SMAD7调控内皮间质转化可预防跟腱损伤后的异位骨化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.08.006

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (8): 1178-1185.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.08.006

• 肌肉肌腱韧带组织构建 tissue construction of the muscle, tendon and ligament • 上一篇下一篇

SMAD7调控内皮间质转化可预防跟腱损伤后的异位骨化

张弛1，2，纪方1

1解放军第二军医大学附属长海医院，上海市 200433，2上海交通大学附属第六人民医院，上海市 200233

收稿日期:2016-10-22 出版日期:2017-03-18 发布日期:2017-04-14
通讯作者: 纪方，博士，教授，主任医师，解放军第二军医大学附属长海医院，上海市 200433
作者简介:张弛，男，1981年生，江苏省南京市人，汉族，2007年上海交通大学医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事创伤骨科、肩肘外科、骨科生物材料研究。
基金资助:
上海市卫生局青年基金(20134y110)

SMAD7 prevents heterotopic ossification by regulating endothelial-mesenchymal transition after Achilles tendon imjury

Zhang Chi1, 2, Ji Fang1

1Changhai Hospital Affiliated to the Second Military Hospital of Chinese PLA, Shanghai 200433, China; 2the Sixth Affiliated Hospital of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China

Received:2016-10-22 Online:2017-03-18 Published:2017-04-14
Contact: Ji Fang, M.D., Professor, Chief physician, Changhai Hospital Affiliated to the Second Military Hospital of Chinese PLA, Shanghai 200433, China
About author:Zhang Chi, Master, Attending physician, Changhai Hospital Affiliated to the Second Military Hospital of Chinese PLA, Shanghai 200433, China; the Sixth Affiliated Hospital of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China
Supported by:
the Youth Foundation of Health Bureau of Shanghai, No. 20134y110

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
异位骨化：是指在软组织出现成骨细胞，并形成骨组织。多半发生在大关节周围，例如髋关节、肘关节等，常见于神经瘫痪的患者。其发病机制不清楚，诱发因素可能是神经和生物电因素。早期局部有明显肿痛，关节活动受限；晚期由于骨组织形成，导致关节活动限制。其基本病理改变是在纤维结缔组织中，原始细胞增殖活跃伴有丰富的毛细血管网，钙盐沉积，形成骨。

摘要
背景：现有的研究结果证明，内皮细胞向间质细胞转化(EndMT)在异位骨化病程中起主要作用。
目的：基于SMAD7基因在阻止肌成纤维细胞转化等内皮-间质转化进展中的潜能，验证其是否是异位骨化潜在的治疗靶点。
方法：构建了过表达SMAD7的慢病毒颗粒，并在大鼠主动脉内皮细胞中测定了其最佳滴度和转染效率。随后，将该病毒颗粒注入构建的大鼠跟腱损伤模型中，对照组注射生理盐水。使用qPCR和蛋白印迹实验分析了损伤处内皮和间质标志物的表达，采用X射线和组织染色观察异位骨化病程转化。
结果与结论：①局部注射转染SMAD7基因的病毒载体可引起内皮细胞标志物(CD31，VE-cadherin)发生上调，同时间质细胞标志物(N-cadherin，vimentin)发生下调，提示SMAD7的局部高表达阻断了内皮-间质转化改变。这种表达差异在造模后10周时比在造模后6周时更明显；②X射线片和组织染色显示，相比对照组，注入表达SMAD7的慢病毒后，肌腱组织中骨化结构缺失；③因此认为，促进局部SMAD7的高表达可用来预防术后异位骨化形成，而不影响正常的伤口愈合过程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-7408-5874(张弛)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 异位骨化, 内皮细胞间质化途径, 慢病毒, SMAD7

Abstract:

BACKGROUND: The endothelial-mesenchymal transition is known to play a central role in the pathological process of heterotopic ossification.
OBJECTIVE: To verify the inhibitory effect of SMAD7 on endothelial-mesenchymal transition such as myofibroblast transformation and to explore whether it is a potential target for heterotopic ossification.
METHODS: A lentivirus overexpressing SMAD7 was contructed and the optimal titre and transfection efficiency in rat aortic endothelial cells were determined. The lentivirus was then injected into a rat model of Achilles tendon injury, while the controls were given the injection of normal saline. Expressions of endothelial and mesenchymal markers at the injured site were analyzed by quantitative PCR and western blot assay. The heterotopic ossification was observed radiologically and histologically.
RESULTS AND CONCLUSION: Local injection of SMAD7-delivering lentivirus resulted in an upregulation of CD31 and VE-cadherin, and a downregulation of N-cadherin and vimentin, suggesting that the endothelial-mesenchymal transition is blocked due to local SMAD7 overexpression. The inhibitory effect became more evident at 10 weeks than at 6 weeks after modeling. Radiology and histological staining further confirmed that the ossified structures in the tendon tissue disappeared after injection of SMAD7-delivering lentivirus, as opposed to the control group. These data suggest that local overexpression of SMAD7 can prevent postoperative heterotopic ossification with no effect on wound healing.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteogenesis, Heterotopic, Stromal Cells, Lentivirus, Smad7 Protein, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

张弛，纪方 . SMAD7调控内皮间质转化可预防跟腱损伤后的异位骨化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(8): 1178-1185.

Zhang Chi1, 2, Ji Fang1. SMAD7 prevents heterotopic ossification by regulating endothelial-mesenchymal transition after Achilles tendon imjury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(8): 1178-1185.

图/表（结果） 2

2.1 pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-SMAD7慢病毒载体的构建有效性评估为了测试SMAD7过表达是否能阻断异位骨化，构建了慢病毒载体，用于目标细胞中及时稳定表达SMAD7。载体构建基于pCDH1-MCS1-EF1-copGFP，SMAD7被插入到EcoRI和BamHI位点之间(图1A)。瞬时转染pCDH1-MCS1-EF1-copGFP(PLV-对照)和pCDH1- SMAD7-EF1-copGFP(pLv-SMAD7)到293T细胞后，2组GPF表达率均达约90%，提示SMAD7被正确插入到载体中(图1B)。作定量PCR(qPCR)和蛋白印迹，评估瞬时转染后载体的表达水平。qPCR及蛋白印迹显示，转染pLv-SMAD7的细胞中，SMAD7的表达强度显著高于pLv-Control(qPCR，4.8倍，P < 0.0001；蛋白印迹，3.5倍，吸光度法)(图1C-E)。

2.2 SMAD转染慢病毒与大鼠主动脉内皮细胞共培养结果验证表达质粒后，使用293T细胞包装并收集慢病毒。通过终点稀释法测定慢病毒滴度，将病毒稀释至1× 10⁴ (IFU)/μL。该慢病毒对大鼠主动脉内皮细胞的最佳感染复数(MOI)为10，该感染复数下，刚好能达到100%的转导效率。确定Lv-SMAD7-GFP对大鼠主动脉内皮细胞的转导效率后，细胞经Lv-control-GFP和Lv-SMAD7-GFP转导后，于首次传代(P1)及感染后48，72及96 h收集细胞(图2A)。使用qPCR及蛋白印迹检测SMAD7的表达(图2B、C、D)；两者均显示SMAD7的表达随时间增加，并于96 h达到高峰，且在P1传代时保持稳定。为了确定SMAD7高表达对表型的影响，使用10 mg/L的转化生长因子β1刺激大鼠主动脉内皮细胞48 h(图2E、F)以模拟细胞水平上，转化生长因子β1对局部EndMT和异位骨形成的影响。蛋白印迹分析显示，一般情况下，转化生长因子β1会下调内皮细胞标志物CD31和VE-cadherin，并上调间质标志物N-cadherin和vimentin。相比Lv-对照组，SMAD-7过表达会上调CD31和VE-cadherin的表达，其幅度几乎可以抵消转化生长因子β1处理造成的下调。同时，SMAD7过表达也还下调了N-cadherin和vimentin的表达。

2.3 对跟腱损伤大鼠模型的慢病毒载体基因治疗结果为了评估SMAD7基因疗法在体内实验中的疗效，通过手术切断跟腱的方式建立了大鼠跟腱损伤模型，并对局部注射了载有SMAD7基因的慢病毒。实验设置3组：生理盐水组(n=12)，Lv-对照组(n=12)以及Lv-SMAD7组(n=12)。每组中均于第2，6和10周分别取4只做组织学和基因表达分析。相比Lv-对照组，Lv-Smad组中，损伤的肌腱中VE-cadherin和CD31上调，而N-cadherin和vimentin下调，第6和第10周，变化尤其明显(图3A-C)。这些数据与体外大鼠主动脉内皮细胞实验中基因表达分析的结果一致。

2.4 过表达SMAD7对大鼠跟腱损伤模型表型的影响为了确认基因表达改变后对表型的影响，通过X射线光成像观察了潜在的异位骨结构。大鼠于第10周，在麻醉状态下作X射光摄片(图4A-K)。注射盐水或Lv-对照的大鼠跟腱手术区表现出高密度阴影，提示存在骨化结构，而注射Lv-SMAD7的手术区则未见任何高密度阴影，类似于未受伤肢体(图4I-K)。

该过程结束时，切取跟腱组织作组织学分析(图4L-O)。生理盐水和Lv-对照组中，组织切片显示典型的异位骨化组织结构，存在致密骨化小梁区域及广泛的胶原蛋白表达(图4L，M)，而Lv-SMAD7组仅出现小的不连贯的小梁结构(图4N，O)，提示Lv-SMAD7处理的肢体中，异位骨形成相比对照组明显减轻。3组大鼠中，跟腱组织以及伤口均得到愈合。

参考文献

[1] Shore EM, Xu M, Feldman GJ, et al.A recurrent mutation in theBMP type I receptor ACVR1 causes inherited andsporadic fibrodysplasia ossificans progressiva. Nat Genet .2006; 38: 525-527.

[2] Weinreb JH, Sheth C, Apostolakos J,et al.Tendonstructure, disease, and imaging. Muscles LigamentsTendons J.2014;4: 66-73.

[3] O’Brien EJ, Frank CB, Shrive NG,et al.Heterotopic mineralization (ossificationor calcification) in tendinopathy or following surgicaltendon trauma. Int J Exp Pathol.2012; 93:319-331.

[4] Oliva F, Via AG，Maffulli N.Physiopathologyof intratendinous calcific deposition. BMC Med.2012; 10:95.

[5] Ateschrang A, Gratzer C，Weise K.Incidenceand effect of calcifications after open-augmentedAchilles tendon repair. Arch Orthop Trauma Surg.2008;128:1087-1092.

[6] Richards PJ, Braid JC, Carmont MR，et al.Achilles tendon ossification: pathology, imagingand aetiology. Disabil Rehabil. 2008; 30:1651-1665.

[7] Johansson KJ, Sarimo JJ, Lempainen LL,et al. Calcific spurs at theinsertion of the Achilles tendon: a clinical andhistological study. Muscles Ligaments Tendons J.2012;2:273-277.

[8] Kan L, Liu Y, McGuire TL,et al.Dysregulation oflocal stem/progenitor cells as a common cellularmechanism for heterotopic ossification. Stem Cells.2009;27:150-156.

[9] Kaplan FS,Glaser DL,Shore EM,et al.Hematopoietic stem-cell contribution to ectopicskeletogenesis. J Bone Joint Surg Am. 2007; 89:347-357.

[10] Kan L , Kessler JA.Evaluation of the cellularorigins of heterotopic ossification. Orthopedics.2014; 37:329-340.

[11] Lin F, Wang N,Zhang TC.The role ofendothelial-mesenchymal transition in development andpathological process. IUBMB Life.2012; 64:717-723.

[12] Arciniegas E, Sutton AB, Allen TD,et al.Transforming growth factor beta 1 promotes thedifferentiation of endothelial cells into smoothmuscle-like cells in vitro. J Cell Sci.1992;103 (Pt 2),521-529.

[13] Piera-Velazquez S, Li Z,Jimenez SA. Role ofendothelial- mesenchymal transition (EndoMT) in thepathogenesis of fibrotic disorders. Am J Pathol.2011; 179:074-1080.

[14] Medici D, Shore EM, Lounev VY,et al.Conversion of vascularendothelial cells into multipotent stem-like cells. NatMed.2010;16:1400-1406.

[15] Lounev VY, Ramachandran R, Wosczyna MN,et al.Identification ofprogenitor cells that contribute to heterotopicskeletogenesis. J Bone Joint Surg Am.2009; 91:652-663.

[16] Fang Z, Zhu T, Shen WL,et al.Transplantation of fetal instead of adult fibroblastsreduces the probability of ectopic ossification duringtendon repair. Tissue Eng Part A.2014; 20:1815-1826.

[17] Mazonakis M, Berris T, Lyraraki E,et al.Cancer risk estimates from radiation therapy forheterotopic ossification prophylaxis after total hiparthroplasty. Med Phys.2013; 40:101702.

[18] Hoff P, Rakow A, Gaber T,et al.Preoperative irradiation for theprevention of heterotopic ossification induces localinflammation in humans. Bone.2013; 55:93-101.

[19] Beckmann JT, Wylie JD, Kapron AL,et al.The effect of NSAIDprophylaxis and operative variables on heterotopicossification after hip arthroscopy. Am J Sports Med.2014;42:1359-1364.

[20] Lin L, Chen L, Wang H,et al. Adenovirus-mediatedtransfer of siRNA against Runx2/Cbfa1 inhibits theformation of heterotopic ossification in animal model.Biochem Biophys Res Commun.2006; 349:564-572.

[21] Glaser DL, Economides AN, Wang L,et al.In vivo somatic cell gene transfer ofan engineered Noggin mutein prevents BMP4-inducedheterotopic ossification. J Bone Joint Surg Am.2003; 85-a:2332-2342.

[22] Freedman BR, Gordon JA,Soslowsky LJ.TheAchilles tendon: fundamental properties andmechanisms governing healing. Muscles LigamentsTendons J.2014; 4:245-255.

[23] Yoshimatsu Y,Watabe T.Roles of TGF-betasignals in endothelial-mesenchymal transition duringcardiac fibrosis. Int J Inflam.2011:724080.

[24] Lamouille S, Xu J,Derynck R.Molecularmechanisms of epithelial-mesenchymal transition. NatRev Mol Cell Biol. 2014; 15:178-196.

[25] Zhong B, Ma Y, Fu D,et al.Induction ofapoptosis in osteosarcoma s180 cells by polysaccharidefrom dictyophora indusiata. Cell Biochem Funct.2013;31:719-723.

[26] Sobral LM, Montan PF, Zecchin KG, et al. SMAD7blocks transforming growth factor-beta1-inducedgingival fibroblast-myofibroblast transition viainhibitory regulation of Smad2 and connective tissuegrowth factor. J Periodontol. 2011; 82:642-651.

[27] Chung AC, Dong Y, Yang W, et al.SMAD7 suppresses renal fibrosis via alteringexpression of TGF-beta/Smad3-regulated microRNAs.Mol Ther.2013;21:388-398.

[28] Peterson JR, Agarwal S, Brownley RC,et al.Direct mouse trauma/burn modelof heterotopic ossification. J Vis Exp.2015; e52880.

[29] Hast MW,Zuskov A,Soslowsky LJ.The roleof animal models in tendon research. Bone Joint Res.2014; 3:193-202.

[30] Oliva F,Barisani D,Grasso A,et al.Gene expression analysis in calcific tendinopathy of therotator cuff. Eur Cell Mater.2011; 21:548-557.

[31] Zhang C, Zhang Y, Zhong B,et al. SMAD7 prevents heterotopic ossification in a rat Achilles tendon injury model via regulation of endothelial-mesenchymal transition. FEBS J. 2016;283(7):1275-1285.

引言

异位骨化是骨骼外软组织(如骨骼肌和结缔组织)中形成成熟板层骨的过程，最常发于关节置换或颅脑创伤以及多发伤之后。遗传疾病也可引起异位骨化，最严重的情况是进行性骨化性肌炎(FOP)(MIM135100)，这一遗传疾病中，ALK2(一种转化生长因子β和骨形态发生蛋白的受体)的激活突变导致了异位骨化^[1]。肌腱异位骨化可导致严重疼痛、无力和相关结构机械性能的下降^[2]。这种情况最常见于肩袖肌腱，也较常见于跟腱、肱二头肌、拇长展肌、和股四头肌肌腱^[3]，其机制可能是营养不良性钙化或软骨内骨化^[4]。跟腱骨化是跟腱损伤的常见并发症。跟腱断裂后作开放式跟腱修复，发生跟腱异位骨化的比例高达14%-62%^[5-6]，运动员中跟腱异位骨化也很常见^[7]。

异位骨化的细胞起源和分子机制尚不十分清楚。研究者已经提出了多种关于各种细胞成骨潜能的假说，比如间质干细胞^[8]，造血干细胞^[9]，以及各种来源(包括周皮细胞，循环纤维细胞和平滑肌细胞)的肌成纤维细胞^[10]。然而，目前为止，这些假说都没有得到研究人员的广泛认可，迫切需要理解异位骨化形成的机制，以发现新的治疗策略。近年来，有研究结果证明内皮细胞向间质细胞转化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)在异位骨化病程中起主要作用。因此，课题拟通过体内和体外实验进一步研究其相关机制，采用过表达SMAD7基因来调控EndMT途径介导的异位骨化形成，初步检测其有效性，也在细胞、组织和动物水平进一步探讨转化生长因子β信号通路和EndMT途径以及异位骨化三者之间的相互作用及其分子机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞形态学观察实验以及动物体内实验。

1.2 时间及地点于2013年1至12月在解放军第二军医大学药学院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级SD大鼠36只，体质量(180± 20) g，购自上海SLAC实验动物有限公司(上海，中国)。所有大鼠均在解放军第二军医大学(上海，中国)所属动物中心，于小型隔离笼中饲养。所有动物实验均经上海市委科技委员会批准。

1.3.2 主要试剂及仪器 293T细胞(中科院细胞所，上海)；大鼠主动脉内皮细胞(ATCC，美国)；0.25%胰蛋白酶及转染试剂Lipofectmaine 2000(Invitrogen，美国)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(Sigma，美国)；蛋白抗体(Santa Cruz，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-SMAD7慢病毒载体的构建使用SMAD7上游引物5′-CGG AAT TCG CCA CCA TGT TCA GGA CCA AAC GAT C-3′，和下游引物5′-CGG GAT CCA CTA CCG GCT GTT GAA GAT G-3′克隆全长的SMAD7cDNA序列(Rattusnorvegicus SMAD family member 7，mRNA NM_030858.1)，并连接到pCDH1- MCS1-EF1-copGFP(CD511A-1，System Biosciences， Hercules，CA，USA)载体的EcoRI和BamHI酶切位点之间。使用Qiagen Plasmid Midi试剂盒(12145；Qiagen，Hilden， Germany)纯化重组的pCDH1-MCS1-EF1-copGFP- SMAD7慢病毒载体(pLv-SMAD7)。使用pCDH1-MCS1- EF1-copGFP空载体(pLv-Control)作对照。

1.4.2 表达载体性能测试培养293T细胞，取对数生长期细胞接种于六孔细胞培养板，每孔接种1×10⁵细胞，使用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，正常条件过夜培养。细胞过夜培养后，使用Lipofectmaine2000进行质粒转染实验，实验分为对照组(NT)，载体对照组(pLv-Control)，基因表达组(pLv-Smad7)，质粒用量及转染过程严格按照转染试剂说明书进行。转染后24 h，使用含体积分数10%胎牛血清的DMEM完全培养基对细胞进行换液，后正常条件继续培养24 h。转染后48 h，荧光倒置显微镜观察细胞内绿色荧光蛋白GFP表达，判断细胞转染效率。收集细胞，分别提取细胞Total RNA和细胞总蛋白，RealTime-PCR或者免疫印迹法检测胞内Smad7 mRNA相对含量及蛋白表达。

1.4.3 慢病毒包装接种1.5x10⁶个293T细胞至10 cm盘，使用添加体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，于含体积分数5% CO₂的37 ℃培养箱中，培养至约85%汇合度。然后使用42 μL Lipofectamine 2000)同时向细胞转染 11 μg慢病毒包装质粒组合(LV500A-1, System Biosciences)和2 μg pLv-SMAD7，转染体系含体积分数2.5% 胎牛血清。转染后24 h，去除培养基，更换新的含体积分数2% 胎牛血清的新鲜培养基。转染48 h后，收集上清，5 000×g离心5 min后以0.45 μm孔径的PVDF膜过滤。

1.4.4 慢病毒滴度使用10倍稀释终点法确定上清液病毒滴度，计算公式为：B/Vx10Aifu/μL，其中B代表GFP阳性细胞，V(μL)为原始病毒上清的体积，A代表10倍稀释的次数。将病毒稀释到1x10⁴IFU/μL，并分装冻存于-80 ℃备用。

1.4.5 大鼠主动脉内皮细胞慢病毒感染大鼠主动脉内皮细胞培养于含体积分数10% 胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于含体积分数5% CO₂的37 ℃培养箱中。将对数生长期大鼠主动脉内皮细胞接种于6孔板，每孔细胞数量为1×10⁵个，过夜培养使其贴壁。24 h后，按照MOI=10(重组病毒与细胞数量比例为10∶1)向大鼠主动脉内皮细胞中加入重组病毒(Lv-Smad7)及对照病毒(Lv-Control)。加入病毒后正常条件培养24 h，使用含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养基对细胞进行换液，后正常条件培养。病毒感染后72 h和96 h，荧光倒置显微镜观察细胞病毒感染效率。收集细胞，分别提取细胞Total RNA和细胞总蛋白，RealTime-PCR或者免疫印迹法检测细胞内SMAD7蛋白表达。

1.4.6 Smad7过表达对转化生长因子β1诱导大鼠主动脉内皮细胞间质转化相关蛋白表达的影响检测使用终浓度为10 mg/L的转化生长因子转化生长因子β1(ab50036， Abcam，USA)诱导基因干预后的各组大鼠主动脉内皮细胞48 h，然后收集细胞，提取细胞总蛋白，免疫印迹法检测内皮间质转化相关蛋白CD31、VE-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达。实验分为转化生长因子β1诱导和不诱导2个大组，每组又分为细胞对照组，对照病毒感染组，Lv-Smad7感染组。

1.4.7 大鼠跟腱切断法制造异位骨化模型将大鼠麻醉后作跟腱切断手术。在大鼠小腿后外侧作一切口，暴露大鼠的整个跟腱。在跟腱的中点处作完全横切。切口两端被夹紧5次，造成可观伤害。跟腱未作缝合，仅缝合皮下皮肤。所有实验动物造模后均培养于标准条件下并作监控。造模后2，6，10周，将大鼠麻醉后作损伤部位X射线成像，以评估潜在的异位骨化。

1.4.8 慢病毒注射向大鼠异位骨化模型(即手术处理的)大鼠跟腱损伤处注射Lv-Smad(n=12)，Lv-对照(n=12) (1x10⁷ IFU，30 μL)或等体积的生理盐水(n=12)。首次注射于造模后第2天执行，以后每3 d注射1次，至第10周。

1.4.9 组织处理和组织学分析在注射后的第2，6，10周，每组取3只动物，通过颈椎脱位处死大鼠，取跟腱组织，分别固定及冷冻保存。固定标本使用体积分数4%甲醛固定24 h，然后以15% EDTA脱钙1周。完全脱钙后，使用梯度乙醇对组织脱水，然后以石蜡包埋。作5 μm切片，并作苏木精-伊红染色和Masson三色染色，在光学显微镜下观察。冷冻标本用于SMAD7、CD31、VE-cadherin、N-cadherin基因mRNA及蛋白含量检测。

1.4.10 定量PCR检测使用Trizol总RNA提取试剂(Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)从大鼠主动脉内皮细胞及跟腱组织中提取总RNA。使用M-MLV反转录酶合成cDNA(Takara，Shiga，Japan)。使用Thermal Cycler DICE Real Time System及SYBR Premix Ex Taq试剂(Takara)，按照生产商提供的说明作定量PCR。作溶解曲线测试，以确保PCR的特异性。以β-actin作内参，以2^?Ct =2^Ctm-Ctn作相对定量。

定量PCR使用了以下引物：
β-actin (NM_001101)	5′-CCT GTA CGC CAA CAC AGT GC-3′，5′-ATA CTC CTG CTT GCT GAT CC-3′ (Tm=60 ℃，211 bp)
SMAD7 (NM_030858.1)	5′-CCC GGC GGC GAG GAC GAG GAG-3′，5′-GGA TGG TGG TGA CCT TTG GCA C-3′ (Tm= 60 ℃，170 bp)
CD31 (NM_031591.1)	5′-GGA CTG CGC CCA TCA CTT ACC-3′，5′-AAC TTC ATC CAC CGG GGC TAT TAC-3′ (Tm= 58 ℃，203 bp)
VE-cadherin (NM_001107407.1)	5′-AAT TTG CCC AGC CCT ACG AAC CTA-3′，5′-TGC TCC CGA TTA AAC TGT CCA TAC-3′ (Tm=58 ℃，211 bp)
N-cadherin (NM_031333.1)	5′-GCT TCT GGC GGCCTTGCTTCA-3′，5′-GCG TAC ACT GTG CCG TCC TCA TCC-3′ (Tm=58 ℃，228 bp)
vimentin (NM_031140.1)	5′-GCC GAC GCC ATC AAC ACC-3′，5′-GCC GGC GCA ACT CCC TCA T-3′ (Tm=60 ℃， 214 bp)

1.4.11 免疫印迹法检测细胞及肌腱组织中的蛋白含量使用P-MER或者P-TER蛋白提取试剂盒分别提取病毒感染后细胞及组织样本总蛋白，BCA法进行蛋白定量。然后将浓度测定后的总蛋白以每组10 μL进行垂直电泳，SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶浓度为10%，经110 V电压90 min电泳后，立春红染色观察蛋白条带是否完整，400 mA电流转膜90 min，转膜后以5%的脱脂牛奶封闭2 h，4 ℃一抗过夜孵育，一抗稀释(TBST)比分别为SMAD7(1∶200)、CD31(1∶500)、VE-cadherin(1∶400)、N-cadherin (1∶300)和Beta actin(1∶1 000)；TBST洗膜3次，加入二抗孵育2 h，羊抗鼠二抗稀释比为1∶2 000；TBST洗膜3次，添加化学发光液反应底物，暗室曝光，扫描曝光底片，统计目的条带吸光度值。NGX6蛋白相对含量为目的蛋白和内参吸光度值比值。

1.5 主要观察指标 ①pCDH1-MCS1-EF1-copGFP- SMAD7慢病毒载体的构建评估；②SMAD7转染慢病毒与大鼠主动脉内皮细胞共培养结果；③对跟腱损伤大鼠模型的慢病毒载体基因治疗结果；④过表达SMAD7对大鼠跟腱损伤模型的表型的影响。

1.6 统计学分析所有数据均表示为x(_)±s，使用单因素方差分析及 Fisher最小显著差异(LSD)事后检验比较组间均值，P < 0.05被认为差异有显著性意义。所有的分析均使用IBM SPSS 20软件(SPSS Statistics V20；IBM Corporation，Somers，NY，USA)。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

3.1 EndMT途径与异位骨化形成之间关系目前， EndMT在异位骨化形成中的作用还未被深入研究。EndMT作为发育的一个重要过程，已经得到深入研究，该过程中，内皮细胞获得间质的成纤维细胞样特性，降低细胞间黏附并增加移动性。类似于上皮间质转化，EndMT过程中，内皮细胞从规则的细胞层中脱离，并侵入下层组织，导致CD31、VE-cadherin、Tie1、von Willebrand因子等内皮标志物表达的缺失，以及N-cadherin、FSP-1、α-SMA等间质标志物的异常表达^[11]。早先的研究显示，病理条件下，血管内皮细胞能够经由转化生长因子β1起始和驱动的转分化过程，获得平滑肌或成肌纤维细胞表型^[12-13]。

FOP转基因小鼠模型中，软骨细胞和成骨细胞表达了内皮细胞标志物^[14]。使用Tie2-Cre组件追踪细胞来源，发现这些细胞均起源于内皮。使用特殊的炎症介质刺激后，这些细胞可通过间质缩合，及后续的软骨形成和软骨内骨化，形成异位骨组织。在转化生长因子β2或骨形态发生蛋白4的刺激下，内皮细胞被证明可转化为间质细胞，并获得干细胞样特性，同时导致FSP-1、α-SMA和N-cadherin等间质特异性标志物的上调^[14]。与本研究一致，Lounev等^[15]使用Cre/loxP跟踪法，鉴别了小鼠中造成异位骨化的细胞系。他们的结果表明，异位骨化组织中，无血管平滑肌细胞来源的细胞，5%源自骨骼肌前体细胞，而大多数源自表达血管内皮标志物Tie2/Tek的细胞。

目前的研究显示，骨肉组织中血管内皮细胞在骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白4或转化生长因子β2等炎症诱导的细胞因子的刺激下，可发生EndMT，而骨形态发生蛋白7和血管内皮生长因子则可抑制EndMT^[16]。这些内皮起源的间质干细胞样细胞通过软骨分化和软骨内骨化形成软骨细胞和成骨细胞。

3.2 基因治疗异位骨化目前为止，导致异位骨化的细胞事件尚不十分清楚；其预防方法目前仅限于使用非类固醇消炎药和手术前放射处理，这些处理方法都有显著的缺点，包括放射诱导的癌症^[17]、局部炎症^[18]、急性肾功能衰竭、结肠炎和胃炎等^[19]，所以在使用这些方法预防异位骨化时，都需要权衡利弊。基因治疗也是一种可选的治疗方案，它通过增强或抑制特定基因的表达，阻止或逆转特定的疾病进程。最近，研究者针对异位骨化的预防和治疗开展了多项基因治疗研究。比如，腺病毒介导的靶向RunX2/Cbfa1的siRNA，被证明可成功抑制异位骨化^[20]。一项使用骨形态发生蛋白4诱导的小鼠异位骨化模型的研究发现，局部投递骨形态发生蛋白拮抗剂noggin可抑制异位骨化^[21]。尽管取得了一些初步成功，但异位骨化的基因治疗仍存在许多问题。异位骨化预防和治疗的靶基因，必须是高度特异性的，并且必须精确地限制作用部位，使其不至于影响正常的伤口愈合过程，但这些基因在软骨内骨化过程中起重要作用的同时，也对发育及早期生长反应中起关键的调控作用，比如骨形态发生蛋白、转化生长因子β等^[22]。

EndMT受到多条信号通路的调控，包括转化生长因子β、Wnt、和Notch。尤其是转化生长因子β1超家族成员，被证明在EndMT过程中起核心作用。骨形态发生蛋白-2和转化生长因子β可分别结合骨形态发生蛋白Ⅰ型受体ALK-2、3、6，以及转化生长因子β受体ALK-1、5，分别激活Smad2、3和Smad1、5、8，进而激活EndMT相关基因的转录^[23-24]。之前的一项研究表明，竹荪多糖可调控SMAD7表达，并抑制EndMT^[25]。SMAD7过表达可有效地阻断肌成纤维细胞转化和激活^[26]，并可通过调控TGF-β/Smad3介导的肾基因表达，有效阻断肾纤维化^[27]。这些数据表明，SMAD7可能是转化生长因子β相关疾病的理想治疗靶点。于是，猜想，局部过表达SMAD7或许可以有效地扰乱转化生长因子β信号通路，进而抑制EndMT诱导的异位骨化。当前研究拟考察SMAD7对肌腱创伤后骨化结构形成的影响。作者向手术创伤的大鼠跟腱注射了载有大鼠SMAD7 cDNA的慢病毒，然后鉴别了异位骨化相关的分子和表型特征。

目前为止，大多数用于研究异位骨化的动物模型都涉及骨形态发生蛋白的使用，骨形态发生蛋白信号通路的遗传突变，或胶原酶诱导的肌腱病^[28]。最近，也有使用跟腱背侧部分烧伤的方法模拟跟腱切断术的动物模型^[28]。这项研究中，使用一种基本的大鼠跟腱断裂模型来研究SMAD7在体内的作用。首先，通过体外分析确定Lv- SMAD7-GFP的滴度和对大鼠主动脉内皮细胞系的转导效率。然后，使用高剂量的转化生长因子β1体外诱导EndMT。转化生长因子β1处理后，对照组大鼠主动脉内皮细胞的表型由特征性的鹅卵石样变为成纤维细胞样，提示这些细胞发生了EndMT。同时，内皮标志物CD31和VE-cadherin发生下调，而间质标志物N-cadherin和vimentin发生上调，它们都是EndMT中的典型变化。转染Lv-SMAD7的大鼠主动脉内皮细胞中，CD31和VE-cadherin的表达仍保持高水平，而N-cadherin和vimentin则较低，提示高表达SMAD7充分抑制了EndMT。重要的是，X射线照片和组织学染色也确认过表达SMAD7有效阻止了异位骨化的形成，而没有影响正常的伤口愈合过程或导致其他显著的副作用。进一步的分子研究将阐明EndMT上下游机制如何平衡正常的组织再生和病理性异位骨化，后者很可能是内皮细胞脱分化形成多能干细胞，再形成软骨细胞和成骨细胞而导致的^[14]。

3.3 本研究存在的不足和意义研究证明SMAD7过表达有效阻断了大鼠受损跟腱处的异位骨形成。虽然本研究从原理上论证了，体内慢病毒介导的SMAD7基因局部高表达可有效阻止异位骨化，但此模型并不能代表所有类型的异位骨化，并且这种方法也可能并不适用于其他易发异位骨化解剖位置或组织类型。此外，大鼠踢键损伤模型可能并不能代表人类跟腱断裂和腱末端病，因为两者在解剖和运动机制上是有差别的^[29]。研究的另一点局限性在于，大鼠跟腱损伤模型虽然是研究跟腱损伤的优秀模型，但它不能模拟更广义的肌腱异位矿化疾病，比如肩袖钙化肌腱病，后者的主要特点为营养不良性钙化，伴随组织转谷氨酰胺酶2(tTG2)和骨桥蛋白的上调，以及骨形态发生蛋白4和骨形态发生蛋白6通路的下调^[30]。

实验选择慢病毒载体作为SMAD7的基因载体，因为相比其它病毒载体，慢病毒对分裂和非分裂细胞均有较高的转导效率，同时具有较高的转基因表达稳定性和较低的免疫原性。虽然基于慢病毒的载体用于临床已经取得一些成功，但因为基因投递效率和安全性方面的顾虑，这一方法尚未能被临床广泛接受。未来，作者计划采用非病毒载体，例如纳米壳聚糖颗粒等作为基因载体进行相关研究。

虽然治疗策略有效地阻断了大鼠跟腱损伤模型恢复过程中发生的异位骨化^[31]，当前的治疗方法需要在10周内每周肌肉注射3次，较为繁琐。因为盐水和Lv-对照组中，异位骨结构都相对较小，作者将尝试使用较低的剂量以及较低的注射频率。但不管怎样，本研究都首次证明，SMAD7阻断EndMT，可有效阻止肌腱组织手术手异位骨化，并且可能是人类软组织异位骨化的潜在治疗方法。使用大鼠跟腱损伤模型也帮助从分子及细胞层面，更深入理解活体动物中异位骨化过程，并提供了预防和治疗术后异位骨化的新方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

SMAD7调控内皮间质转化可预防跟腱损伤后的异位骨化

SMAD7 prevents heterotopic ossification by regulating endothelial-mesenchymal transition after Achilles tendon imjury

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 2

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	姚晓玲, 彭建城, 许岳荣, 杨志东, 张顺聪. 可变角度零切迹前路椎间融合内固定系统治疗脊髓型颈椎病：30个月随访[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1377-1382.
[2]	何云影, 李玲婕, 张舒淇, 李雨舟, 杨生, 季平. 聚丙烯酸/琼脂糖三维培养构建细胞球的方法[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 553-559.
[3]	康坤龙, 王新涛. 生物支架材料促进骨髓间充质干细胞成骨分化的研究热点[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 597-603.
[4]	李辉, 陈良龙. 植骨材料在脊柱结核治疗中的应用与特征[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 626-630.
[5]	敬劲, 赵珊笛, 陈龙, 彭双麟, 唐辉, 郭代金, 曾馨仪, 肖金刚. 骨质疏松症小鼠脂肪干细胞结合双相磷酸钙陶瓷修复骨质疏松症小鼠颅骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 90-95.
[6]	杨腾云, 李彦林, 刘德健, 王国梁, 郑竹君. 转化生长因子β3诱导外周血源性间充质干细胞成软骨分化的量效关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 45-51.
[7]	张超, 吕欣. 髋臼骨折固定后的异位骨化：危险因素、预防及其治疗进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1434-1439.
[8]	陈俊毅, 王宁, 彭称飞, 朱伦井, 段江涛, 王烨, 贝朝涌. 脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 510-515.
[9]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[10]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[11]	王向, 韦朝俊, 王尧, 潘裕佳, 刘大男. 构建过表达FNDC5慢病毒载体抑制平滑肌细胞的增殖与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(35): 5670-5675.
[12]	石淑娟, 李诚, 乔凌燕, 杨槟伊, 李堂. 构建人SMARCAL1基因过表达慢病毒载体调控胚肾细胞增殖[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(35): 5682-5687.
[13]	刘小刚, 李甜, 张舵. 软骨组织工程中种子细胞选择的研究热点[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(31): 5059-5064.
[14]	李君, 左新慧, 刘小元, 张凯, 韩祥祯, 何惠宇 . 过表达miR-378a可影响骨髓间充质干细胞膜片成骨及成血管分化的能力[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(31): 4939-4944.
[15]	谢程欣, 王维, 王成龙, 李清龙, 尹东. 骨形态发生蛋白治疗急性胫骨骨折的系统评价及Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 486-492.