超高精度小鼠彩色断层数据集的建立

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.20.010

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
规则断面法：一种连续切片图像三维重建的配准方法。特点在于取材时将组织修成固定的形状，其平面通常与切片方向垂直。切片时，每张切片都会出现位置与形状固定的边缘，以此边缘为标志手工进行裁剪，配准。该方法操作简单，适用于体积较大的实质器官的配准，也可用于空腔脏器及整器官重建。
改良Kawamoto’s方法：一种由日本Kawamoto教授发明的大型标本冷冻包埋、切片、染色及封固方法。其能够有效减少标本的裂缝、冰晶破坏，并且能够对标本进行特殊染色。本文选取其标本制作及切片部分，主要包括己烷干冰速冻，5%羧甲基纤维素包埋。

摘要
背景：小动物成像及影像研究的广泛应用要求实验者掌握小鼠的断面解剖，小鼠鼻腔鼻窦等研究不能通过通常的活体解剖手段来获得其解剖知识。
目的：将现有的数字虚拟人技术应用于小鼠，建立一个超高精度的小鼠连续断层彩色数据集。
方法：将成年雄性Balb/c小鼠处死后褪毛，改良Kawamoto’s方法进行冰冻包埋，用Leica CM3600XP冰冻切片机以5 μm的层厚进行无间隔连续切片，采用2 400万像素Nikon D750单反相机连续拍摄断面图像，以JPG格式储存。参照规则断面法，使用photoshop7软件裁剪包埋块的边缘，并进一步校正图像大小、调整亮度和配准，以TIFF格式保存。将数据集导入Amira 6.0，用最小二乘法进一步配准，直接对小鼠进行面重建及体重建以判断数据集的质量。
结果与结论：①获取小鼠无间隔连续断面原始图像 6 034张，数据量87 GB，经过图像处理和配准，获得184 G小鼠断层数据集，重建了满意的小鼠三维模型；②基于研究采用的图像采集系统及处理流程，建立的虚拟小鼠数据集具有分辨率高、还原真实性强的特点，将方便实验小鼠精细解剖的研究，并为相关教学及实验研究提供了重要的工具。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0002-5949-3685(田俊)

关键词: 组织构建, 数字化骨科, 虚拟小鼠, 数据集, 三维可视化

Abstract:

BACKGROUND: With the extensive application of small animal imaging and imaging studies, it requires the investigators to master the cross-sectional anatomy of mice, but the anatomy of mouse nasal cavity and sinuses cannot be obtained through vivisection.
OBJECTIVE: To establish a highly precise serial colorful sectional image data set of mice using digital virtual human technology.
METHODS: An adult male Balb/c mouse was killed for freezing embedded using modified Kawamoto’s method and was then serially scanned at 5 μm of thickness by Leica CM3600XP cryostat microtome. The sectional images were photographed with a 24 million pixels Nikon D750 camera and stored as JPG files. All images were preliminarily registered by manually cropping the images based on the edge of block surface using software photoshop 7.0. Then, the image size, brightness and registration were corrected and adjusted, and the format of the images was unified as TIFF. The data set was imported to Amira 6.0 and was registered again with least square method. The quality of the data set was evaluated by three-dimensional reconstruction.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 6 034 original images with a size of 87 GB were captured. After cropping, adjusting and registration, the final size was 184 G. The mouse three-dimensional reconstruction model was satisfactory. To conclude, the data set established using the method and system mentioned above is characterized by high resolution and high-fidelity, which might facilitate the further study of the precise anatomy of mice and other fundamental experiments.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Anatomy, Cross-Sectional, Imaging, Three-Dimensional, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

田俊，贾越，何鹏飞，郭珏，靳荣秀，郭瑞. 超高精度小鼠彩色断层数据集的建立[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(20): 3170-3175.

Tian Jun, Jia Yue, He Peng-fei, Guo Jue, Jin Rong-xiu, Guo Rui. Establishment of a high-precision serial colorful slice image data set of mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(20): 3170-3175.

图/表（结果） 1

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引言

随着计算机技术和医学技术的迅猛发展，由信息技术、生物科学、医学互相交叉综合发展而来的数字化医学方兴未艾，在一定程度上甚至成为了当代医学持续发展的主要动力^[1]。最早的“数字化虚拟人”将尸体用特制切削成不同厚度的断层切片，通过照相采集相关数据后，在计算机里经过处理，重建人体三维结构，已经广泛应用于形态学及医学影像诊断学研究中。而以活体为信息来源，利用高分辨率CT\MRI等技术为数据采集方式的“数字人体”，因其能够实时观测人体的三维动态，为疾病的诊断和治疗提供了强有力的工具^[2-4]，与3D打印技术^[5-7]、机器人手术的深度结合^[8-9]，有可能成为未来医学的主要实践模式。

小鼠因其与人类在基因和生理上的相似性，繁殖速度快，以及可操纵其基因组来构建多种人类疾病模型的特性，是生物研究领域的一个最常用的实验对象^[10]。虽然小鼠是非常容易获得的实验动物，其解剖知识可以通过动物解剖来获得，但小动物成像及影像研究的广泛应用要求实验者掌握小鼠的断面解剖^[11]，对于一些小细微解剖结构，如鼻窦等，不能通过通常的解剖手段来获得其解剖知识。因此，将现有的数字虚拟人技术应用于小鼠，将为以小鼠为研究对象的相关基础实验提供基础。此前，美国科学家已获取了小鼠胚胎及成年小鼠的多例数据集，包括冰冻切片图像、PET、X-CT和micro-MRI等多种数据类型，并对心脏、脑等重要器官进行了重建^[12-14]。中国也有一些研究选择对小鼠的单个器官或组织构建数据集进行三维重建^[15-19]，但受限于固定方法、组织大小、切片工具的精度等，目前尚未发现小鼠整体超薄切片的数据集的相关报道。因此，本研究拟建立一个具有超高平面和空间分辨率的小鼠彩色断层图像数据集，基于此数据集三维重建的小鼠数字模型，将为小鼠解剖的精细研究及人类肿瘤学、遗传学、免疫学、传染性疾病和微生物等领域的研究提供更加精确的小鼠形态结构模型。

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材料方法

1.1 设计 单一样本观察。

1.2 时间及地点 实验于2016年4月至2017年1月在耳鼻咽喉头颈肿瘤山西省重点实验室完成。

1.3 材料 实验小鼠选择山西医科大学动物房饲养的SPF级健康60 d Balb/c雄性小鼠。

1.4 实验方法

1.4.1 标本处理 乙醚吸入麻醉、脱臼处死、脱毛(受包埋盒大小限制，去除小鼠尾部)。为避免固定剂对小鼠组织体积、颜色等的影响以及通常冷冻技术容易造成的组织断裂等不足，研究采用改良Kawamoto’s方法进行冰冻包埋^[20-23]：将标本迅速放入己烷干冰速冻，在金属包埋盒中倒入少量包埋剂(5%羧甲基纤维素并加入适量亚甲蓝)，将冰冻后的标本放入包埋盒中，再倒入包埋剂直至完全覆盖标本，之后迅速将盛有标本的包埋盒放入己烷干冰中，直至包埋剂和标本完全冻结后取出包埋盒放入-80 ℃冰箱备用。

1.4.2 数据采集系统及切片参数设置 CM3600XP (Leica，德国)全自动大型冰冻切片机沿轴位进行铣削，切片过程可由电脑自动控制，超精细机械及控制系统可实现最大450 mm×150 mm×200 mm的整体标本1-200 μm厚度均匀一致的切片(图1A)，切片刀为日本羽毛牌H45 L(角度45°)合金刀片。数字图像采集设备包括Nikon D750单反相机(2 400万像素)搭配AF-S尼克尔28-300 mm f/3.5-5.6 G ED VR镜头，并通过菲曼斯F4阻尼滑轨垂直固定于待切标本的正上方，柔光灯箱(50 cm×70 cm，内置4个60 W LED灯)由力飞灯架置于切片两侧照明(图1B)，优化后的拍摄参数为手动模式，光圈f/16，曝光时间1/30 s，感光度320。

切片机箱体温度设置为-30 ℃，将包埋盒从冰箱取出取下边框，其底座与切片机底托连接，待其温度与箱体温度相同后开始切片，通过主控程序将切片参数设置为层厚 5 μm，削切速度40 cm/s，撤回速度60 cm/s。相机通过手机软件Wireless Mobile Utility(Nikon，日本)无线遥控拍照 (图1C)，每切一次，检查手机显示屏核查对焦及切面情况，如遇碎屑可用软刷清扫标本表面，确认无误后拍摄，以精细JPG格式保存图像。

1.4.3 图像处理 将相机数据分次导入图形工作站Lenovo TS P700(联想，中国)运行Photoshop7.0(Adobe,美国)软件，以紫色包埋剂构成的包埋块的锐利边缘作为边界，综合运用旋转、裁剪等工具对图像进行处理，利用包埋块四壁整齐垂直的切面作为初次配准的依据(规则断面法)。再运用曲线工具调整图像亮度，统一所有图像大小为8 cm×4 cm(包埋块切面大小)，转为无压缩TIFF格式存储便于后续数据集导入常见的三维重建软件，相应操作可记录为动作进行批处理。将处理好的数据集导入Amira 6.0，用最小二乘法进行进一步配准，直接对小鼠进行面重建及体重建以判断数据集的质量。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

本研究通过改良Kawamoto’s大标本冷冻包埋方法、高分辨率单反相机图像采集设备及规则断面法处理，成功获得层厚5 μm、无间隔、分辨率17 μm/像素的超高精度冰冻成年小鼠彩色断层解剖数据集，精确的小鼠形态结构模型的构建是在小鼠体内进行遗传、药理、病理、免疫等实验研究的重要基础，基于小鼠超高分辨率断层数据集的小鼠精细三维解剖模型将有助于形态、生理及病理学研究的顺利进行。

本研究所采用的Leica CM3600 XP是超高精度全电脑控制的重型冰冻切片机，最大的特点在于能够对大尺度甚至超大尺度标本进行整体切片，最大可精细切割 450 mm×150 mm×200 mm的整体标本，精细而稳定的切割控制单元保证了切片厚度的均匀一致，并且能够根据需要选择不同的切割厚度切片厚度，最薄可达到1 μm，最厚为200 μm。该机器既弥补了普通小型切片机尺寸上的劣势，同时大大提高了普通铣切设备的精度，不仅应用于解剖学和形态学研究领域，而且可以应用于标记化合物作用的定量研究、医药品和生物化学品的临床前期研究。本次实验切片机搭配特制的碳化钨合金刀片，碳化钨是一种由钨和碳组成的化合物，硬度与金刚石相近，该刀片可以在保持切割的税利度和精确度的情况下，直接切割未经脱钙的含骨标本，极大地简单化了标本的制备流程。

火棉胶包埋法是制作断层解剖学标本最常用的方法^[24-26]，为了便于后期的断层切割，通常要求对标本进行脱钙处理。标本常用10%盐酸浸泡7-15 d脱钙处理，直至骨组织可以用针刺入时为止。常规脱水后的标本需要经过 5%，8%火棉胶梯度浸胶，最后以15%火棉胶包埋，包埋后的组织块还需要经过15-30 d的蒸发干燥时间才能最终切片。为了减少操作的时间，一些新的包埋剂和方法被用于包埋含骨组织成分的大尺度标本，如戴培东等^[27]利用不脱钙聚合物作为包埋剂，用骨切片机连续切片不脱钙颞骨标本，虽然较火棉胶包埋方法用时少，切片变形小，但包埋剂配制复杂，浸液与包埋时间仍需要8 d以上。同时，这些方法由于前期标本处理的过程复杂，时间较长，使得固定后的标本失去了原有的色泽。因此，本研究采用了一种较新的冰冻包埋技术，简化了操作步骤，极大的减少了标本处理的时间。同时，由于采用冰冻技术，与活体成像及传统体外成像系统相比，该数据集能够最大限度地接近小鼠活体的颜色，可提供传统灰度图像无法得到的细节信息及色彩对比，超高的分辨率使得基于该数据集建立的虚拟数字小鼠模型更为逼真，为小鼠解剖的教学、研究及以小鼠为实验对象的基础研究提供了便利。

本研究采用的包埋方法为改良Kawamoto’s方法^[20-21^，^28]，其优点在于通过快速冰冻可更好地保留活体组织的颜色及对比度，同时避免降温速度过快导致组织裂隙的产生，从而有效保证断面图像质量。

从2000至2012年，Kawamoto’s方法经过不断改良，技术流程不断优化，目前主要的方法为Kawamoto’s方法(2012版)，该方法不仅可以用于大型标本连续切片的断层解剖研究，而且可以对切下的标本进行苏木精-伊红染色，免疫组织化学和酶组织化学染色，通常搭配Leica CM3600 XP切片机使用，极大地拓展了该切片机的应用范围。

本研究主要采用了该方法的包埋切片技术。由于标本冷冻技术的不同，在通常的冰冻切片过程中，使用新鲜标本相对于采用固定后的标本进行冰冻切片裂缝更为明显，是冰冻切片技术天然的缺陷。本研究主要采用以下措施和试剂充分减少裂痕的产生：①将动物处死后迅速进行脱毛处理；②采用干冰乙烷作为速冻剂，既能够快速致冷，又避免冷冻过程剧烈形成大量的冰晶；③采用5%羧甲基纤维素作为包埋剂，将预冷的适量包埋剂倒入包埋盒；④将速冻的标本迅速置入包埋盒后再倒入剩余包埋剂；⑤将标本连同包埋盒全部迅速浸入乙烷干冰充分冷冻；⑥将标本移入冰冻切片机内并固定于切片架。采用该步骤，既保证标本的冷冻过程迅速而减少冰晶对组织的破坏，又可以避免使用液氮等强效制冷剂冷冻过程剧烈对标本的伤害。

此外，本研究在包埋剂中依据背景颜色的需要添加适量亚甲蓝注射液以加强背景和组织对比，方便后续图像标本与背景的识别、裁剪及分割处理。与其他染色剂相比，亚甲蓝不具有生物毒性，减少了整个过程中对操作者的危害性。

罗洪艳等^[29]报告解放军第三军医大学于2007年构建了1例小鼠的切片数据集，其中前600张图片的铣切厚度为 0.05 mm，之后图片的铣切厚度为0.1 mm，图像分辨率为4 064×2 704 (1 000万像素)。而本数据集整体铣切厚度为 5 μm(0.005 mm)，图像分辨率为6 016×4 016，统一图像大小和分辨率后的图像分辨率也达到了4 752×2 376，在铣切精度的一致性和分辨率方面均优于前者。

中国可视人采用Canon EOS-1Ds数码相机的分辨率为4 064×2 704(1 000万像素)^[30]，随着数码照像技术的飞快发展，本研究采用的NikonD750相机分辨率已达4 016× 6 016(2 400万像素)，相关成像质量控制系统也较前者大幅提高。相对于人体，小鼠的解剖结构更为细小，其横断面积远远小于人体，只有更高的图像分辨率才能够精细显示小鼠的显微结构。基于目前的相机配置，本系统已经能够较好地显示小鼠的精细解剖结构。同时，徕卡CM3600XP程控高精度大型冰冻切片机能够充分保证5 μm的切片精度，能够充分减少由于切片过程造成的组织损耗和信息丢失。此外，本研究通过安装相机的手机客户端软件，完全遥控操作照相机，在图像预览模式下，可在手机端对相机对焦、曝光和切面质量情况进行监控和调整，避免了直接操作相机引起相机的移位和按下快门时的震动，提高了图像采集参数的一致性和采集质量，与切片机电脑控制程序相结合，实现了断层图像信息的连续采集。

虚拟数据集的建立是一个系统工作，其质量受到标本制备、切片精度、图像分辨率、图像配准方法等多种因素的影响，实现二维图像的自动或手动配准是三维重建的关键步骤^[31-34]。

医学图像配准即通过空间变换的方法使两幅图像原本对应点达到空间位置上的再次吻合，配准的结果应使两幅图像上所有感兴趣的关键点或重要的解剖点达到匹配。目前通常根据标记点的建立方式将图像配准的方法分为两大类^[35-38]：①基于外部特征的图像配准(有框架)。使用不同的材料或方法在研究对象上设置标记点，这些标记点在不同的成像过程中均能够显示，成像后根据显示的标记点用自动、半自动或交互式进行图像配准。该方法能够获得较高的精度，不需要复杂的算法，配准时自动化程度高，但对标记物的选择和放置要求较高；②基于内部特征的图像配准(无框架)。根据目标图像本身固有的可识别的解剖点，相对运动较小的结构或图像内部体素的全部灰度信息特征进行配准。根据内部特征识别方式的不同采用了不同的算法，包括曲线，表面，差值，相干、互信息、基于小波变换以及软算法等^[39-45]。该方法是一种交互性方法，可以根据待配准图像的特点选择不同的算法以达到满意的配准效果，各种算法的实际应用效果通常需要有框架配准算法作为评估标准。

虽然各种新的算法不断出现，如何实现快速、自动、精确的图像配准在实际过程中仍未获得有效解决。本研究联合采用规则断面法和最小二乘法，完成二维图像的配准。规则断面法作为一种外定位方法，常应用于较大体积实质器官的图像配准^[46-47]，遗憾的是，这种方法依然需要手工操作，耗费大量的人力。本研究中，相机保持固定位置，且不能随意变焦，随着切片的进行，包埋块表面会持续下降，拍照后原本保持不变的包埋块区域图像的像素大小会逐渐变小，因此，应用规则断面法将包埋块边缘裁剪后，获得的图像大小并不统一。本研究通过以裁剪后的最后一张照片的像素大小及包埋断面的实际尺寸为标准，使用图像处理软件将标本图像统一大小，该过程同时实现了图像的初步配准。将数据集导入三维重建软件后，再使用最小二乘法进行软配准，对经过两次配准后的小鼠断面图像进行整体的初步三维重建，达到了精细重建的要求，为依托该数据集进行小鼠单个器官或组织重建的相关研究质量提供了保证。目前一些比较专业的医学三维重建软件已经开始增加真彩色（True color）功能^[48-52]，能够真实还原数据的色彩。本数据基于新鲜冰冻小鼠的断面图像，初步重建的模型非常真实，为后续基于最新技术的True color小鼠三维重建提供了基础。

综上，虽然该数据集的建立过程耗费了大量的人力，而且由于组织间本身对比度低而导致后续应用中图像分割可能存在一定的难度，但是，基于本研究采用的图像采集系统及处理流程所建立的小鼠数据集具有分辨率高、还原真实性强的特点，基于该虚拟小鼠数据集的进一步开发和利用，将方便实验小鼠精细解剖的研究，也为相关教学及实验研究提供了重要的工具。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程