补肾益智方对D-半乳糖联合β-淀粉样蛋白25-35致老年痴呆模型
大鼠的作用及机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.49.002

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
D-半乳糖制备衰老模型：D-半乳糖联合β-淀粉样蛋白25-35制备老年痴呆模型，能很好的模拟阿尔茨海默病复杂的病因病理和生化变化过程。大量研究证实，D-半乳糖制备的衰老模型是目前国内都认可的老年痴呆模型制备方法，可以有效的模拟与人类自然衰老相似的认知障碍、细胞退行性改变、生化改变及免疫功能低下等表现。
阿尔茨海默病：是一种以大脑神经退化为主的疾病，主要病理表现为中枢胆碱能神经元大量死亡及丢失，神经纤维缠结，神经炎斑，β-淀粉样蛋白沉积等，继而导致胆碱能神经损害、炎症反应，胆碱乙酰基转移酶水平下降和乙酰胆碱合成减少等。

摘要
背景：中药复方具有多靶点的作用特点，能通过多个环节对中枢胆碱能神经系统进行调节，有效改善患者的认知功能。研究证明，补肾益智方可以改善老年痴呆患者的症状，提高生活质量。
目的：探讨补肾益智方对D-半乳糖联合β-淀粉样蛋白25-35致老年痴呆模型大鼠的作用及其机制。
方法：选用健康成年SD大鼠，随机分为对照组、模型组、阳性药物组(多奈哌齐组0.3 g/kg)、补肾益智方20 g/kg组及补肾益智方5 g/kg组，每组10只，采用皮下注射D-半乳糖联合双侧海马注射β-淀粉样蛋白25-35构建痴呆大鼠模型。用补肾益智方药液灌胃治疗8周后，釆用Morris水迷宫测试检测大鼠的学习记忆能力；采用高频刺激Schaffer侧支，在同侧海马CA1区诱导长时程增强的方法检测大鼠海马神经元突触可塑性的变化；同时检测大鼠脑组织多种指标，包括超氧化物歧化酶活性、丙二醛、单胺氧化酶B、胆碱乙酰基转移酶、乙酰胆碱酯酶、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1等。
结果与结论：①水迷宫实验中补肾益智方组可显著改善大鼠的学习记忆能力，模型组与对照组相比海马CA1区长时程增强幅度显著降低(P < 0.05)；②补肾益智方5 g/kg组与模型组比较，群体峰电位幅度差异无显著性意义；补肾益智方20 g/kg组群体峰电位幅度明显高于模型组和补肾益智方5 g/kg组，能减轻D-半乳糖联合β-淀粉样蛋白25-35对海马CA1区长时程增强的抑制作用，改善突触功能的可塑性；③补肾益智方组能显著降低肿瘤坏死因子α和白细胞介素1的水平(P < 0.05)，明显提高胆碱乙酰基转移酶和超氧化物歧化酶活性(P < 0.05)，降低乙酰胆碱酯酶活性及丙二醛水平(P < 0.05)；④结果提示，
补肾益智方对阿尔茨海默病大鼠模型学习记忆的改善作用可能与抑制脑内炎症反应、调节胆碱能系统、抗氧化作用等有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
ORCID: 0000-0001-7427-3907(王改凤)

关键词: 实验动物, 神经损伤与修复动物模型, 补肾益智方, 老年痴呆, 抗氧化, 炎症因子

Abstract:

BACKGROUND: Traditional Chinese medicine compound has the characteristics of multiple targets, which can regulate the central nervous system through a plurality of links, and can effectively improve the cognitive function of patients. Bushen Yizhi Decoction has been proven to improve the symptoms of patients with Alzheimer’s disease, thereby improving the quality of life.
OBJECTIVE: To explore the effects of Bushen Yizhi Decoction on learning and memory abilities in seniledementia rats induced by D-galactose combined with amyloid-beta 25-35 and the underlying mechanism.
METHODS: Healthy adult Sprague-Dawley rats were equivalently randomized into groups of control, model, positive drug (0.3 g/kg donepezil), high-dose drug (20 g/kg Bushen Yizhi Decoction) and low-dose drug (5 g/kg Bushen Yizhi Decoction). Model rats with Alzheimer's disease were established by subcutaneous injection of D-galactose and bilateral hippocampuses injected with amyloid-beta 25-35. After 8-week treatment with intragastric administration of Bushen Yizhi Decoction, the spatial learning and memory capacity were examined by the Morris water maze. High frequency stimulation was given on CA3 Schaffer collateral-commissural pathway, and long-term potentiation in hippocampal CA1 region was recorded to detect the change of synaptic plasticity in rat’s hippocampal neurons, and the levels of superoxide dismutase, malondiadehyde, monoamine oxidase B, choline acetyltransferase, acetylcholin esterase, tumor necrosis factor-α and interleukin-1 were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Morris water maze tests showed that the groups of Bushen Yizhi Decoction could remarkably improve the spatial learning and memory capacity of rats. Compared with the control group, the long-term potentiation in hippocampal CA1 region was significantly suppressed in model rats (P < 0.05). (2) There was no significant difference in the phase-shift amplitude between the model and the low-dose drug groups; however, the phase-shift amplitude in the high-dose drug group was significantly higher than that in the model and low-dose drug groups, high-dose drug relieved the suppression of long term potentiation, and the synaptic plasticity was significantly improved. (3) Bushen Yizhi Decoction could significantly decrease the levels of tumor necrosis factor-α, interleukin-1 and malondiadehyde as well as the activity of acetylcholin esterase, and significantly increase the activity of superoxide dismutase and choline acetyltransferase (P < 0.05). (4) These results suggest that the nootropic effect of Bushen Yizhi Decoction on the rat model of Alzheimer’s disease may be related with the inhibition of inflammation, adjustment of cholinergic nerve transmitter activity and antioxidation.

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Key words: Models, Animal, Drugs, Chinese Herbal, Alzheimer Disease, Antioxidants, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王改凤. 补肾益智方对D-半乳糖联合β-淀粉样蛋白25-35致老年痴呆模型
大鼠的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(49): 7307-7313.

Wang Gai-feng. Effects of Bushen Yizhi Decoction on Alzheimer’s disease model rats induced by D-galactose combined with amyloid-beta 25-35 and the underlying mechanism[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(49): 7307-7313.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 50只大鼠造模成功后，所有大鼠无死亡情况，均顺利进入后续试验。

2.2 模型稳定性 D-半乳糖致老年痴呆是一种已经很成熟的老年痴呆模型，有大量研究证实这种模型方法能很好地模拟人类痴呆情况。

2.3 Morris水迷宫测试结果 Morris水迷宫实验结果显示，定位航行实验中，与对照组相比，模型组在的逃避潜伏期明显延长；与模型组相比，药物组逃避潜伏期均明显缩短(表1)，表明大鼠的空间学习能力较模型组有所提高。空间探索实验中，模型组大鼠在目标象限内游泳的距离比对照组明显降低；与模型组相比，药物组大鼠在目标象限内游泳的距离均增多(表2)。

2.4 电生理学检测结果对各组大鼠进行高频刺激后，群体峰电位的幅度都较刺激前有所增加，表明各组大鼠海马都有长时程增强的形成(表3)，高频刺激后，模型组群体峰电位幅度有一定程度的增强，但明显低于对照组；补肾益智方20 g/kg组和补肾益智方5 g/kg组经过高频刺激后群体峰电位幅度明显大于模型组；从刺激后群体峰电位幅度变化可看出，模型组和在60 min内群体峰电位幅度均低于对照组、补肾益智方20 g/kg组和补肾益智方5 g/kg组，对照组、补肾益智方20 g/kg组和补肾益智方5 g/kg组在所记录的60 min内群体峰电位幅度变化不是很明显。

2.5 对老年痴呆模型的抗氧化作用与胆碱能神经影响补肾益智方对老年痴呆模型大鼠大脑组织超氧化物歧化酶活性、丙二醛及单胺氧化酶B水平的影响，实验结果见表4，结果表明，与对照组相比，老年痴呆模型组大鼠大脑中超氧化物歧化酶活性显著降低，丙二醛水平显著提高，给药补肾益智方后，补肾益智方20 g/kg， 5 g/kg组与模型组相比，大鼠大脑组织中超氧化物歧化酶活性显著提高，丙二醛与单胺氧化酶B水平显著降低。

补肾益智方对老年痴呆模型大鼠脑组织胆碱乙酰基转移酶与乙酰胆碱酯酶活性的影响，实验结果见表5，结果显示，补肾益智方20 g/kg，5 g/kg组与模型组相比，大鼠大脑组织中乙酰胆碱酯酶活性显著提高，胆碱乙酰基转移酶活性显著降低。

2.6 补肾益智方对脑内炎症反应的影响补肾益智方对老年痴呆模型海马组织肿瘤坏死因子α及白细胞介素1的影响，实验结果见表6，结果表明，与对照组相比，老年痴呆模型组大鼠海马组织炎症因子肿瘤坏死因子α及白细胞介素1水平显著提高，补肾益智方20，5 g/kg组与模型组相比，大鼠脑组织炎症因子肿瘤坏死因子α及白细胞介素1水平显著降低。

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引言

材料方法

1.1 实验材料实验于2014年1月至2015年5月在河南中医药大学第二附属医院脑科完成。

药材和试剂：补肾益智方，由蛇床子(Fructus Cnidii)、枸杞子(LycIIfructus)、女贞子(Fructus Ligustri Lucidi)、人参(Panax ginseng C. A. Meyer)等组成^[18]，均购于广东致信中药饮片有限公司，取处方量的补肾益智方药材加10倍量纯水，加热回流提取3次(2，1.5，1 h)，合并提取液浓缩至药材量；加入2倍体积无水乙醇，搅拌，静置过夜；抽滤，制成含生药量为2 g/mL浓缩液，4 ℃保存；多奈哌齐(原料药，批号：141011，纯度：98%)，由重庆医药工业研究院提供；D-半乳糖，由北京化工厂提供，批号：140405，用时以无菌生理盐水配成5%溶液；β-淀粉样蛋白 (amyloid β-protein，Aβ)25-35为Sigma公司产品，批号：158K5624，用前将Aβ25-35溶于无菌生理盐水中，终浓度为2 g/L，密封后置于37 ℃培养箱中保存；脑组织肿瘤坏死因子α与白细胞介素1测定试剂盒，由北京普尔伟业生物科技有限公司提供，批号分别为20130425，20130421；胆碱乙酰基转移酶、乙酰胆碱酯酶、单胺氧化酶B、超氧化物歧化酶、丙二醛试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 实验动物 SD大鼠50只，清洁级，雌雄各半，质量180-220 g，由广州中医药大学动物实验中心提供，动物合格证号：SCXK(粤)2008-0020。

1.3 造模方法

1.3.1 建立阿尔茨海默病模型实验动物在标准环境适应性饲养1周后，模型组皮下注射D-半乳糖 150 mg/(kg•d)，连续6周，第7周双侧海马注射4 nmol/L的Aβ25-35^[19]，复制老年痴呆模型。大鼠随机分为5组，每组10只，分别为对照组、模型组、阳性药物组(多奈哌齐3 g/kg)与补肾益智方20 g/kg组、补肾益智方5 g/kg组。给药量按人体剂量的7倍给药。模型成功后，第2天开始灌胃给药，每天给药1次，对照组和模型组给予等量生理盐水，连续8周。各组动物每周记录1次体质量，调整注射剂量。

1.4 测试方法

1.4.1 行为学测试大鼠灌胃治疗8周之后，对其进行行为学测试，即Morris水迷宫测试^[20]，测试分为3个阶段，第1阶段进行大鼠适应训练，时间为1 d；第2阶段正式实验从第1-4天为定位航行实验；第3阶段为空间探索实验，时间为1 d。具体操作见图1。

迷宫适应性实验：在正式检测前，先进性大鼠的适应性训练，先将大鼠放于平台之上，练习站台；站台熟练后，进行入水训练，使大鼠熟悉水迷宫的环境，最后练习从不同的象限入水，如果找不到站台，予以引导至站台，停留1 min。

定位航行实验：将大鼠面向池壁，置于水池内进行试验，记录大鼠找到平台的时间，以逃避潜伏期作为反应大鼠学习记忆障碍的指标，每天进行2次试验，分别于上午和下午每次试验时间1 min，历时4 d，记录动物逃避潜伏期和游出率。

空间探索实验：定位航行实验结束后，将平台撤去，从目标象限的对角象限将动物面向池壁置于池内，使动物在池内游泳1 min，记录动物在目标象限的活动路程。

1.4.2 电生理学检测在Morris水迷宫实验结束后，大鼠以20%乌拉坦腹腔麻醉，进行在体电生理学实验^[21]，将麻醉大鼠固定在脑立体定位仪上，首先进行颅骨钻孔，之后缓慢将电极穿过大鼠皮质至海马记录最大的群体峰电位，上述所有的操作均在屏蔽笼内完成。实验过

程中以群体峰电位幅度相对值(%)为观测指标，将单个刺激诱发的群体峰电位30 min作为基值，然后进行高频刺激诱发长时程增强，记录高频刺激后60 min内的群体峰电位诱发长时程增强，具体测量方法是，群体峰电位平均幅值高于基线值至少20%以上并持续30 min以上者可视为产生了长时程增强，连续观察记录60 min，用电热毯维持动物体温于37-38 ℃。见图2。

1.5 主要观察指标

1.5.1 脑组织超氧化物歧化酶活性、丙二醛和单胺氧化酶B水平测定行为学检测后，将大鼠颈动脉放血处死，即刻取出脑组织，用预冷生理盐水冲洗，称质量，于冰冷生理盐水中进行匀浆，制备10%组织匀浆，低温离心机离心(3 000 r/min，离心20 min)，取上清液-20 ℃冰箱保存待测，依试剂盒说明书。

1.5.2 脑组织胆碱乙酰基转移酶与乙酰胆碱酯酶活性的测定所有操作按照试剂盒进行，采用考马斯亮蓝法测定蛋白，最后用光度计测定各管吸光度，计算胆碱乙酰基转移酶及乙酰胆碱酯酶的活性。

1.5.3 脑组织肿瘤坏死因子α与白细胞介素1水平测定取脑组织，采用放射免疫分析法测定脑组织肿瘤坏死因子α与白细胞介素1，测定方法按试剂盒说明操作。

1.6 统计学分析所有数据输入SPSS 20.0软件进行处理，计量资料用x(_)±s表示，2组计量资料比较采用t 检验，用方差分析方法检验显著性意义，取P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

老年性痴呆是一种以大脑神经退化为主的疾病，主要病理表现为中枢胆碱能神经元大量死亡及丢失，神经纤维缠结，神经炎斑，Aβ沉积等^[22]，继而导致胆碱能神经损害、炎症反应，胆碱乙酰基转移酶水平下降和乙酰胆碱合成减少等^[23]。

目前用于老年痴呆研究的动物模型比较多，常用的有自然衰老认知障碍模型、衰老加速小鼠模型、免疫损毁脑胆碱能动物模型、D-半乳糖诱导的衰老模型、铝损害模型、神经兴奋毒性、东莨菪碱致老年痴呆模型等^[24-30]，这些模型基本上都可以反映学习记忆功能退化。文章采用D-半乳糖联合Aβ25-35制备老年痴呆模型，该模型能很好的模拟阿尔茨海默病复杂的病因病理和生化变化过程。大量研究证实，D-半乳糖制备的衰老模型是目前国内都认可的老年痴呆模型制备方法，可以很好的模拟与人类自然衰老相似的认知障碍、细胞退行性改变、生化改变及免疫功能低下等表现^[31-34]。另外，由于Aβ25-35是诱发老年痴呆的共同通路，是其形成和发展的主要原因，因此本实验模型是比较理想的老年痴呆模型。

学习记忆障碍是老年痴呆患者另一个重要症状，又是可以区别于老年痴呆，形成一个独立的病症，目前对于老年痴呆学习记忆障碍检测有一些经典的方法，比较常用的有迷宫法、避暗法、跳台法等。这些基本都能在一定程度上反映动物学习记忆能力灯等。本实验所选用的迷宫法是研究学者们最常用的一种方法，可以避免跳台法和避暗法等逼迫动物学习的缺点，可以减少了动物的恐惧心理，避免对检测结果的干扰。

近年研究显示，老年痴呆患者的学习记忆功能减退与海马神经元突触的可塑性变化有关。大量研究表明，由强直刺激作用于兴奋性突触传递通路而诱发的突触传递效能长时间增强的现象，即长时程增强，与学习记忆过程密切相关，可以反映突触可塑性变化中神经系统的电生理活动，并且也可以作为衡量神经科学突触可塑性一个主要的生理学指标。所以本实验也将电生理学作为老年化痴呆模型的一个检测指标。

药理学研究表明，补肾益智方作为中医里面的经典复方，具有补肾、益气、生髓、养脑作用等多种药理作用^[35]，在文章中根据阿尔茨海默病的发病及机制，用D-半乳糖联合Aβ25-35 产物诱导建立阿尔茨海默病大鼠模型，采用多奈哌齐作为阳性对照药物，结果显示，拟阿尔茨海默病模型大鼠水迷宫测试时学习记忆能力显著降低，补肾益智方20 g/kg，5 g/kg组大鼠逃避潜伏期均明显短于模型组大鼠，说明此方具有改善阿尔茨海默病模型大鼠的学习记忆功能的作用。同时，中枢神经炎性损害也是老年痴呆模型的主要病理特点，炎症过程产生的白细胞介素1和肿瘤坏死因子α等细胞因子，最终引起神经元损伤^[34]，出现痴呆症状。阿尔茨海默病模型动物大鼠组织中肿瘤坏死因子α及白细胞介素1水平明显增高，说明本实验很好的模拟了老年痴呆模型的脑内炎症反应，补肾益智方显著降低拟老年痴呆模型动物大鼠海马组织肿瘤坏死因子α及白细胞介素1水平，提示补肾益智方可抑制肿瘤坏死因子α 及白细胞介素1的过量产生，进而抑制中枢慢性炎症。胆碱能系统的大量损伤也是老年痴呆患者认知能力减退的主要原因，乙酰胆碱酯酶和胆碱乙酰基转移酶在治疗老年痴呆方面也有比较重要的意义，补肾益智方可通过降低碱酯酶及胆碱乙酰基转移酶活性，增强中枢胆碱能神经系统的功能。并且有报道表明，补肾益智方中首乌和枸杞有抗自由基作用^[36-37]，同时，大量研究表明，超氧化物歧化酶、丙二醛与单胺氧化酶B参与自由基的形成，而脑组织中自由基的过多，氧自由基引起的过氧化损伤是阿尔茨海默病等老年疾病发病的重要因素^[38]，实验结果显示，补肾益智方可明显提高模型组超氧化物歧化酶的活性，显著降低丙二醛、单胺氧化酶B的水平，提示补肾益智方可能通过抑制氧自由基的形成发挥改善老年痴呆大脑损伤的作用，从而提高学习认知能力。本实验较好的分析了补肾益智方治疗老年痴呆的作用机制。

综上所述，实验采用D-半乳糖联合Aβ25-35制备老年痴呆模型，通过对其进行行为学测试，电生理学测试，以及各项脑组织指标的考察，发现补肾益智方对老年痴呆模型学习记忆障碍具有明显改善作用，很好的揭示其作用机制。

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