不同剂量维甲酸诱导骨质疏松大鼠模型的稳定性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.20.009

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (20): 3164-3169.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.20.009

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不同剂量维甲酸诱导骨质疏松大鼠模型的稳定性

孙世栋¹，梁其彬²，范为之³，曾展鹏¹，陈柏行³

¹广州中医药大学第一附属医院创伤骨科，广东省广州市 510405；²广州市正骨医院骨科，广东省广州市 510045；³广州中医药大学，广东省广州市 510006

修回日期:2017-05-27 出版日期:2017-07-18 发布日期:2017-07-28
通讯作者: 曾展鹏，硕士，教授，硕士生导师，广州中医药大学第一附属医院一骨科，广东省广州市 510405
作者简介:孙世栋，男，1987年生，福建省厦门市人，汉族，2013年北京中医药大学毕业，硕士，医师，主要从事中西医结合骨伤方面的研究。
基金资助:
广东省科技计划项目(2014A020212593)

Different dosages of retinoic acid to establish a rat model of osteoporosis: a stability evaluation

Sun Shi-dong¹, Liang Qi-bin², Fan Wei-zhi³, Zeng Zhan-peng¹, Chen Bo-xing³

¹Department of Traumatic Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; ²Department of Orthopedics, Guangzhou Orthopedic Hospital, Guangzhou 510045, Guangdong Province, China; ³Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China

Revised:2017-05-27 Online:2017-07-18 Published:2017-07-28
Contact: Zeng Zhan-peng, Master, Professor, Master’s supervisor, Department of Traumatic Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
About author:Sun Shi-dong, Master, Physician, Department of Traumatic Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
the Science and Technology Program of Guangdong Province, No. 2014A020212593

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
维甲酸：体内维生素A代谢的中间产物，主要影响骨的生长和促进上皮细胞增生、分化、角质溶解等代谢作用。显著的药理活性之一是诱导表皮增生，使颗粒层和棘细胞层增厚。另一个重要作用是在表皮细胞分化后期通过影响K1、K10角蛋白酶解，影响丝聚蛋白原至丝聚蛋白过程及交联包膜形成促进表皮颗粒层细胞向角质层分化。
骨质疏松模型：建立理想的实验动物模型对骨质疏松的病因和治疗的研究有着重要的意义。文章选用雌性SD大鼠，运用维甲酸实行造模，方法简单实用，中等剂量可成功建立稳定的骨质疏松模型。

摘要
背景：骨质疏松严重危害老年人的健康和生活质量，建立理想的实验动物模型对骨质疏松的病因和治疗的研究有着重要的意义。
目的：通过不同剂量的维甲酸诱导建立大鼠骨质疏松模型，筛选出理想的造模剂量。
方法：将80只雌性SD大鼠按体质量随机分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，各20只。低剂量组、中剂量组和高剂量组分别以80，100，120 mg/(kg•d)维甲酸连续灌胃14 d。
结果与结论：与对照组相比，低剂量组大鼠骨密度、成骨细胞和破骨细胞计数及骨微观结构无明显变化，而中、高剂量组大鼠股骨骨密度、血清钙含量明显下降，股骨破骨细胞数量增加，骨微观结构明显发生改变，其中以中剂量组最为明显。结果说明100 mg/(kg•d)维甲酸灌胃14 d可诱导大鼠建立骨质疏松模型，且稳定性良好。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0002-9121-5458(曾展鹏)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 骨软骨损伤与修复动物模型, 骨质疏松, 雌性, 维甲酸, 苏木精-伊红染色, 骨组织形态计量学

Abstract:

BACKGROUND: Osteoporosis is a serious threat to the health and quality of life in the elderly. It is important to establish an ideal experimental animal model to study the etiology and treatment of osteoporosis.
OBJECTIVE: To establish a rat model of osteoporosis induced by different dosages of retinoic acid, thus selecting the optimal dosage.
METHODS: Eighty female Sprague-Dawley rats were randomly divided into control, low-, middle- and high-dosage groups based on body mass (n=20 per group), The rats in the latter three groups were induced with 80, 100, and 120 mg/(kg•d) retinoic acid via gastric lavage for 14 days.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the bone mineral density, number of osteoblasts and osteoclasts, and bone microarchitecture in the low-dosage group showed no significant changes, while there were significant decrease in the serum level of calcium and bone mineral density of femur, significant increase in the number of osteoclasts at the femur and significant changes in the femoral microarchitecture in the middle- and high-dosage groups, especially in the middle-dose group. To conclude, 120 mg/(kg•d) retinoic acid via gastric lavage for 14 days can induce a stable osteoporosis model in rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoporosis, Tretinoin, Animals, Model, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

孙世栋，梁其彬，范为之，曾展鹏，陈柏行. 不同剂量维甲酸诱导骨质疏松大鼠模型的稳定性[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(20): 3164-3169.

Sun Shi-dong, Liang Qi-bin, Fan Wei-zhi, Zeng Zhan-peng, Chen Bo-xing. Different dosages of retinoic acid to establish a rat model of osteoporosis: a stability evaluation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(20): 3164-3169.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量 观察分析80只建模大鼠，于造模结束时，共存活74只，实验期间未予补充样本量。其中6只死亡大鼠均来自高剂量组，组内存活14只，死亡原因初步考虑为维甲酸过量。

2.2 大体观察 对照组、低剂量组及中剂量组大鼠均精神活动良好，反应敏捷，毛发有光泽、柔顺，活动量正常。高剂量组大鼠造模3 d后发现大鼠精神一般，毛发粗糙，脾气暴躁；造模9 d后出现2只大鼠死亡，8只大鼠皮肤受损，将皮肤受损大鼠分笼喂养，造模9-14 d期间先后又有4只大鼠死亡，其余大鼠脾气火爆，打架频繁。

2.3 体质量 造模前4组体质量差异无显著性意义，造模14 d后低、中、高剂量组大鼠体质量均低于对照组(P < 0.05)，其中中剂量组大鼠体质量下降最为明显，低、中、高剂量组大鼠体质量差异无显著性意义(表1)。

2.4 骨密度 造模14 d后，中、高剂量组大鼠右后肢股骨骨密度低于对照组(P < 0.05)，且其中中剂量组骨密度下降较为明显(表2)。

2.5 血清钙含量 造模14 d后，低、中、高剂量组大鼠血清钙含量明显低于对照组(P < 0.05)，其中中剂量组血清钙含量最低(表3)。

2.6 成骨细胞及破骨细胞数量 造模14 d后，各组大鼠股骨成骨细胞数量接近(P > 0.05)，而中、高剂量组大鼠股骨破骨细胞数量明显高于对照组(P < 0.05)，且其中中剂量组破骨细胞数量最高(表4，图1)。

2.7 骨组织形态计量学结果 见表5，图2。造模14 d后，与对照组相比，高、中剂量组大鼠股骨骨小梁数目及骨小梁厚度明显减小，骨小梁分离度明显增加(P < 0.05)，其中以中剂量组在骨组织形态计量上变化最明显。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年1至2月在广州中医药大学实验动物中心完成。

1.3 材料

实验动物：SPF级雌性SD大鼠80只，鼠龄6-8周，体质量280-300 g，由广州中医药大学实验中心提供，许可证号：SCXK(粤)2013-0020。饲养于广州中医药大学实验动物中心，环境温度：(22±2) ℃，光照：150-200 lx，12 h/12 h明暗交替，相对湿度：50%-60%，噪声< 50 db，自由饮食。实验动物分笼饲养，每笼5只。本实验相关的各项操作符合广州中医药大学试验动物伦理委员会(批准号：2016050)规定的试验伦理守则。

主要试剂和仪器：乌拉坦购自国药集团化学试剂有限公司(批号：20150723)；维甲酸购自山西森佛试剂有限公司(批号：20150325)；水合氯醛(批号：20150325)购自国药集团化学试剂有限公司；12 cm手术用剪、10 cm眼用有齿镊购自上海金钟医疗手术器械厂；XR-36双能X射线骨密度测量仪、YB-6D型生物组织石蜡包埋机购自湖北孝感市亚光医用电子技术研究所、全自动生化仪购自美国Beckman公司；45角式系列台式低速离心机购自上海医疗器械有限公司手术器械厂；自动化图像数字化分析仪、YT-6C型生物组织摊烤片机购自湖北孝感市亚光医用电子技术有限公司；电子天平购自北京金志业仪器设备有限公司；YTG-5E型生物组织处理多用机购自湖北省孝感市亚光医用电子技术研究所；光学显微镜购自成都光学仪器厂；硬组织切片机购自广州医药工业研究所。

1.4 方法

1.4.1 动物分组 80只SD大鼠按体质量随机分为4组，对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，各20只。

1.4.2 骨质疏松模型建立 每日上午对照组给予蒸馏水 10 mL/kg，低剂量组给予维甲酸80 mg/(kg•d)，中剂量组给予维甲酸100 mg/(kg•d)，高剂量组给予维甲酸120 mg/(kg•d)，对大鼠连续灌胃14 d^[28-30]。

1.4.3 荧光标记所有雌性SD大鼠于造模前在右后肢股骨近端皮下注射盐酸四环素(50 mg/kg)，1次/d，连续2 d^[31-32]。

1.4.4 体质量测定 分别于造模前后对用电子天平各组大鼠进行体质量测定。

1.4.5 骨密度测量 灌胃14 d后，大鼠禁食禁水，称体质量，行腹腔麻醉(5%水合氯醛+12.5%乌拉坦1∶1混合溶液，5 mL/kg^[33])，取仰卧位，四肢展平固定在双能X射线骨密度测量仪上，测量大鼠右后肢股骨的骨密度。

1.4.6 血清钙水平测定 大鼠麻醉后，眼球摘除法取血，分离血清-20 ℃保存待用，用全自动生化仪测定血清钙的水平。

1.4.7 苏木精-伊红染色 分离大鼠右侧股骨，剥净软组织，选取中段长约1 cm的骨段，将骨段置于40 g/L多聚甲醛溶液4 ℃下固定24 h，后再将其置于10%的EDTA-2Na溶液脱钙(每两到三天更换1次脱钙液)。待骨质松软，针刺无明显阻力后表示脱钙完成。以骨段纵轴为中心剖开骨段，经系列乙醇脱水、透明、浸蜡，低熔点石蜡包埋。用全自动切片机切成厚度约5 μm的蜡片，将蜡片分别展于载玻片上，做好标记，置于干燥箱中，42 ℃烤片48 h。石蜡切片经2次二甲苯脱蜡，梯度乙醇下浸洗，Harris苏木精溶液染色15 min后水洗，蓝化，入1%伊红水溶液1 min，体积分数95%乙醇分色并上行至无水乙醇、二甲苯后，中性树胶封固。制作完成后用200倍光学显微镜，每个标本随机取个不重复视野，分別数出各种细胞的数目，取平均值代表该切片倍视野下的的平均细胞数目，采用BI 2000 医学图像分析系统协助进行骨形态计量学分析观察成骨细胞及破骨细胞数量^[34-36]。

1.4.8 骨组织形态计量学分析 分离大鼠左侧股骨，剥净软组织，选取中段长约1 cm的骨段，固定后逐级脱水，浸入3∶7的甲基丙烯酸甲酯中24 h[真空负压651.88 mm Hg (1 mm Hg=0.133 kPa)]，然后以半聚合甲基丙烯酸甲酯包埋制成实验标本。采用硬组织切片机，每个标本连续切6张10 μm和4张5 μm厚的不脱钙骨切片，其中5 μm薄片采用甲苯胺蓝染色检测^[37]，以普通光学显微镜进行观察，10 μm厚片用于荧光显微镜下观察测量，记录骨小梁的数目(mm^-1)；骨小梁的厚度(μm)；骨小梁的分离度(μm)。

1.5 主要观察指标 不同维甲酸浓度下大鼠体质量、血清钙水平、骨密度以及骨组织形态。

1.6 统计学分析 使用SPSS18.0软件包进行数据处理，实验数据用x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

骨质疏松的发生、发展和骨的代谢密切相关，虽然临床上通过合理的药物干预，可以适当减缓疾病的发展进程，但该疾病的发病机制尚未完全阐明，治疗上也未能有效根除，故对该疾病的基础研究仍十分有意义。而骨质疏松模型的建立，是研究骨质疏松症发病机制及相关治疗方案的前提基础。目前国内外骨质疏松动物造模的方法种类繁多，但并无统一的标准造模方案。文献阅读中，在筛选无创造模且具有一定理论基础的前提下，笔者通过对比多种骨质疏松动物造模方法，发现使用维甲酸造模诱导大鼠形成骨质疏松模型的方法较为简单易行，但相关文献对于维甲酸的使用剂量范围跨度较大^[38-56]，而在预实验中使用多数文献提及的所谓常规造模剂量[80 mg/(kg•d)]维甲酸对大鼠进行诱导造模时又出现造模失败的情况，故作者采用不同剂量维甲酸对SD大鼠实施造模，并直接采用临床观测指标进行观察评价，旨在寻找方法简单，成模周期短，且可靠稳定的造模方法。

在本次实验造模过程中发现，高剂量组[120 mg/(kg•d)]大鼠在造模期间精神一般，毛发粗糙，脾气暴躁，打架频繁，并先后发现6只大鼠死亡，死亡率为30%。而其余组别大鼠均未见死亡，且精神活动良好，反应敏捷，毛发有光泽、柔顺，活动量正常。因为实验大鼠均为同批购入，相同环境条件喂养，由相同实验人员行灌胃，仅在灌胃维甲酸浓度上存在区别，故考虑行为异常和死亡的原因可能为维甲酸过量。但由于实验受限，未能行死亡标本病例样本采集检查。经上述观察，虽然无法查明大鼠确切死因，但结果出现的高死亡率及大鼠的行为异常使作者认为120 mg/(kg•d)的维甲酸并非造模安全剂量范围。

在后续的研究中发现，造模14 d后低剂量组大鼠在骨密度、成骨细胞和破骨细胞计数及骨小梁数目、厚度、分离度上的变化与对照组大鼠相比，差异无显著性意义，仅在体质量和血清钙水平的下降方面差异有显著性意义。即在低剂量诱导下，模型组大鼠的实际骨量缺失与正常大鼠并无明显区别，说明80 mg/(kg•d)的所谓常规剂量无法进行大鼠骨质疏松诱导造模。综合这2项观察，推翻了既往研究中宽泛的70-120 mg/(kg•d)的维甲酸使用范围及 80 mg/(kg•d)的维甲酸所谓常规造模剂量的说法^[57-60]。

作者发现中剂量组和高剂量组大鼠股骨骨密度、血清钙含量、股骨破骨细胞数量以及骨微观结构方面均与对照组大鼠差异有显著性意义，认为这2种剂量组的维甲酸均可诱导骨指疏松造模成功。但中剂量组大鼠血清钙含量、成骨细胞和破骨细胞数量、骨小梁数目以及骨小梁厚度变化更为明显，且骨小梁分离度指标变化尤为突出。由于高剂量组大鼠死亡率较高，稳定性较差，造模成功率较低，故作者推荐以100 mg/(kg•d)的维甲酸为建立理想的骨质疏松大鼠造模剂量。

通过本次实验观察，中剂量组与对照组大鼠在股骨成骨细胞数量上的变化比破骨细胞数量变化差异小，说明维甲酸对破骨细胞的促进作用明显于对成骨细胞的抑制作用，导致骨的吸收明显，破坏了大鼠的骨形成与骨吸收偶联平衡。在骨组织微观结构病理改变上，骨小梁厚度及数量的明显下降和骨小梁分离度明显上升，最终导致骨量丢失造成骨质疏松。这些特点都与人类原发性骨质疏松症相类似^[38^，^61-62]，说明该法的造模大鼠可以更好的模拟人的骨质疏松模型，且本法操作简单、造模周期短、成模率高、稳定性好，是理想的骨质疏松实验动物模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

不同剂量维甲酸诱导骨质疏松大鼠模型的稳定性

Different dosages of retinoic acid to establish a rat model of osteoporosis: a stability evaluation

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