跑台运动干预膝关节软骨全层缺损修复

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.16.004

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (16): 2478-2483.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.16.004

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跑台运动干预膝关节软骨全层缺损修复

赵森泉¹，毛新润²

¹河北软件职业技术学院，河北省保定市 071000；²河北医科大学第二附属医院，河北省石家庄市 050000

修回日期:2017-04-22 出版日期:2017-06-08 发布日期:2017-07-06
通讯作者: 毛新润，硕士，主任医师，河北医科大学第二附属医院骨科，河北省石家庄市 050000
作者简介:赵森泉，男，1978年生，河北省保定市人，汉族，2002年河北师范大学毕业，讲师，主要从事体育运动方面的研究。
基金资助:
2016河北省医学科学研究重点课题计划项目(20160122)

Effect of treadmill exercise on the repair of full-thickness knee cartilage defects

Zhao Sen-quan¹, Mao Xin-run²

¹Hebei Software Institute, Baoding 071000, Hebei Province, China; ²the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China

Revised:2017-04-22 Online:2017-06-08 Published:2017-07-06
Contact: Mao Xin-run, Master, Chief physician, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China
About author:Zhao Sen-quan, Lecturer, Hebei Software Institute, Baoding 071000, Hebei Province, China
Supported by:
the Key Medical Research Program of Hebei Province in 2016, No. 20160122

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
膝关节半月板软骨缺损：膝关节半月是一种月牙状纤维软骨，充填在股骨与胫骨关节间隙内，每个膝关节有两个半月板，内侧半月板与外侧半月板。它们的周围部分较厚，附着于胫骨平台的边缘而中央部分则较薄，其接触股骨髁的上面略凹陷而接触胫骨髁的下面则平坦，膝关节半月板中内分无血液供应区，其营养主要来自滑液，只有与胫骨缘连接的边缘部分能从滑膜得到血液供应。
软骨细胞：幼稚的软骨细胞位于软骨组织的表层，单个分布，体积较小，呈椭圆形，长轴与软骨表面平行，越向深层的软骨细胞体积之间增大呈圆形，细胞核圆形或卵圆形，染色浅，细胞质弱嗜碱性，常见数量不一的脂滴。成熟的软骨细胞多2-8个成群分布于软骨陷窝内，这些软骨细胞由同一个母细胞分裂增殖而成，称为同源细胞群。

摘要
背景：关节软骨位置特殊，其功能常会受到运动的影响，通过关节运动能促进缺损部位修复，但是该结论尚未得到进一步证实。
目的：探讨跑台运动时不同运动强度对大鼠膝关节软骨全层缺损修复效果。
方法：将40只大鼠用直径3.2 mm的骨科手术电钻在股骨面制作一个直径3.2 mm的全层软骨缺损模型，然后随机分为模型组、低强度运动组、中强度运动组和高强度运动组，各10只。模型组仅在笼内自由活动，低强度运动组在平面进行运动，平台速度8.2 m/min；中强度运动组跑台坡度设置成5°，速度控制在15.5 m/min；高强度运动组设置跑台高度10°，速度控制在26.7 m/min。
结果与结论：①跑台运动8周后，低、中、高强度运动强度组大鼠血清基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶抑制剂浓度均低于模型组(P < 0.05)，且中强度运动组大鼠血清基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶抑制剂浓度低于低、高强度运动强度组(P < 0.05)；②中强度运动组关节软骨全层缺损区可见纤维组织，且与相邻正常关节软骨连接，厚度基本，修复效果明显优于其他3组。③提示中等强度跑台运动能促进大鼠膝关节软骨全层缺损修复，提高关节功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID:0000-0002-5224-8732(毛新润)

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 软骨缺损, 跑台运动, 膝关节软骨, 基质金属蛋白酶3, 关节功能, 全层软骨缺损模型, 纤维细胞

Abstract:

BACKGROUND: As the articular cartilage has a special anatomical position, its function is often affected by movement. Whether exercise training can promote the cartilage repair still needs to be confirmed.
OBJECTIVE: To investigate the effects of different intensities of treadmill exercises on the repair of full-thickness articular cartilage defects in rats.
METHODS: Forty rats were selected, and the models of full-thickness articular cartilage defects (3.2 mm in diameter) on the femoral surface were made with a orthopedic drill, followed by randomized into model, low-, moderate- and high-intensity exercise groups (n=10 per group). The rats in the model group were allowed free cage activity. The rats in the low-intensity exercise group exercised on the platform, and the platform speed was 8.2 m/min; rats in the middle-intensity exercise group exercised on the 5° treadmill, and the speed was controlled at 15.5 m/min; rats in the high-intensity exercise group exercised on the 10° treadmill, and the speed was controlled at 26.7 m/min.
RESULTS AND CONCLUSION: The levels of serum matrix metalloproteinase-3 and inhibitor of matrix metalloproteinase in the latter three groups were significantly lower than those in the model group at 8 weeks after exercise (P < 0.05), and the level was the lowest in the moderate-intensity exercise group (P < 0.05). In the moderate-intensity exercise group, there were fibrous tissues in the defect area, which were connected with the adjacent cartilage, and the repair effect was superior to that in the other three groups. To conclude, moderate-intensity treadmill exercise can promote the repair of full-thickness knee cartilage defects in rats, thereby improving functional recovery of the rat knee joint.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Chondrocytes, Knee Joint, Cartilage, Articular, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

赵森泉，毛新润. 跑台运动干预膝关节软骨全层缺损修复[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(16): 2478-2483.

Zhao Sen-quan, Mao Xin-run. Effect of treadmill exercise on the repair of full-thickness knee cartilage defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(16): 2478-2483.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 40只大鼠全部进入结果分析，中途无脱落。

2.2 大体观察 4组大鼠跑台运动前精神状态较好，能正常饮食。模型组术后饮食差，2只大鼠切口发生感染，且活动较差。低强度运动组与高强度运动组治疗后饮食一般，切口均愈合，治疗后未见明显感染，活动一般；中强度运动组大鼠治疗后饮食良好，切口均愈合且未见感染，活动情况与跑台运动前接近。

跑台运动8周后，低强度运动组大鼠关节发生轻微粘连，软骨缺损部位有白色的类骨组织填充，并未与周围正常软骨结合，无溃疡形成。中强度运动组关节未见粘连，表面光滑，与周围正常软骨结合，无溃疡形成。高强度运动组缺损部位明显，表面略粗糙，无溃疡形成。模型组未采取任何处理，缺损部位明显，表面粗糙(图2)。

2.3 血清基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶抑制剂浓度 4组大鼠跑台运动前血清基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶抑制剂水平差异无显著性意义(P > 0.05)；跑台运动8周后，低、中、高强度运动强度组血清基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶抑制剂浓度低于模型组(P < 0.05)，中强度运动组血清基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶抑制剂浓度低于低、高强度运动强度组(P < 0.05；表1)。

2.4 Ⅱ型胶原含量 跑台运动4周后时，低强度运动组缺损区以类软骨组织为主，与相邻正常关节结合紧密，组织浅层可见Ⅱ型胶原表达；高强度运动组可见幼稚的细胞，与相邻关节软骨结合紧密，Ⅱ型胶原阳性表达较强。中强度运动组缺损区以纤维组织为主，与相邻关节软骨连接，结合紧密，有细胞生成，Ⅱ型胶原阳性表达率，高于模型组(P < 0.05；图3)。

跑台运动8周后时，低强度运动组在缺损区以类软骨组织修复，与周围关节软骨联系紧密，可见Ⅱ型胶原阳性表达，高于模型组(P < 0.05)；高强度运动组跑台运动8周后可见较多的幼稚修复细胞，与相邻关节软骨结合紧密，细胞数量相对较少。中强度运动组缺损区与相邻关节软骨连接，结合紧密，可见大量II胶原阳性表达，高于其他3组(P < 0.05；图3)。

2.5 病理表现 番红染色结果显示，低强度运动组跑台运动4周后可见不成熟纤维细胞，排列紊乱，周围软骨无破坏且与修复组织间存在少许细胞；跑台运动8周后缺损部位仍未完全修复，缺损部位有陷窝，但是数量少。高强度运动组跑台运动4周后基质未见染色，缺损部位组织遭到明显破坏。跑台运动8周后缺损区无明显好转，仅底部薄层修复组织，周围软骨形成无细胞区，关节面恢复较差。中强度运动组跑台运动4周后缺损部位与正常组织两端结合，厚度基本正常，细胞数量较多，接近正常软骨细胞。跑台运动8周后缺损表面光滑，基质深染，细胞椭圆形，数量较多，接近正常软骨，模型组模型建立后未进行任何处理番红染色未见新生组织，缺损部位明显，见图4。

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引言

软骨损伤是临床上常见的疾病，其诱因较多^[1-2]。同时，软骨组织中不存在神经、血管及淋巴管等，一旦发生损伤，其自我修复能力有限，且软骨细胞再生能力较差^[3]。目前，临床上对于软骨缺损修复方法较多，如药物修复、生物疗法、外科手术等。药物修复成熟的方法有关节腔内注射透明质酸钠及糖皮质激素等，临床及动物研究表明，透明质酸能改善关节液的微环境，营养软骨，减少关节面摩擦应力，延缓关节应变。但是，对于软骨的再生作用不显著；糖皮质激素对创伤性关节液有一定的修复作用，有助于抑制炎性因子，但是长期注射容易引起并发症。目前，临床上普遍认为关节软骨细胞的正常生理功能与其受到的正常应力刺激关系密切，而运动则能改善修复软骨的质量。制动与关节负荷加重均能引起关节软骨发生退变。运动能促进全层软骨缺损的修复。同时，软骨细胞对力学刺激相对敏感，稳定的压力有助于抑制软骨细胞对基质蛋白的合成，而周期变化压力刺激及其合成。因此，关节活动对软骨营养的传递具有重要的作用。研究显示关节腔内注射透明质酸钠能改善关节软骨内环境，为软骨提供营养，减少关节面引起的摩擦，从而延缓关节缺损病情进一步加重^[4-5]。但是，药物修复并不会提高软骨的再生能力，且长期药物注射医疗费用相对昂贵，难以在基层医院推广。外科手术虽能促进损伤软骨修复，但患者修复再生后的纤维骨形态、结构和生物力学上均与原来软骨有较大差异，难以达到预期的修复效果。20世纪70年代，国外学者首先提出运动疗法的概念^[6]，后续研究表明早期活动有利于骨膜移植后全层软骨缺损修复^[7]，由此推测适宜的力学环境可能有助于关节软骨正常结构的维持^[8]。同时，运动还能有效地降低关节内压力，为软骨的修复提供适宜的环境，促进软骨修复^[9-10]，但是临床上应该选择何种运动强度以促进膝关节软骨全层缺损的修复尚存在争议。

实验制备膝关节软骨全层缺损大鼠模型，探讨跑台运动时不同运动强度对大鼠膝关节软骨全层缺损修复效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年1月至2016年10月在河北医科大学第二附属医院完成。

1.3 材料

动物：清洁级SD大鼠40只，鼠龄6周，体质量200-240 g，平均(220±25)g，雌雄不限，由河北医科大学第二附属医院动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK 2006-0015。实验方案经河北医科大学第二附属医院动物委员会批准。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在戊巴比妥钠麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。文章的撰写与编辑修改后文章遵守了《动物实验体内实验研究报告规范指南》(ARRIVE指南)。

主要仪器和试剂：兔抗鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体由河北博海生物技术有限公司提供，骨科手术电钻(直径为3.2 mm)由德国莱卡公司(型号：TE2000-U)提供，动物跑步机由成都泰盟科技有限公司提供，数码照相机由Canon公司提供，倒置显显微镜由日本奥林巴斯公司提供，多功能真彩色细胞图象分析管理系统由美国Media Cybernetics公司提供，电子天平由瑞士METTER公司提供，恒温水浴箱由江苏太仓医用仪器厂提供。

1.4 方法

1.4.1 大鼠关节软骨全层缺损模型的建立 将3组大鼠双膝关节及其周围剪毛，在膝关节髌骨骨内侧做一个弧形切口，逐层切开到关节囊，充分暴露股骨髌面滑车切迹的软骨，在距离踝间窝上2 mm处制备直径为1 mm，深度0.2 mm的圆形软骨全层缺损模型，生理盐水清洗，冲去软骨碎块组织及凝血块，逐层关闭切口，无菌敷料进行包扎(图1)。所有大鼠均肌肉注射200 000 U庆大霉素，1次/d，连续7 d，造模后大鼠安静的饲养^[11-12]。

1.4.2 实验动物分组 造模后将40只大鼠随机分为模型组、低强度运动组、中强度运动组和高强度运动组，每组各10只。

1.4.3 跑台运动 造模1周后，低强度运动组在水平面进行运动，平台速度8.2 m/min；中强度运动组跑台坡度设置成5°，速度控制在15.5 m/min；高强度运动组设置跑台高度10°，速度控制在26.7 m/min。3组大鼠每次跑步40 min，5次/周，连续干预8周^[13]。模型组不进行运动干预，在笼内自由活动。

1.4.4 大体观察 观察各4组大鼠饮食、切口愈合、感染及活动情况以及跑台运动8周后缺损部位的大小、表面情况与周围组织的关系及是否存在溃疡等^[14-15]。

1.4.5 血清基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶抑制剂浓度测定 跑台运动前、跑台运动4周及跑台运动8周，每组各取5只大鼠。跑台运动前及跑台运动4周后采用断尾取血法采集2 mL静脉血，跑台运动8周后采用心脏取血法取5 mL血液，2 000 r/min低温离心15 min，-80 ℃保存。采用酶联免疫吸附试验检测4组血清基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶抑制剂浓度^[16]。

1.4.6 Ⅱ型胶原含量测定 跑台运动4，8周后，每组各取5只大鼠采用免疫组织化学方法测定Ⅱ型胶原含量^[17]。取大鼠损伤软骨组织，体积分数10%中性甲醛固定24 h，石蜡切片常规脱蜡至水，抗原热修复，1∶200小鼠抗大鼠Ⅱ型胶原单抗37 ℃孵育2 h，PBS冲洗3次，每次3 min，滴加辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG，DAB显色，苏木精复染30 s，封固。采用多功能真彩色细胞图象分析管理系统对测定结果进行分析。

1.4.7 番红染色 跑台运动4，8周后，每组各取5只大鼠，取缺损部位组织，制备3 μm切片，对切片进行番红染色，在光学显微镜下观察水凝胶支架内组织情况，每个切片取6个视野^[14]。

1.5 主要观察指标 血清基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶抑制剂及损伤部位Ⅱ型胶原含量。

1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0软件处理，计数资料采用n(%)表示，行卡方检验，计量资料采用x(_)±s表示，组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

实验采用软骨下骨钻孔法建立关节软骨全层缺损大鼠模型，用直径为3.2 mm环钻进行钻孔，深度达到软骨下骨板，缺损区基底部有少许渗血者提示造模成功，该方法能保证每只大鼠模型缺损程度的高度一致，降低人为因素引起的误差^[18-19]。实验中，4组大鼠跑台运动前精神状态较好，能正常饮食。治疗后高、低强度运动组大鼠饮食一般，切口愈合，未见明显感染，活动一般；模型组术后饮食差，中强度组与模型组大鼠切口发生感染，且活动较差。中强度运动组大鼠治疗后饮食良好，切口均愈合且未见感染，活动与跑台运动前无明显差异(P > 0.05)。

关节软骨构成复杂，包括细胞外基质、软骨细胞等，细胞外基质主要由蛋白多糖、胶原纤维等组成^[20-21]。胶原纤维是关节软骨基质的重要组成部分，其中以Ⅱ型胶原蛋白为主，能为软骨组织提供抗拉伸强度和刚度。目前，临床上软骨损的伤修复方法较多，包括关节镜下冲洗和清理、钻孔和微骨折、自体或异体软骨移植等^[22-23]，这些方法均能有效的促进缺损修复，但是各种方法均有其适应证，并且对医疗技术要求较高，难以满足每一位患者需要^[24]。近年来，运动疗法开始运用于膝关节软骨全层缺损的修复。其理论基础是关节软骨的代谢与关节的活动关系密切，且关节软骨营养多源于关节运动产生的关节滑液，适当的运动能提高机体关节活动功能，从而提高关节周围韧带、关节囊在运动时的顺应性，促进软骨缺损的愈合，提高关节的稳定性^[25-29]。同时，适当的运动能降低关节内压力，能为关节缺损部位的修复营造良好的微环境，有助于缺损部位愈合，有助于降低关节内压力，利于滑液相软骨表面和细胞间质弥散，提供软骨修复的最佳内环境，有助于促进软骨的修复。已有学者研究了运动对膝关节软骨的影响，结果显示：运动对软骨的修复是有利的，但是部分患者持相反的态度。出现这种现象的原因是多方面的，由于不同的研究中运动的强度、运动介入的时间及确定运动强度的标准存在较大的差异，均需要进一步研究。

基质金属蛋白酶是蛋白酶超家族，在细胞外基质的生理、病理降解中发挥了重要的作用^[30-41]。在正常细胞中，基质金属蛋白酶水平相对较低，主要负责组织的代谢与重建，当病理状态下基质金属蛋白酶水平明显上升，容易导致结缔组织破坏。跑台运动能降低关节软骨基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶抑制剂水平，促进缺损部位早期愈合。虽然部分学者认为运动对软骨的修复没有明显的促进作用，但是有更多文献报道显示中等强度的运动能促进软骨修复^[41-42]。

实验结果显示，4组大鼠跑台运动前血清中基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶抑制剂水平差异无显著性意义(P > 0.05)；跑台运动8周后，低、中、高强度运动强度组大鼠血清基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶抑制剂浓度高于对模型组(P < 0.05)，中强度运动组血清基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶抑制剂浓度高于低、高强度运动强度组(P < 0.05)。番红染色结果显示，中等运动强度更加有助于软骨缺损部位修复，能促进软骨细胞增殖，提高修复效果。在动物实验水平支持中等强度的运动能促进软骨修复提供理论依据和参考。

综上所述，大鼠膝关节软骨全层缺损中给予中等轻度跑台运动效果理想，能促进软骨细胞分泌基质，具有广泛的运用前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

跑台运动干预膝关节软骨全层缺损修复

Effect of treadmill exercise on the repair of full-thickness knee cartilage defects

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