨分化的抑制作用最强(P < 0.001)。

2.4 Wnt/β-catenin和Wnt/Ca2+信号通路间相互串扰与雌激素组相比，L-690,330组细胞内Ca2+浓度降低(P < 0.05)，XAV939组细胞内Ca2+浓度升高(P < 0.05)，L-690,330+XAV939组细胞内Ca2+降低(P < 0.01)，见图5A。qRT-PCR结果显示：L-690,330组CaMKII、NLK基因表达量明显低于雌激素组(P < 0.001)，但β-catenin基因表达量较高(P < 0.001)。XAV939组CaMKII和NLK基因表达量高于雌激素组(P < 0.01)，而β-catenin基因表达量低于雌激素组(P < 0.01)。L-690,330+ XAV939组与雌激素组相比，这3个基因的表达水平均较低(P < 0.001)，见图5B。

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引言

牙周病是一种牙周支持组织的慢性炎症性疾病，可能导致牙龈萎缩、牙槽骨丧失、牙齿松动等症状[1]。以干细胞为基础的再生工程研究在牙周病治疗中表现出良好前景[2]。牙周膜干细胞具有分化为成骨细胞、成牙骨质细胞等的多向分化潜能[3]，加之方便易得的特性，成为牙周再生工程中最有前景的种子细胞之一[4-5]。
雌激素是一类具有广泛生物学活性的类固醇类激素，对心血管系统、生殖系统、骨代谢等多方面都有影响[6]。作为调节骨代谢和成骨诱导的重要影响因素之一，临床试验证实雌激素治疗能改善骨密度、增加骨量，对改善绝经期妇女骨质疏松症状有良好效果[7]。雌激素可抑制成骨细胞凋亡，延长细胞寿命，从而改善其细胞功能；同时，破骨细胞中也存在雌激素的直接靶点，通过诱导破骨细胞凋亡和抑制RANKL介导的破骨细胞分化对其产生直接作用[8-9]。另外还有相当多的证据表明，雌激素可通过成骨细胞和T细胞介导对破骨细胞的间接作用[10-11]。课题组前期实验证实：经典Wnt/β-catenin信号通路对雌激素刺激下人牙周膜干细胞成骨分化产生促进作用，但对该通路的抑制并不能降低成骨相关标志物的表达[12]。
细胞信号通路间呈现复杂的网络状结构。作为非经典Wnt信号家族的成员之一，Wnt/Ca2+信号通路被证实可调控多种细胞生命活动，如细胞增殖、多向分化潜能、细胞衰老和凋亡等[13]。Wnt5a和Wnt11与Frizzled受体结合激活Wnt/Ca2+通路，导致包括IP3、Ca2+在内的某些细胞内信号分子短期内增加，从而激活下游钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII)，上调TAK1-NLK信号转导通路[14]，而NLK可通过磷酸化TCF/LEF转录因子抑制Wnt/β-catenin通路。现有研究证实，Wnt/Ca2+信号通路可调节干细胞的成骨分化[15]，而上调miR-26a-5p可通过直接作用于Wnt5a mRNA的3'端非翻译区，从而下调Wnt/Ca2+信号通路表达，有效抑制小鼠脂肪干细胞的成骨分化[16]。
由此，作者假设：在Wnt/β-catenin信号通路外，Wnt/Ca2+信号通路也参与了人牙周膜干细胞中雌激素诱导的成骨分化，两者相互影响，共同调节细胞成骨分化。该研究分别(或同时)使用2种通路抑制剂XAV939和L-690,330来研究Wnt/β-catenin和Wnt/Ca2+信号通路在雌激素刺激下对人牙周膜干细胞成骨分化的调控和交叉串扰，通过对雌激素介导成骨分化相关通路的研究，探讨促进牙周组织再生的调控机制，以期为雌激素在牙周病治疗、牙周再生工程中的运用提供实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞分离培养、鉴定，诱导细胞成骨分化，组间数据比较采用独立样本t检验和单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2018年6月至2020年6月在西南医科大学口颌面修复重建和再生实验室完成。
1.3 材料 12-14周岁患者因正畸需要拔除的健康前磨牙(由西南医科大学附属口腔医院口腔颌面外科门诊提供，获得患者及家属的知情同意)。α-MEM培养基(Hyclone，美国)；青霉素-链霉素溶液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA、Triton X-100(碧云天，中国)；Ⅰ型胶原酶(Biosharp，中国)；磷酸缓冲盐粉剂(PBS)(北京中杉金桥，中国)；地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸(Sigma，美国)；茜素红S染色液(1%，pH 4.2)、饱和油红O染色液(Solarbio，中国)；小鼠抗人的STRO-1、CD146、CD90、CD29、CD45、CD31流式抗体(BD，美国)；碱性磷酸酶染色试剂盒、碱性磷酸酶活性检测试剂盒(建成，中国)；Fluo-4荧光探针(Themor，美国)；总RNA提取试剂盒(天根，中国)；ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(TOYOBO，日本)；Fast qPCR Master Mix(生工，中国)；Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV939、Wnt/Ca2+通路抑制剂L-690,330(Abcam，美国)；Anti-CaMKII抗体(ab134041，Abcam，美国)； Anti-RUNX2抗体(ab76956，Abcam，美国)；Anti-OCN抗体(ab133612，Abcam，美国)；Anti-GAPDH抗体(PAB36269，BioSwamp，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 人牙周膜干细胞的分离、纯化培养和鉴定获得患者及家属的知情同意后，在西南医科大学附属口腔医院门诊部选择牙周状况良好，年龄在12-14周岁间的患者，因正畸需要拔除前磨牙，共20颗。冲洗干净表面血污后，用刀片将牙周膜从牙根中三分之一处刮下，用Ⅰ型胶原酶充分消化后，放入含有体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的α-MEM培养液中，置于37 ℃，体积分数为5%CO2细胞培养箱中培养。约7 d后，原代人牙周膜细胞爬出，每2 d换液1次，当细胞生长融合达到80%后，用有限稀释法分离纯化得到人牙周膜干细胞。选择第3代细胞用于后续实验。
将第3代人牙周膜干细胞与抗CD146、CD45、CD31、CD29、CD90和STRO-1的单克隆抗体共同孵育，进行流式细胞技术分析，鉴定细胞表面标志物。

将第3代人牙周膜干细胞(5×103/cm2)接种于6孔板中，当细胞聚合度达到70%-80%时，加入成骨诱导培养液，培养21 d后茜素红染色检测细胞成骨分化潜能。将第3代人牙周膜干细胞(5×103/cm2)接种于6孔板中，当接种细胞聚合度达100%时，加入成脂诱导培养液，培养21 d后油红O染色检测成脂分化潜能。

1.4.2 细胞分组选择第3代人牙周膜干细胞，随机分为6组。
①空白组：用体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的α-MEM培养液培养；②对照组：用含50 mg/L抗坏血酸、5 mmol/L β-甘油磷酸钠、100 nmol/L地塞米松的成骨诱导培养液培养；③雌激素组：用含10-7 mol/L雌激素的成骨诱导培养液培养；④L-690,330组：用含10-7 mol/L雌激素，0.05 mol/L L-690,330的成骨诱导培养液培养；⑤XAV939组：用含10-7 mol/L雌激素，5 mmol/L XAV939的成骨诱导培养液培养；⑥L-690,330+XAV939组：用含10-7mol/L雌激素，0.05 mol/L L-690,330，5 mmol/L XAV939的成骨诱导培养液培养。
1.4.3 成骨分化潜能鉴定将第3代人牙周膜干细胞(5×103/cm2)接种于6孔板中，当细胞聚合度达到70%-80%时，按上述方法分组培养7 d，茜素红染色检测细胞成骨分化潜能，显微镜下观察；然后用10%的氯化十六烷基吡啶提取茜素红后，使用多功能酶标仪检测570 nm波长处的吸光度值。
1.4.4 细胞内Ca2+浓度检测使用Fluo-4钙分析试剂盒进行细胞内Ca2+浓度检测。将第3代人牙周膜干细胞以5×106 L-1细胞浓度接种于6孔板，每孔2 mL，按上述方法分组培养7 d，吸除原培养液，用PBS轻轻荡洗细胞2次，加入Fluo-4检测液，37 ℃孵育30 min，倒置显微镜下观察，采集图片，用Image J软件进行图像分析。
1.4.5 碱性磷酸酶活性检测将第3代人牙周膜干细胞以5×106 L-1细胞浓度接种于6孔板，每孔2 mL，按上述方法分组培养7 d，使用碱性磷酸酶染色试剂盒、碱性磷酸酶活性检测试剂盒进行定性定量检测，用酶标仪检测520 nm波长处吸光度值。
1.4.6 RT-PCR检测相关基因表达将第3代人牙周膜干细胞以5×106 L-1细胞浓度接种于6孔板，每孔2 mL，按上述方法分组培养7 d，提取各组样本的总RNA进行反转录和PCR扩增。所用引物序列如表1所示。采用2-ΔΔCt法进行数据分析。

1.4.7 Western blot检测相关蛋白表达将第3代人牙周膜干细胞以5×106 L-1细胞浓度接种于6孔板，每孔2 mL，按上述方法分组培养7 d，吸去原培养液，加入RIPA蛋白裂解液，4 ℃冰上充分裂解细胞，将细胞刮入1.5 mL EP管中，超声破碎仪裂解细胞并4 ℃低温离心后，用BCA法测定各样本蛋白浓度。添加Loading Buffer溶液，混合均匀，100 ℃下持续10 min煮沸，分装后-20 ℃储存。总蛋白样品回温振荡混匀后上样，以120 V的恒压电泳45-60 min，当溴酚蓝染料跑到胶底部时即可终止电泳。转膜，封闭。将目的蛋白膜放进加有Anti-CaMKII、Anti-RUNX2、Anti-OCN、Anti-GAPDH稀释一抗液的孵育盒中，4 ℃孵育过夜，第2天取出一抗孵育后的膜，冲洗，室温孵育二抗1 h，孵育结束后，将膜置于全自动化学发光分析仪中检测，通过TANON GIS软件读取相关条带灰度值。
1.5 主要观察指标 ①空白组、对照组、雌激素组人牙周膜干细胞内Ca2+浓度和Wnt/Ca2+通路相关基因及蛋白的表达水平；②分别(或同时)使用Wnt/β-catenin和Wnt/Ca2+通路抑制剂后人牙周膜干细胞的碱性磷酸酶染色及定量分析，茜素红染色及定量分析；③分别(或同时)使用Wnt/β-catenin和Wnt/Ca2+通路抑制剂后人牙周膜干细胞的成骨相关基因及蛋白表达水平；④分别(或同时)使用Wnt/β-catenin和Wnt/Ca2+通路抑制剂后人牙周膜干细胞的胞内Ca2+浓度和Wnt/β-catenin、Wnt/Ca2+通路相关基因表达水平。
1.6 统计学分析采用SPSS 22.0进行统计学分析。各实验重复3次，数据以x±s表示，数据正态性检验及方差齐性检验满足后再通过独立样本t检验和单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用LSD 法和S-N-K法比较两两组间差异，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

讨论

Wnt信号家族依赖于各种受体或受体复合物，激活2种不同的信号通路：经典和非经典Wnt信号通路[17]。Wnt信号通路被证实对不同细胞具有不同的成骨分化作用，而这些通路并非完全独立，往往存在相互串扰和影响[18]。课题组前期研究发现，雌激素可以激活经典Wnt/β-catenin信号通路，并促进人牙周膜干细胞的成骨分化，而抑制该通路不会下调成骨标志物的表达[12]。于是作者假设非经典Wnt/Ca2+信号通路也参与调节了雌激素介导的成骨分化。
非经典Wnt信号通路主要由Wnt/PCP信号通路和Wnt/Ca2+信号通路组成。Wnt/PCP信号通路主要调节细胞运动，而Wnt/Ca2+信号通路对细胞的多种生命活动，如细胞增殖、多向分化潜能、衰老和凋亡进行调控[19]。Wnt/Ca2+信号通路的关键启动子Wnt5a和Wnt11与特异性受体Frizzled结合，导致包括Ca2+在内的某些细胞内信号分子增加[13]，随后激活下游信号因子CaMKII。此外，CaMKII的激活可上调TAK1-NLK信号转导通路，而NLK可通过磷酸化TCF/LEF转录因子抑制Wnt/β-catenin通路的表达[14]。
研究显示，雌激素可以直接或间接促进细胞内Ca2+转运[20]。在该研究中，雌激素诱导成骨培养7 d后，细胞内Ca2+浓度和CaMKII、NLK的基因表达增加，CaMKII的蛋白水平也有所增加，表明雌激素对成骨分化具有积极作用，同时也促进了Wnt/Ca2+信号通路的表达。
实验使用选择性抑制剂XAV939和L-690,330进一步探索2种信号通路的作用。XAV939通过稳定Axin来促进β-catenin的降解，可选择性抑制β-catenin介导的转录，是Wnt/β-catenin信号通路的小分子抑制剂[21]。同时，双磷酸盐化合物L-690,330可以阻断Frizzled-2触发的细胞内Ca2+释放，竞争性抑制肌醇单磷酸酶，有效抑制Wnt/Ca2+信号通路[22]。该研究中，碱性磷酸酶、茜素红染色、Runx2和OCN基因检测结果显示，单独抑制Wnt/Ca2+信号通路或Wnt/β-catenin信号通路并不能显著下调人牙周膜干细胞的成骨分化，而同时抑制会导致Runx2和OCN成骨分化能力下调；Western blot结果显示共同抑制2种信号通路会得到最大程度的成骨抑制效果。也就是说，对Wnt信号通路的抑制作用可以减弱诱导成骨分化的效果，但这种削弱效果在2种信号通路都抑制的情况下得到最好表达。
虽然2种信号通路都在雌激素介导的成骨分化中扮演角色，但他们之间或许存在交叉串扰，共同调控成骨分化发生。在该研究中，Ca2+浓度的变化和CaMKII、NLK、β-catenin的基因表达量均提示L-690,330能有效阻断Wnt/Ca2+信号通路。抑制Wnt/Ca2+信号通路后，Wnt/β-catenin信号通路被激活。XAV939抑制Wnt/β-catenin信号通路，激活Wnt/Ca2+信号通路。这或许表明2种信号通路在雌激素介导的人牙周膜干细胞成骨分化中存在相互补偿的关系，任一通路的下调会补偿性上调另一通路表达，以维持诱导成骨分化的效果。
Wnt5a种类蛋白作为非经典Wnt信号通路的关键因子之一，可以使细胞黏附降低，从而拮抗被认为是经典Wnt/β-catenin通路启动蛋白的Wnt1类蛋白[23]。同时，Wnt3a和白细胞介素1引起的Ca2+浓度增加，会导致与质膜相关的AnxA6上调，进而导致Wnt/β-catenin信号通路受到抑制[24]。此外，有研究表明，酪氨酸激酶2 (Pyk2)对Wnt3a的激活发挥了显著作用，在诱导人神经祖细胞分化过程中，协调Wnt/β-catenin和Wnt/Ca2+信号通路间β-catenin的稳定，并有助于β-catenin转运至细胞核[25]。结合该实验结果，后续研究可以从沉默Wnt/β-catenin、Wnt/Ca2+通路关键基因(β-catenin、CaMKII、NLK)入手，通过对成骨相关基因及蛋白表达水平检测，验证雌激素刺激下分别(或同时)下调2种信号通路表达后细胞成骨能力的变化，从而进一步证实Wnt通路及通路间串扰在上述调控中存在的作用。同时，质谱分析作为蛋白质组学的重要研究手段[26]，筛选出雌激素刺激下成骨诱导培养后表达上升的Wnt家族蛋白，通过对关键蛋白的进一步研究，探讨2种信号通路在诱导细胞成骨分化中的作用及相互串扰。
关于雌激素调节骨代谢的研究显示，绝经期妇女体内雌激素水平下调不仅会影响全身骨量，对牙槽骨形成及骨密度高低也有显著影响[27]。雌激素替代治疗可以通过改善牙槽骨骨量，减少附着丧失等，对绝经期妇女的牙周状况进行改善[28]，接受替代治疗的患者缺失牙数目也明显减少[29]。此外，姚丽等[30]学者关于雌激素替代治疗绝经期伴骨质疏松牙周病的研究显示，雌激素替代疗法对此类患者牙周系统的疗效改善与对照组比较差异无显著性意义。现有研究对雌激素运用于牙周治疗及牙周组织改建的探究尚不明确，而对雌激素诱导人牙周膜干细胞成骨分化机制的探索可以进一步揭示雌激素在骨代谢调节中的具体作用，以期为调节雌激素水平优化骨生成、骨改建，以及雌激素运用于临床牙周组织再生治疗提供新的思路。
综上所述，Wnt/Ca2+信号通路和Wnt/β-catenin信号通路共同参与雌激素作用下人牙周膜干细胞成骨分化的调控，两通路间存在交叉串扰。该研究探讨雌激素微环境下人牙周膜干细胞成骨分化的调控机制，为基于干细胞的牙周组织再生工程研究提出了新的思路和挑战。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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雌激素刺激下人牙周膜干细胞成骨分化及通路间的交叉串扰

Osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells under estrogen and crosstalk between the two pathways

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