同种异体骨髓间充质干细胞移植在心肌梗死后心室重建中的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.50.006

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
心室重构：心肌梗死导致心肌缺血性改变，一系列复杂的分子、细胞、细胞问质的改变导致心脏形状、大小、结构和功能的改变，即心室重构。心室重构是心梗后缺血性心脏病心力衰竭发展的重要原因。表现为：①基质重构：细胞外基质改变，不同类型的基质平衡改变。心肌重构：梗死区心肌细胞坏死，形态改变，数量减少，非梗死区心肌细胞肥厚；②血管重构：微血管周围心肌、基质的改变和上级血管狭窄甚至梗阻导致血管壁层以及内皮功能和血流的改变，最终引起整个心室功能和形态结构的改变。
骨髓间充质干细胞：是一种常用的干细胞类型，具有很强的多向分化能力。在移植之后，可以在梗死区发生分化，分化为心肌细胞等，并通过旁分泌机制，发挥出有效促进梗死心肌修复，抑制心室重构的效果。

摘要
背景：心肌梗死会导致心肌出现缺血性改变，引发心室重构的出现，成为导致死亡的重要原因。心肌梗死在中老年群体中多发，但患者自体骨髓间充质干细胞的增殖、分化能力较弱，为此需要积极的尝试予以同种异体干细胞移植，以获得更好的治疗效果。
目的：探讨同种异体骨髓间充质干细胞移植在心肌梗死后心室重建中的作用机制。
方法：取10只SD乳鼠与10只SD大鼠，进行骨髓间充质干细胞分离培养与鉴定。另取40只SD大鼠，随机分为4组，每组10只。模型组和乳鼠骨髓间充质干细胞移植组、大鼠骨髓间充质干细胞移植组均制备心肌梗死模型，假手术组予以假手术处理，造模后2个干细胞移植组分别予以相应的干细胞移植治疗。术后4周，检测各组大鼠的心功能；收集心脏组织标本，检测心脏梗死区胶原变化及梗死区血管密度。
结果与结论：①心功能指标：术后4周，模型组各项指标与其他3组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；乳鼠骨髓间充质干细胞移植组和大鼠骨髓间充质干细胞移植组各组指标均优于模型组，但2组间差异无显著性意义(P > 0.05)；②心肌梗死区胶原含量：术后4周，模型组梗死区可观察到存在大量胶原组织形成，乳鼠骨髓间充质干细胞移植组和大鼠骨髓间充质干细胞移植组的胶原组织明显减少(P < 0.05)；③心肌梗死区血管密度：术后4周，假手术组梗死区血管密度均显著大于其他各组(P < 0.05)，乳鼠骨髓间充质干细胞移植组、大鼠骨髓间充质干细胞移植组梗死区血管密度均显著大于模型组(P < 0.05)；④结果表明，心肌梗死后实施成年鼠、乳鼠同种异体骨髓间充质干细胞移植均可以有效改善大鼠心功能，减少心肌梗死区胶原的形成，延缓梗死后心室重构。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-5273-9435(卢长青)

关键词: 干细胞, 移植, 心肌梗死, 骨髓间充质干细胞, 干细胞移植, 同种异体, 心室重建, 心功能, 血管生成

Abstract:

BACKGROUND: Myocardial infarction leads to ischemic changes in the myocardium, triggering the emergence of ventricular remodeling, which is an important cause of death. Myocardial infarction is a common disease in the middle-aged and elderly population, but autologous bone marrow mesenchymal stem cells from these patients exhibit a weak ability of proliferation and differentiation. Therefore, a positive attempt of allogeneic stem cell transplantation is required in order to obtain better therapeutic outcomes.
OBJECTIVE: To explore the effect of allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells on ventricular remodeling after myocardial infarction.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells from 10 neonatal rats and 10 adult rats were isolated, cultured and identified. Another 40 rats were randomly assigned into four groups (n=10/group): model group, neonatal rat cell transplantation group, adult rat cell transplantation group, or sham group. Animal models of myocardial infarction were made in rats in the all groups except for the sham group in which the rats were given sham operation. Rats in the two cell transplantation groups were given the corresponding cell transplantation. Four weeks postoperatively, heart function of rats was detected in each group, and cardiac tissues were taken to detect changes in collagen formation and blood vessel density in the infarct area.
RESULTS AND CONCLUSION: Four weeks after surgery, rats in the model group showed significant changes in cardiac function indexes as compared with the other groups (P < 0.05), while compared with the model group, these cardiac function indexes improved in both two cell transplantation groups, but there was no significant difference between the two cell transplantation groups (P > 0.05). Meanwhile, compared with the model group, significantly decreased collagen formation and increased blood vessel density were found in both two cell transplantation groups (P < 0.05). Additionally, the vascular density of the infarct area was highest in the sham group (P < 0.05). Experimental results show that both neonatal and adult rat bone marrow mesenchymal stem cell transplantation can improve cardiac function of rats, reduce the formation of collagen in the infarct area and delay ventricular remodeling after myocardial infarction.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Myocardial Infarction, Ventricular Remodeling, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王娟，贾合磊，吉红亮，任冬冬，卢长青. 同种异体骨髓间充质干细胞移植在心肌梗死后心室重建中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(50): 7487-7493.

Wang Juan, Jia He-lei, Ji Hong-liang, Ren Dong-dong, Lu Chang-qing. Allogeneic bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for ventricular remodeling after myocardial infarction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(50): 7487-7493.

图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2015年6至12月在河南中医药大学实验室完成。

1.3 材料

实验动物：纳入10只SD乳鼠与10只SD大鼠，用于进行骨髓间充质干细胞培养与鉴定；另取40只SD大鼠进行随机分组实验，所有动物均购于上海加科生物科技有限公司。本次研究相关方案均提交本院医学伦理部门审核，并经批准，符合相关伦理学要求。

主要试剂与仪器：DMEM由北京雷根生物技术有限公司提供，胎牛血清由南京森贝伽生物科技有限公司提供，甲醛由上海远慕生物科技有限公司提供，Masson三色染色试剂盒由上海铭博生物科技有限公司提供，切片机由上海榕柏生物技术有限公司提供，CO₂培养箱由北京东胜创新生物科技有限公司提供，流式细胞仪由济南欧莱德仪器有限公司提供。

1.4 实验方法

骨髓间充质干细胞培养与鉴定^[7-8]：取10只SD乳鼠与10只SD大鼠，无菌条件下获得双侧胫、股骨骨髓，离心后接种在培养瓶中，添加DMEM(含胎牛血清)，置于CO₂培养箱中进行培养。1 d后换液，去除未贴壁细胞，继续培养，待细胞大部分贴壁后进行传代。收集两种P3细胞，利用流式细胞仪进行鉴定。

实验分组：40只SD大鼠，按随机数字表法分为4组，每组10只，分别设为模型组、假手术组、乳鼠骨髓间充质干细胞移植组、大鼠骨髓间充质干细胞移植组。

心肌梗死模型制备与干细胞移植治疗：参考文献[9-11]的方法，对模型组以及2个干细胞移植组大鼠进行心肌梗死模型制备，腹腔注射麻醉，心电图针形电极插入大鼠肢体皮下行心电图检测，在肺动脉圆锥和左心耳根部下方2 mm处进针结扎左冠状动脉前降支。假手术组予以假手术处理。模型制备后3 d，对乳鼠骨髓间充质干细胞移植组、大鼠骨髓间充质干细胞移植组分别予以乳鼠骨髓间充质干细胞、大鼠骨髓间充质干细胞150 μL (1×10¹⁰ L^-¹)梗死边缘区注射移植。

心功能检测^[12]：术后4周，对各组大鼠进行超声检查，检测心功能各项指标，包括左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、短轴缩短率。

梗死区胶原变化情况检测^[13-14]：心功能检测结束，麻醉后处死各组大鼠，即刻获得心脏标本，常规甲醛固定后石蜡包埋，利用切片机制备切片，厚度为4 μm，改良Masson三色染色后进行观察，利用图像分析系统对胶原面积在整个左室总面积中所占比例进行计算，获得胶原含量。

梗死区血管密度检测^[15]：利用光学显微镜对苏木精- 伊红染色切片进行观察，每张片均在梗死边缘区随机选择5个视野进行观察，进行血管数目计数，平均数，记录每个高倍视野(0.2 mm²)中的血管数目。

1.5 主要观察指标 术后4周，检测各组大鼠的心功能，收集心脏组织标本，检测梗死区胶原变化情况及梗死区血管密度。

1.6 统计学分析 完整记录与收集相关实验数据，使用SPSS 18.0软件进行统计学分析。组间比较予以单因素方差分析，差异有显著性意义的标准为P < 0.05。

讨论

近年来心脏病的治疗有了长足的发展，但是作为所有心脏病最终结局之一的心力衰竭却始终威胁着人类健康。导致心力衰竭的原因众多，最常见的病因之一为心肌梗死^[16-17]。心肌梗死会对患者的心肌产生不同程度的损伤，在心肌受到损伤之后，会出现心室重构。心肌梗死后心力衰竭的发生和发展与左心室重构紧密相关，由于心肌梗死后细胞坏死，有效的功能区域减小，心肌收缩力显著减弱或丧失。心肌细胞和血管等发生重构，进而导致心功能不全等的出现，以致发生心力衰竭而死亡^[18-20]。

以往的研究观点认为，哺乳动物心肌细胞属于终末分化细胞，无法再生。于是，人体的心肌细胞在发生缺血坏死之后，会出现心脏纤维组织增生的情况，心室重塑，导致患者的心功能呈现出不断下降的情况，并最终发展成慢性心力衰竭。以往对心肌梗死患者，临床大多采用药物或者常规手术方式进行治疗，但效果不佳。随着干细胞理论与技术的不断发展，临床开始积极的通过干细胞移植方式进行心肌梗死治疗，以达到理想的心室重建效果^[21]。通过对相应的干细胞进行移植，移植后梗死区的干细胞可以在一定的条件下发生分化为具有一定功能的心肌细胞，对心肌收缩和舒张功能予以有效的改善，防止心肌重塑^[22-24]。

骨髓间充质干细胞是一种常用的干细胞类型，具有很强的多向分化能力。在移植之后，可以在梗死区发生分化，分化为心肌细胞等，并通过旁分泌机制，发挥出有效促进梗死心肌修复，抑制心室重构的效果^[25-26]。骨髓间充质干细胞已经被证实可以分化为血管内皮细胞、平滑肌细胞等血管结构细胞，这些细胞参与血管发育，包括血管发生和血管生成作用。另外，在被移植之后，骨髓间充质干细胞可以与局部组织相互作用释放生长因子和细胞因子来抑制心肌细胞凋亡及支持心肌和血管的再生。体外研究已经证实，骨髓间充质干细胞可以分泌多种生长因子和细胞因子，包括血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子和转化生长因子等。以往黄日太等^[27]学者通过研究报道，骨髓间充质干细胞移植治疗香猪急性心肌梗死动物，移植的细胞可以在梗死区发生分化，形成再生心肌组织，有效减缓心室重构进程。同时还可以有效增强心肌收缩能力，达到改善心功能的效果。通过本次实验发现，术后4周模型组心功能各项指标与假手术组差异存在显著性意义，提示在发生心肌梗死之后，会对动物的心功能各项指标产生十分明显的影响，导致其发生异常的改变。实验结果还显示，模型组心功能各项指标与乳鼠骨髓间充质干细胞移植组、大鼠骨髓间充质干细胞移植组比较差异均存在显著性意义，各项指标均显著优于模型组。即提示，在经过不同类型骨髓间充质干细胞移植之后，动物的心功能得到了有效的改善。分析出现上述结果的原因，与骨髓间充质干细胞可分化为心肌细胞，实现心肌再生，以通过旁分泌机制分泌各种细胞因子等有关^[28-29]。移植入心肌并存活下来的干细胞除了部分起到再生心肌的作用外，其余干细胞则通过分泌出一些有益的生长因子，将那些幸存下来但逐渐枯萎的心肌细胞救活，这一作用机制即为旁分泌作用。另外，通过对乳鼠骨髓间充质干细胞移植组、大鼠骨髓间充质干细胞移植组左室收缩末期内、短轴缩短率进行比较，差异无显著性意义。即提示，利用乳鼠骨髓间充质干细胞与大鼠骨髓间充质干细胞进行移植治疗，均能够获得理想的心功能改善效果。心肌梗死后，胶原的大量形成是心室重构的重要表现^[30-32]。研究结果还显示，术后4周模型组梗死区可观察到存在大量胶原组织形成，乳鼠骨髓间充质干细胞移植组和大鼠骨髓间充质干细胞移植组的胶原组织形成明显减少。上述结果表明，在心肌梗死后实施成年鼠与乳鼠同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗可以有效减少胶原的形成。分析出现这一将结果的原因，是因为不同类型的骨髓间充质干细胞均可以对细胞外基质胶原的合成产生抑制作用，减少胶原的沉积，避免出现纤维化，从而达到减轻基质重构的效果^[33-35]。并且植入的骨髓间质干细胞具有较高弹性，还能加强心室壁应力，限制梗死后瘢痕组织过度扩张。在进入梗死区之后，干细胞还可以分化为血管平滑肌细胞和内皮组织细胞，形成新的毛细血管，并促进血管系统的增殖。进而增加梗死区的血管密度，改善血供，对心肌细胞予以保护^[36-37]。在此次实验中，经检测，术后4周假手术组的梗死区血管密度均显著大于其他各组，且乳鼠骨髓间充质干细胞移植组、大鼠骨髓间充质干细胞移植组梗死区血管密度均显著大于模型组。即提示心肌梗死后实施成年鼠与乳鼠同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗可以有效促进局部血管的形成。

综上所述，此次实验发现，对心肌梗死大鼠实施同种成年鼠与乳鼠同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗，均可以获得理想的效果，有效改善心功能，并抑制胶原的形成，延缓梗死后心室重构。目前骨髓干细胞移植已在动物实验上取得了巨大进展，但若要更大程度的应用于临床仍有许多问题急待解决，例如测定移植细胞的成活率并找到提高其成活率的方法等。为此，相关问题还有待在今后予以进一步的研究分析，以更好的为心肌梗死的临床治疗提供新思路。