LARS人工韧带重建前交叉韧带：生物相容性及与骨组织的愈合

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.16.018

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
LARS人工韧带：是近年来使用较多的交叉韧带，该韧带最早于20世纪90年代出现，以聚对苯二甲酸乙二醇酯为原始材料，该材料设计时为平行纤维排列，能避免传统韧带等引起的纤维间摩擦，能为自体组织的生长提供更多的空间。
重建前交叉韧带损伤的移植物：早期临床上采用的前交叉韧带移植物有自体髌腱、自体腘绳肌腱等。自体骨虽然能满足手术需要，但长期疗效欠佳，并发症发生率较高。同种异体肌腱受到取材的影响，容易引起异物免疫排斥反应，增加感染传染性疾病风险。

摘要
背景：LARS人工韧带能避免传统韧带引起的纤维间摩擦，为自体组织生长提供更多的空间。
目的：探讨LARS人工韧带重建交叉韧带的生物相容性及与骨组织的愈合情况。
方法：将20只山羊随机分为2组，保留残端组仅切断前交叉韧带股骨止点；切除残端组切除前交叉韧带的股骨、胫骨止点，以及上、下止点间的全部韧带组织与表面滑膜组织，两组均植入LARS人工韧带。植入后20个月，影像学观察韧带修复情况，扫描电镜观察纤维组织情况，组织学观察新生韧带生长情况。

结果与结论：①影像学检查：CT检查显示，保留残端组股骨隧道扩大数显著高于切除残端组(P < 0.05)，胫骨隧道扩大数显著低于切除残端组(P < 0.05)；磁共振检查显示，LARS人工韧带位于股骨及胫骨隧道内和关节游离部分，在磁共振成像下T1、T2加权均为低信号，两组磁共振信号强度相同；②扫描电镜观察：两组均在LARS人工韧带之间存在明显的致密纤维组织，LARS人工韧带表面覆盖较多自体组织，高放大倍率下可见LARS人工韧带的自体纤维组织排列紧密、均匀；③组织学观察：苏木精-伊红染色显示，两组人工韧带在关节腔内游离部分和骨隧道内被大量自体组织包绕，呈长梭形排列，自体纤维组织整体与人工韧带包绕良好，呈无序排列，骨隧道部分与关节腔内游离部分存在成熟纤维组织，少量毛细血管浸润生长，未见坏死组织。Masson染色显示，两组LARS人工韧带骨隧道内部分和游离部分可见蓝色胶原包绕在人工韧带外部和内部，红染骨组织位于包裹胶原外部，未见明显过渡带；④结果表明：LARS人工韧带具备良好的生物相容性和纤维组织诱导能力，可促进骨组织愈合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0001-8999-4141(翟昕元)

关键词: 组织构建, 组织工程, LARS人工韧带, 重建交叉韧带, 生物相容性, 骨组织, 苏木精-伊红染色, Masson染色, 扫描电镜, 诱导能力, 湖北省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Ligament Advanced Reinforcement Sytstm (LARS) artificial ligament can avoid the interfibrillar friction compared wiht traditional ligaments, which is conductive for autogenous tissue growth.
OBJECTIVE: To investigate the biocompatibility of LARS artificial ligament used for cruciate ligament reconstruction and bone healing.
METHODS: Twenty goats were randomly divided into two groups: the anterior cruciate ligament insertion at the femur was cut as stump group; the anterior cruciate ligament insertions at the femur and tibia, and all the ligaments and synovial tissues between them were cut as stump resection group. LARS artificial ligament was then implanted into both two groups. At 20 months after implantation, the ligament healing was observed using CT and MRI examinations, the fibrous tissues were observed under scanning electron microscope, and the growth of newborn ligaments was observed by histological staining.
RESULTS AND CONCLUSION: CT findings showed that in the stump group, the number of femoral tunnel enlargement was significantly more than that in the stump resection group (P < 0.05), while the number of tibial tunnel enlargement in the stump group was significantly less than that in the stump resection group (P < 0.05). LARS artificial ligament in the femoral and tibial tunnel and free part of the joint presented with hypointensity on T1- and T2-weighted images, which showed no significant difference between two groups. Under the scanning electron microscope there were obvious dense fibrous tissues between LARS artificial ligaments in both two groups; and the autologous fibrous tissues arranged closely and evenly under high magnification. Hematoxylin-eosin staining results showed that in the two groups, the LARS artificial ligaments in the free part of the articular cavity and bone tunnel were surrounded by a large number of autologous tissues in a fusiform arrangement; autologous fibrous tissues and artificial ligament were wrapped well but arranged irregularly; mature fibrous tissues and few capillary infiltration were found in the bone tunnel and free part of the joint cavity, but without necrotic tissues. Masson staining results showed that the inner and outer parts of the LARS in the bone tunnel were wrapped by blue collagen, the red-stained bones located outside the collagen, and no obvious transitional zone appeared. These results showed that the LARS artificial ligament holds good biocompatibility and fibrous tissue induction, which can promote bone healing.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Anterior Cruciate Ligament, Prosthesis and Implants, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

翟昕元，林小风. LARS人工韧带重建前交叉韧带：生物相容性及与骨组织的愈合[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(16): 2565-2569.

Zhai Xin-yuan, Lin Xiao-feng. Reconstruction of the anterior cruciate ligament using Ligament Advanced Reinforcement System: its biocompatibility and bone healing[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(16): 2565-2569.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 20只山羊全部进入结果分析。

2.2 术后一般情况 20只山羊术后均未出现发热症状，切口愈合良好，膝关节无肿胀、积液，术后3周两组山羊活动度恢复正常，能负重行走，步态、步速正常；术后4周山羊恢复正常，能爬坡。

2.3 苏木精-伊红染色观察结果 植入后20周，两组LARS人工韧带在关节腔内游离部分和骨隧道内部均被大量自体组织包绕，包绕的组织为长梭形排列，少核的纤维组织，自体纤维组织整体与LARS人工韧带包绕良好，呈无序排列，骨隧道部分与关节腔内游离部分存在成熟纤维组织，少量毛细血管浸润生长，未见坏死组织，见图2。

2.4 Masson染色观察结果 不保留残端组Masson染色纤维组织与韧带关系关系模糊；保留残端组Masson染色能清晰地显示纤维组织与LARS人工韧带关系，在LARS人工韧带骨隧道内部分和游离部分可见蓝色胶原包绕在LARS外部和内部，红染骨组织位于包裹胶原外部，未见明显过渡带，见图3。

2.5 扫描电镜观察结果 扫描电镜下两组均在LARS人工韧带之间存在明显的致密纤维组织，LARS人工韧带表面覆盖较多自体组织，高放大倍率下可见LARS人工韧带的自体纤维组织排列紧密、均匀；剖面下LARS人工韧带光洁、边缘整齐，韧性、刚度良好，见图4。

2.6 影像学检查结果

CT检查：两组CT下股骨与胫骨的固定螺钉位置和角度均较好，且股骨侧钛螺钉在隧道内位置良好，未见伪影，见图5。保留残端组股骨隧道扩大数显著高于切除残端组(10，9，P < 0.05)，胫骨隧道扩大数显著低于切除残端组(8，10，P < 0.05)。

磁共振检查：LARS人工韧带位于股骨及胫骨隧道内和关节游离部分，在磁共振成像下T1、T2加权均为低信号，两组磁共振信号强度相同，LARS人工韧带与踝间窝顶、外踝内壁等未发生撞击，能促进骨组织愈合，见图6。

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引言

前交叉韧带损伤是临床上常见疾病，常用的移植物包括自体肌腱、同种异体肌腱、人工韧带等^[1]。早期临床上采用的前交叉韧带移植物有自体髌腱、自体腘绳肌腱等。自体骨虽然能满足手术需要，但长期疗效欠佳，并发症发生率较高^[2]。同种异体肌腱受到取材的影响，容易引起异物免疫排斥反应，增加感染传染性疾病风险^[3]。前交叉韧带损伤重建的目的主要是为了恢复膝关节的稳定性和功能，避免出现关节其他结构的继发性损伤^[4]。因此，手术过程中选择的移植物材料必须具备良好的生物相容性及可靠的力学性能。由于自体肌腱和同种异体肌腱移植后引起变性、坏死、血管化过程，移植物在体内需要经历由弱变强的过程，容易导致重建失败^[5-6]。

Ligament Advanced Reinforcement System(LARS)是近年来使用较多的交叉韧带，该韧带最早于20世纪90年代出现，以聚对苯二甲酸乙二醇酯为原始材料，该材料设计时为平行纤维排列，能避免传统韧带等引起的纤维间摩擦，能为自体组织的生长提供更多的空间^[7-8]。多数学者研究显示，稳定重建是保持术后膝关节功能的基本前提。国外学者进行了一次实验，实验中以LARS人工韧带作为移植物，观察术后组织生长情况，组织切片研究显示：LARS人工韧带与组织贴附情况较好^[9-10]。山羊作为大型动物膝关节损伤的典型动物模型，与人具有相似的解剖性，骨质条件也相对较好，手术相对简单，并且其生活环境相对清洁^[11-12]。

实验研究LARS人工韧带与前交叉韧带的匹配及骨愈合情况，探讨LARS人工韧带重建交叉韧带的生物相容性及与骨组织愈合情况。

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材料方法

1.1 设计 动物对比观察实验。

1.2 时间及地点 于2013年1月至2016年5月在三峡大学医学院动物实验室建立交叉韧带损伤重建模型。

1.3 材料

实验动物：取一两年龄山羊20只，雄雌不拘，体质量50-60 kg，由三峡大学医学院动物实验中心提供，实验过程中对山羊饲养、处理均符合《关于善待实验动物的指导性意见》相关规则^[13-14]，动物房温度为21-23 ℃，相对湿度为40%-60%；随机将山羊分为保留残端组(n=10)和不保留残端组(n=10)。

LARS人工韧带：法国LARS 公司产品，由聚对苯二甲酸乙二醇酯高分子生物材料构成，产品合格证号：L020802AC80R。配套LARS固定螺钉(钛制，产品号F110725 7×25)、人工韧带专用导引钢丝、人工韧带胫骨隧道定位器、人工韧带专用三层套管等^[15]。

1.4 实验方法

制备前交叉韧带断裂模型：①手术入路：采用单侧膝关节髌旁内侧入路逐层切开到关节腔，切除髌下脂肪，充分暴露前交叉韧带的胫骨段，保留残端组山羊仅切断前交叉韧带股骨止点；不保留残端组切除前交叉韧带的股骨及胫骨止点，将上、下止点间的全部韧带组织及表面覆盖的滑膜组织去除^[16](图1)；②建立胫骨隧道：选取胫骨转子内侧8 mm作为进入点，以前交叉韧带足印后方内侧踝间嵴前外侧作为出口，采用LARS人工韧带专用胫骨定位器进行定位，1.8 mm克氏针钻取隧道，LARS人工韧带专用平头空心钻(直径7 mm)沿着克氏针钻胫骨隧道；③确定股骨隧道：在踝间窝后壁前方5 mm，取10：30-11：00位置，将膝关节屈曲90°，采用克氏针钻通股骨，将针尖穿出皮下，并且沿着克氏针切开皮肤，套入LARS人工韧带专用三层套管完成软组织与股骨骨皮质的分离，采用LARS人工韧带专用平头空心钻(直径7 mm)沿着克氏针钻股骨隧道^[17-18]。

安装LARS人工韧带：采用LARS人工韧带专用阴道钢丝牵引套管，将LARS人工人道从胫骨隧道传入，从股骨隧道穿出，沿着引导钢丝带将LARS人工韧带从胫骨隧道向股骨隧道拉出，根据情况调整关节腔内韧带的自由编织部分的纤维长度，保持自由纤维外旋。采用LARS金属钛固定螺钉完成股骨部分的固定，拉紧人工LARS人工韧带胫骨端。在屈曲30°处拧入LARS金属钛固定螺钉自外向内固定胫骨，将剩余的人工韧带切除^[19]。

1.5 主要观察指标

影像学检查：在处死动物前，对两组山羊进行影像学观察。①CT检查：利用宝石能谱CT对金属螺钉、LARS人工韧带进行检查。高清模式显示软组织；单色模式清除金属伪影；②MRI检查：利用磁共振检测山羊术后人工韧带情况，确定术后是否发生并发症。

组织学观察：①苏木精-伊红染色：植入后20个月，两组各取山羊2只，腹腔注射过量苯巴比妥处死，取股骨、胫骨及中间人工韧带部分。假体外组织厚度不超过5 mm，使其易于被固定。将被检测组织固定在平衡液中7 d，采用梯度乙醇干燥，石蜡包埋，制备4 μm后切片，将其放置在载玻片上，苏木精染色10 min，梯度乙醇脱水，中性树胶封固，采集图像；②Masson染色：将制备切片经过梯度乙醇水化后，加入1滴Masson三色染色5 min，采用蒸馏水冲洗后加入1滴磷钼酸，5 min甩干，加入1滴苯胺蓝染色剂进行5 min染色。梯度乙醇脱水，中性树胶封固，采集图像^[20]。

扫描电镜观察：植入后20个月，两组各取山羊2只，取韧带植入部位，放置在体积分数3%甲醛溶液中固定48 h，采用蒸馏水在超声波仪内进行冲洗，将标本放入梯度乙醇中脱水，并将样本放入CO₂临界点干燥易的压力腔内进行干燥，对标本喷金后在扫描电镜下观察^[23]。

1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0统计学软件处理，计量资料采用x(_)±s表示，行t 检验，P < 0.05提示差异有显著性意义。

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讨论

前交叉韧带重建是前交叉韧带断裂主要方法，手术能满足韧带重建，但术后并发症较高，难以达到预期的治疗效果。以山羊作为大型动物建立膝关节实验模型，采用LARS人工韧带重建前交叉韧带，进一步确定构建的LARS人工韧带生物相容性及骨组织愈合情况。研究中，20只山羊术后均未出现发热症状，切口愈合良好，膝关节无肿胀、积液，术后3周两组山羊活动度恢复正常，术后4周山羊能爬坡。由此看出，采用山羊构建前交叉韧带能获得理想的稳定性，是比较理想的长期观测动物模型。

创伤等引起的前交叉韧带断裂主要表现为剧烈疼痛，并且会伴有不同程度的关节内出血、关节肿胀、功能障碍等。对于急性损伤患者发病后存在股四头肌保护作用，诊断时主要以前抽屉试验为主，并且多数患者为阴性。多数研究显示，前交叉韧带残端需要在手术中切除，从而能获得良好的手术视野，并且操作也更加准确、容易。有学者认为残端是引起膝关节术后伸直受限的主要原因^[22]。研究中，两组LARS人工韧带在关节腔内游离部分和骨隧道内被大量自体组织包绕，呈长梭形排列。由此看出，前交叉韧带并不是LARS人工韧带重建的绝对适应证，可获得良好的生物相容性和较好的组织再生能力。LARS人工韧带中部的平行开放编制纤维能呈纵向平行排列，并且各单独纤维之间无横向编织与交联，相互独立，这一特性能保证材料在纵向排列方向能获得更大的供自体组织长入空间，更加适宜自体组织的生长。同时，LARS纵向平行编织结构，由于无横向编织结构，因此，膝关节运动过程中不会产生横向的切割力和摩擦力，能避免韧带断裂，提高韧带寿命。并且为了适应膝关节的屈伸活动，LARS设计时轻度外向自旋，避免接触过密或过紧，材料具备良好的生物相容性，能促进骨组织愈合^[23]。研究中，扫描电镜下两组均在LARS人工韧带之间存在明显的致密纤维组织，LARS人工韧带表面覆盖较多自体组织，高放大倍率下可见LARS人工韧带的自体纤维组织排列紧密、均匀；剖面下LARS人工韧带光洁、边缘整齐，韧性、刚度良好。

但是，无论人工韧带材料如何发展，人工韧带使用过程中不可避免的会产生相应并发症，如滑膜炎、疲劳断裂等。尽管不同材料临床症状不同，但病理存在高度一致性。研究中，保留残端组股骨隧道扩大数显著高于切除残端组(P < 0.05)，胫骨隧道扩大数显著低于切除残端组(P < 0.05)；ARS人工韧带位于股骨及胫骨隧道内和关节游离部分，在磁共振成像下同下T1、T2加权均为低信号，保留残端组与切除残端组磁共振信号强度相同。由此看出，LARS人工韧带重建交叉韧带后容易引起关节液进入骨隧道内口。因此，手术时应密切观察期生命体征，加强术后锻炼，进一步改进设计，提高制造工艺^[24]。

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