骨骼肌缺血后调适动态pH测量及模拟酸灌注减轻缺血再灌注损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.16.017

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (16): 2558-2564.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.16.017

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骨骼肌缺血后调适动态pH测量及模拟酸灌注减轻缺血再灌注损伤

阮思杰，阳富春，阳茂春，刘军廷，胡峰，王静威

广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科，广西壮族自治区南宁市 530021

修回日期:2017-04-20 出版日期:2017-06-08 发布日期:2017-07-06
通讯作者: 阳富春，博士，教授，广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:阮思杰，男，1987年生，湖南省娄底市人，汉族，广西医科大学在读硕士，主要从事创伤修复与功能重建方面研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81260276)

Dynamic pH measurement in the skeletal muscle during ischemic postconditioning and simulated infusion with acidic perfusate to attenuate ischemia/reperfusion injury

Ruan Si-jie, Yang Fu-chun, Yang Mao-chun, Liu Jun-ting, Hu Feng, Wang Jing-wei

Department of Trauma Orthopedics & Hand Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Revised:2017-04-20 Online:2017-06-08 Published:2017-07-06
Contact: Yang Fu-chun, M.D., Professor, Department of Trauma Orthopedics & Hand Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Ruan Si-jie, Studying for master’s degree, Department of Trauma Orthopedics & Hand Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81260276

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
缺血后调适：又名缺血后处理或缺血后适应，组织经受长时间缺血后，在再灌注前，对组织进行数个短暂的再灌/缺血循环的处理，可有效减轻其缺血再灌注损伤。
RISK通路：再灌注损伤补救激酶通路(reperfusion injury salvage kinase，RISK)，其是一些可促细胞存活的激酶总称，包括ERK途径，PI3K/Akt途径，缺血预/后调适在再灌期间激活，可提供强大的保护作用，G蛋白偶联受体是其激活物，激活受体酪氨酸激酶，从而激活PI3K/Akt和ERKs等，对缺血再灌注损伤有保护作用。

摘要
背景：研究报道，心肌缺血后调适的保护是通过心肌再灌注初期维持3 min的酸中毒起到作用，而在骨骼肌方面是否有此作用尚不清楚。
目的：对大鼠骨骼肌缺血后调适过程进行动态pH测量，并模拟缺血后调适pH变化配置酸性灌注液输注，检测其对缺血再灌注损伤的影响。

方法：基于前期大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤建模方法和缺血后调适方案，运用光纤pH仪于主缺血期、4个循环30 s再灌/30 s缺血后调适操作期及其后再灌注期对大鼠骨骼肌进行pH连续测量，并用乳酸及生理盐水配置与缺血后调适期等pH灌注液备用。将25只健康成年雄性SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、缺血后调适组、乳酸酸灌注组、生理盐水组5组，每组5只。各组按其实验方案进行相应实验并抽血检测乳酸脱氢酶，取样腓肠肌测算湿/干质量比值、髓过氧化物酶及TTC染色测算梗死面积，取样右侧胫前肌行Western Blot检测MAPK通路关键蛋白Erk1/2的表达。

结果与结论：①缺血后调适于再灌注初期出现一个延长酸性平台，pH为6.81±0.133，时长为2 min 40 s。②乳酸脱氢酶、髓过氧化物酶、湿/干质量比值检测结果显示：缺血后调适组、乳酸酸灌注组明显低于缺血再灌注组(P < 0.05)；③Western Blot 分析显示：p-Erk的表达缺血后调适组、乳酸酸灌注组及生理盐水组均显著高于缺血再灌注组(P <0.05)；④TTC染色检测显示，缺血后调适组及乳酸酸灌注组梗死面积较缺血再灌注组明显减少(P < 0.05)；⑤结论：缺血后调适可维持再灌注初期短暂酸性状态；酸性灌注液可以有效模拟缺血后调适作用减少大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤。其机制可能通过Erk1/2磷酸化激活RISK信号通路而起到保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0003-1254-573X(阮思杰)

关键词: 组织构建, 组织工程, 缺血再灌注损伤, 骨骼肌, 缺血后调适, 动态pH, 酸灌注, Erk1/2, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Ischemic postconditioning protects the myocardium from ischemia/recursion injury via maintaining 3-minute acidosis initially. But its effect on the skeletal muscle remains unclear.

OBJECTIVE: To dynamically measure the pH values in rat skeletal muscle after ischemia, and then to simulate acidic perfusate infusion to investigate the effect of ischemic postconditioning on ischemia/reperfusion injury.

METHODS: Based on the ischemia/reperfusion injury model and ischemic postconditioning protocol in previous study, dynamic measurement of pH values in rat skeletal muscle was conducted using pH instrument at the global ischemia, ischemic postconditioning (30/30 seconds) and reperfusion period, and then the acidic perfusate equivalent to pH in ischemic postconditioning period was prepared with lactic acid and normal saline. Twenty-five healthy adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham, ischemia/reperfusion, ischemic postconditioning, lactic acid, and normal saline groups (n=5 per group). Blood samples were collected to detect lactate dehydrogenase level. The samples from gastrocnemius were harvested to calculate the wet/dry ratio, level of myeloperoxidase, and infarct size through triphenyltetrazolium chloride staining. The samples from the right tibialis anterior muscle were taken to detect the expression level of Erk1/2 in the MAPK signaling pathway by western blot assay.

RESULTS AND CONCLUSION: A prolonged acidic platform was detected in the early reperfusion during ischemic postconditioning, on which the pH value was 6.81±0.133, and the duration was 2 minutes and 40 seconds. The levels of lactate dehydrogenase and myeloperoxidase as well as the wet/dry ratio in the ischemic postconditioning and lactic acid groups were significantly lower than those in the ischemia/reperfusion group (P < 0.05). Western blot assay results showed that the expression level of p-Erk in the ischemic postconditioning, lactic acid and normal saline groups was significantly higher than that in the ischemia/reperfusion group (P < 0.05). Triphenyltetrazolium chloride staining results showed that compared with the ischemia/reperfusion group, the infarct area was significantly reduced in the postconditioning and lactic acid groups (P < 0.05). These findings suggest the existence of a short acidosis during ischemic postconditioning in the early reperfusion, and acidic perfusate can simulate the ischemic postconditioning and effectively attenuate ischemia/reperfusion injury in the rat skeletal muscle via activating Erk1/2 in RISK signaling pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Reperfusion Injury, Muscle, Skeletal, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

阮思杰，阳富春，阳茂春，刘军廷，胡峰，王静威. 骨骼肌缺血后调适动态pH测量及模拟酸灌注减轻缺血再灌注损伤[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(16): 2558-2564.

Ruan Si-jie, Yang Fu-chun, Yang Mao-chun, Liu Jun-ting, Hu Feng, Wang Jing-wei. Dynamic pH measurement in the skeletal muscle during ischemic postconditioning and simulated infusion with acidic perfusate to attenuate ischemia/reperfusion injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(16): 2558-2564.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 实验选用大鼠25只，分为5组，实验过程未有脱失。

2.2 缺血后调适pH动态测定结果 大鼠股动脉手术显露后，将玻纤pH探头植入腓肠肌，选取主缺血期酸中毒至稳定时段、缺血再灌注组缺血后再灌注pH值回复至正常稳定时段及缺血后调适组缺血后调适完成至pH回复正常时段进行连续测量，对比缺血再灌注组缺血后调适组会出现一个酸中毒延长稳定平台，pH为6.810±0.133，时长为2 min 40 s。见图1。

2.3 腓肠肌湿/干质量(W/D)比值 见表1，生理盐水组和缺血再灌注组相较假手术组的湿/干质量比值显著增高(P < 0.05)，说明骨骼肌前期缺血导致组织水肿明显；乳酸酸灌注组与缺血后调适组较假手术组差异无显著性意义(P < 0.05)，说明酸性灌注有效模拟缺血后调适作用，可有效减轻组织水肿。

2.4 骨骼肌TTC染色梗死面积结果 与缺血再灌注组相比，缺血后调适组及乳酸酸灌注组的梗死面积较缺血再灌注组明显减小，差异有显著性意义(P < 0.05)；而缺血后调适组和乳酸酸灌注组与假手术组相比，梗死面积虽然有所增大，但其差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图2，表2。

2.5 血浆乳酸脱氢酶检测 各组血浆乳酸脱氢酶检测结果见图3A。缺血后调适组及乳酸酸灌注组血浆乳酸脱氢酶活性与假手术组比较差异不明显(P > 0.05)，相较于缺血再灌注组显著降低(P < 0.05)，表明缺血后调适组及乳酸酸灌注组均可降低骨骼肌缺血再灌注所致的乳酸脱氢酶活性反应性升高，乳酸酸灌注组可以有效模拟缺血后调适对骨骼肌的保护作用。

2.6 腓肠肌髓过氧化物酶检测 各组血浆髓过氧化物酶结果见图3B。缺血后调适组及乳酸酸灌注组腓肠肌髓过氧化物酶活性与假手术组比较差异不明显(P > 0.05)，相较于缺血再灌注组显著降低(P < 0.05)，表明缺血后调适组及乳酸酸灌注组均可降低骨骼肌缺血再灌注所致的腓肠肌髓过氧化物酶活性反应性升高，乳酸酸灌注组可以有效模拟缺血后调适对骨骼肌的保护作用。

2.7 Werstern blot检测t-Erk1/2及p-Erk结果 与假手术组对比，其余各组中t-Erk1/2的表达量增加，但表达量差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4A。

p-Erk检测结果显示，与缺血后调适组及乳酸酸灌注组比较缺血再灌注组表达量增高明显(P < 0.05)，差异有显著性意义；而缺血后调适组与乳酸酸灌注组之间比较，缺血后调适组较乳酸酸灌注组表达增加，但差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4B。

故得出，乳酸灌注能有效模拟缺血后调适作用，通过激活p-Erk表达，激活MAPK通路，激活RISK信号通路，对缺血再灌注的骨骼肌起到保护作用。结果见图4，表3。

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引言

缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury，I/R injury)即组织细胞遭受一定时间的缺血再恢复血流后，组织细胞功能不但未得到恢复，损伤反而进一步加剧的现象，概念最早在1960年由Jennings等^[1]在心肌的研究中提出。后来证实缺血再灌注损伤也常发生在其他器官组织^[2-5]。骨骼肌相对其他器官研究较少，可能因为相较于心脏、脑组织等组织器官，骨骼肌被描述为具有相对缺血抗性，其代谢维持能力通常可以持续5-7 h，而人类骨骼肌约为2.5 h^[6]。然骨骼肌是运动系统关键的组织之一，其对缺血其实十分敏感^[7]，通过对手术缺血无再灌注时(15-90 min)活检超微结构研究显示，已有不可逆转的病理改变，尤其是重要的代谢细胞器(例如：线粒体)^[8]。在临床骨科中各种创伤、断肢再植、筋膜间隙综合征、止血带应用，都极易引起骨骼肌的缺血再灌注损伤^[9]。严重者可引起全身炎症反应综合征、截肢甚至多器官功能衰竭乃至死亡。

1986年Murry^[10]提出缺血预调适概念，即在心肌遭受反复短暂缺血/再灌循环后，可在后续的长期缺血中得到保护。缺血预调适可以增强心肌缺血耐受性并提供保护作用，但大部分再灌住损伤的不可预期性决定了缺血预调适临床运用的局限性，通过缺血再灌注损伤近几十年的实验研究，缺血后调适作为一种有效的保护措施^[11-14]，于2003年由zhao等^[15]首先在狗心脏上证实。缺血后调适定义为：组织经受长时间缺血后，在再灌注前，对组织进行数个短暂的再灌/缺血循环的处理，可有效减轻其缺血再灌注损伤。近年已有学者对骨骼肌缺血再灌注进行研究，发现缺血后调适同样能在骨骼肌上引发保护^[16]。尽管如此，缺血后调适操作本身的麻烦及其可能带来的潜在副损伤同样限制临床的广泛应用。有趣的是近年来有研究报道，心肌缺血后调适的保护是通过心肌再灌注初期维持3 min的酸中毒起到作用^[17]，而在骨骼肌方面未见类似报道。

基于前期优选的4个循环30 s再灌/30 s缺血大鼠骨骼肌缺血后调适方案及实验模型^[18]，实验采用精密光纤pH测量仪于缺血期、缺血后调适操作期及其后再灌注期对大鼠骨骼肌进行动态pH测量，并运用乳酸配置等pH值酸性灌注液，对缺血4 h的大鼠骨骼肌于再灌初期进行模拟酸灌注处理，通过检测组织学肌酶、炎症反应指标、RISK通路关键蛋白ERK1/2表达，验证其是否能有效模拟缺血后调适保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年2月至2016年9月在广西医科大学实验中心地点完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠25只，10周龄，体质量280-320 g，SPF级，由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK桂2014-0003。实验大鼠随机分为5组：假手术组、缺血再灌注组、缺血后调适组、生理盐水组、乳酸酸灌注组，每组5只。动物实验方案符合国家科技部2006年《关于善待实验动物的指导性意见》规定，并经广西医科大学第一临床学院医学伦理委员会审查批准。

1.3.2 试剂及仪器 Erk1/2，p-Erk一抗抗体购自abcam公司；GAPDH一抗抗体购自武汉华美生物技术公司；荧光二抗抗体购自Cell Signaling公司；2%TTC、乳酸购自北京索莱宝科技有限公司；乳酸脱氢酶试剂盒、丙二醛试剂盒购于南京建成生物有限公司；髓过氧化物酶Elisa试剂盒购自武汉华美生物技术公司；光纤pH仪器购于美国WPI公司。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤及缺血后调适模型的建立、pH动态监测及酸性灌注液的配制 模型制作参照前期实验研究^[18]。简单地说，大鼠麻醉备皮消毒后，于大腿根部作切口分离显露股动、静脉及神经；缺血再灌注损伤模型用无创血管夹夹闭股动脉使肢体远端组织缺血4 h，后松夹使之再灌注24 h；缺血后调适模型用同样方法使远端肢体缺血4 h，松夹后即施予4循环30 s再灌/30 s缺血操作(总时长为4 min)，随后再灌注24 h。股动脉夹闭时可观察到患肢鼠爪由粉红色转变为暗紫色确认缺血，松夹再灌注患肢鼠爪由暗紫色又转为粉红色确认血流恢复，并证实无血栓形成。

pH动态监测：实验前通过显微pH感应器连接装载pH Optica软件的电脑，用pH值分别为5，6，7，8的标准溶液对其进行校准。实验时将显微光纤pH感应头植入缺血再灌注组及缺血后调适组大鼠右下肢腓肠肌中，缺血后调适组对缺血期、缺血后调适操作期及其后再灌注期骨骼肌进行动态pH测量，生成图表及数值，对比缺血再灌注组得出缺血后调适组维持酸中毒的pH值及时间。

而后在pH仪器的监测下运用乳酸滴入生理盐水中配置等pH值酸性液体，以备后续实验灌注使用。

1.4.2 大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤及缺血后调适、酸性液灌注干预实验 手术、麻醉方法参照前期实验研究^[14]。假手术组同样作切口分离显露股动、静脉及神经后缝合；其余各组手术显露后皆用无创血管夹夹闭股动脉使肢体远端组织缺血4 h，缺血再灌注组松夹使之再灌注24 h；缺血后调适组松夹即施予4循环30 s再灌/30 s缺血操作(总时长为4 min)，随后再灌注24 h；乳酸酸灌注组于股动脉血管夹远端，输注酸性灌注液(酸性灌注液为乳酸在pH仪监测下微量滴入生理盐水，直至pH为6.81-6.82及输注时间等于缺血后调适操作期维持酸环境时长2 min 40 s，输注速度为正常大鼠股动脉血流速度^[19])，后松开血管夹使之再灌注24 h；生理盐水组于股动脉微量输注生理盐水，余同乳酸酸灌注组。术毕大鼠清醒后放置于鼠笼，自由饮食和饮水。

1.4.3 腓肠肌湿/干质量(W/D)比值检测 再灌注24 h后，分别取右后肢相应部位腓肠肌1 g左右，用万分之一电子天平称取湿质量后，置于80 ℃恒温烤箱烘烤24 h，直到组织恒质量，测其干质量，并计算湿/干质量比值。

1.4.4 腓肠肌梗死面积检测 于再灌注24 h后取材。切取小腿腓肠肌标本中部横切成2 mm薄片，0.1 mol/L PBS清洗3遍，置入2% TTC溶液中，37 ℃避光浸泡30 min，取出双蒸水清洗3遍。数码相机拍照，照片采用Image-Pro Plus 6.0软件计算梗死面积。梗死面积百分比(%)=梗死面积/横切片总面积×100%。

1.4.5 血浆乳酸脱氢酶检测 于实验开始前和再灌6 h时分别抽取股静脉血液约1 mL，置入离心转速为3 000 r/min的离心机离心10 min，取血浆分装于EP管，按照乳酸脱氢酶试剂盒说明对其进行检测。

1.4.6 腓肠肌髓过氧化物酶 再灌6 h后取右侧腓肠肌，冰盐水中洗去血液、吸干水分，分装于冻存管中，-80 ℃冰箱保存，待同批实验结束后，取肌肉组织加入匀浆介质液氮下匀浆，4 ℃、2 000 r/min离心，取上清，然后按照髓过氧化物酶Elisa试剂盒说明进行检测。

1.4.7 Werstern blot检测MAPK通路关键蛋白的表达及活性 再灌12 h取部分胫前肌样本检测MAPK通路关键蛋白Erk1/2及其磷酸化激活物P-Erk的表达及活性。提取骨骼肌组织总蛋白，匀浆裂解后，静置30 min，后4 ℃、12 000 r /min离心15 min，取上清液，部分分装行蛋白定量，余上清液-80 ℃保存。取上述蛋白提取液加上样缓冲液经100 ℃煮沸变性等处理后，进行凝胶电泳，将电泳分离后的蛋白质电转至硝酸纤维素膜上，其转膜条件300 mA、1 h。室温下5% BSA溶液封闭1h后加入Erk1/2、p-Erk1/2、GAPDH抗体(一抗浓度：GAPDH：1/5 000；t-Erk1/2：1/10 000; P-Erk1/2 1/10 000)，4 ℃环境过夜。TBST洗膜后，加入相应属种二抗(二抗浓度：1/10 000，37 ℃，60 min)；经TBST洗膜后使用Odyssey双色红外荧光成像系统扫描(Licor Inc、USA)，并用图像分析软件分析蛋白条带的积分吸光度值(integrated optical de生理盐水ity，IA，平均吸光度值×面积)，以目标蛋白/内参IA比值反映目标蛋白相对水平。

1.5 主要观察指标 ①缺血后调适pH值变化；②骨骼肌梗死面积；③MAPKs通路关键蛋白Erk1/2及磷酸化Erk1/2表达水平的检测；④干湿质量比(W/D)、血清乳酸脱氢酶浓度及骨骼肌髓过氧化物酶的检测。

1.6 统计学分析 SPSS 16.0统计学软件行统计分析，全部数据以x(_)±s表示，各组数据进行正态检验和方差齐性检验。各组之间数据进行方差分析，组间比较用SNK-q 检验，按照α=0.05检验水准，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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骨骼肌缺血再灌注损伤常见于断肢再植，肢体大血管损伤后，是临床需要解决的重大问题。无数实验证实缺血后调适对于缺血再灌注损伤是一种行之有效的保护措施。2007及2008年Cohen报道缺血后调适的保护机制与再灌注早期仍维持酸中毒密切相关并认为缺血后调适是通过再灌初期维持短暂酸中毒^[17^，^20]，在保护信号引出前使缺血再灌心肌线粒体通透转换孔维持关闭状态，从而起到心肌保护作用，并于2008年研究指出心肌缺血后调适的成功关键三点：①线粒体通透转换孔关闭；②再灌注早期酸度维持；③血氧的及时恢复。

目前为止pH变化在缺血再灌注损伤机制中的作用仍然不完全清楚。大致是：缺血期，由于缺血缺氧，细胞依赖于无氧代谢提供能量，细胞内乳酸、质子、NAD⁺大量堆积，细胞内pH值下降，细胞为了维持胞内pH稳态，开启Na⁺/H⁺交换(NHE)^[21-22]，导致细胞内Na⁺储留，启动Na⁺/Ca²⁺交换，致细胞内Ca²⁺大量囤积。再灌注早期，正常的血流灌注会使乳酸，二氧化碳，H⁺被迅速清除导致细胞外pH值回升，而细胞内H⁺不能及时的跨膜转运仍处于酸性状态，使得细胞内外出现pH梯度，钠-氢交换蛋白和钠-碳酸氢盐同向转运蛋白激活，促进了细胞的死亡，钙离子超载，肌肉兴奋收缩耦联障碍^[23]，且同时激活细胞死亡系统^[24]，使得MPTP开放，加重损伤。本实验基于前期优选的4个循环30 s再灌/30 s缺血的缺血后调适方案可以明显减轻骨骼肌缺血再灌注损伤^[18]，进一步对应用此缺血后调适方案作用于骨骼肌缺血再灌注保护过程进行pH连续测量，显示缺血后调适通过维持组织酸中毒一定延滞时间而对骨骼肌起到保护作用。在本实验检测中发现，4个循环 30 s再灌/30 s缺血的缺血后调适方案可以维持2 min 40 s酸中毒时间，此持续时间与Insert等^[25]在心肌方面的研究中缺血后调适初期维持酸中毒时间为3 min的报道基本一致。作者根据酸中毒时所测量的动态pH值数据，配置等pH值乳酸酸性灌注液，于再灌注开始前进行微量输注，维持组织内酸态。实验结果显示，酸性灌注液输注后可使Erk1/2的磷酸化增加，抑制乳酸脱氢酶、髓过氧化物酶生成，减少骨骼肌梗死面积，减轻组织水肿，可有效模拟缺血后调适对骨骼肌的保护作用。

缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注损伤的保护机制仍然不完全清楚。正常细胞内存在一些激酶信号系统，当发生缺血再灌注时，这些激酶被激活而抑制细胞的凋亡，称为再灌注损伤挽救酶 (reperfusion injury salvage kinase，RISK)，RISK通路首先于2002年由Schulman等在尿皮素能有效减少心肌缺血再灌注损伤梗死面积的实验中论证并命名^[26]。其中活化PI3K/Akt、p42/p44的细胞外信号调控路径ERKs^[27-28]，被认为起到关键性作用，这条通路通常被称为RISK通路。2004年Hausenloy等^[29]研究第一次证实RISK通路在缺血后调适中起着重要作用。目前认为RISK通路主要有PI3K和MAPK两条途径，且二条通路互相平行^[29]。其中MAPKs是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是激活细胞外信号引起细胞核反应的重要通路。其主要成员包括Erks、P38、JNK等。哺乳动物中ERK被视为最经典的细胞内信号转导途径，ERK1/2上游的丝裂原活化蛋白激酶-细胞外信号调节激酶1通过作用于酪氨酸激酶受体或G蛋白-偶联受体使ERK1/2发生磷酸化而激活，其在细胞分化、增殖和存活方面有重要的作用^[30]。RISK通路中Erk1/2路径的激活可以有效抑制MPTP在再灌注期的开放，其可能涉及机制有激活GSK3β，以及激活抗凋亡信号通路起到保护作用。

乳酸脱氢酶、髓过氧化物酶系反映骨骼肌组织损伤及炎症指标^[31]，乳酸脱氢酶存在于正常肌肉组织中，当骨骼肌受到缺血再灌住损伤时，则大量释放入血。同时存在于中性粒细胞中的过氧化物酶活性增强，诱导反应中性粒细胞浸润聚集，提示炎症的产生。后毛细血管因炎症刺激致通透性增高，血管内水及蛋白漏出，组织水肿，使湿/干质量比增加。实验结果显示，缺血后调适组及乳酸酸灌注组可有效减轻组织水肿，限制乳酸脱氢酶、髓过氧化物酶的生成，及减少梗死面积，表明酸灌注可以模拟缺血后调适对骨骼肌缺血再灌注损伤的保护作用。

综上所述，通过对缺血后调适灌注早期大鼠腓肠肌的活体进行实时动态pH测量，并用乳酸配置等pH酸性灌注液输注能模拟缺血后调适对骨骼肌的保护作用，显著减少骨骼肌缺血再灌注的损伤。其机制可能通过部分或完全激活RISK信号通路中Erk1/2，作用于MPTP限制其开放，从而发挥对骨骼肌抗缺血再灌注损伤的保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨骼肌缺血后调适动态pH测量及模拟酸灌注减轻缺血再灌注损伤

Dynamic pH measurement in the skeletal muscle during ischemic postconditioning and simulated infusion with acidic perfusate to attenuate ischemia/reperfusion injury

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