骨髓间充质干细胞移植治疗重症急性胰腺炎肺损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.45.013

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
DAPI：即4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。
C-反应蛋白：人类C-反应蛋白是指在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白质(急性蛋白)。C-反应蛋白可以激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用，从而清除入侵机体的病原微生物和损伤，坏死，凋亡的组织细胞，在机体的天然免疫过程中发挥重要的保护作用。

摘要
背景：研究发现，骨髓间充质干细胞能随血液循环到身体其他器官组织，能够促进胰腺组织修复损伤，能够减轻肺纤维化，对胰腺和肺部损伤有不同程度的治疗效果。
目的：观察骨髓间充质干细胞移植后对大鼠重症急性胰腺炎肺损伤造成的组织损伤的治疗作用。
方法：应用4%牛磺胆酸钠逆行注射法制备大鼠急性胰腺炎肺损伤模型。SD大鼠随机分成3组，移植组大鼠造模成功24 h后进行骨髓间充质干细胞经尾静脉移植；对照组只对尾静脉注射等量生理盐水；正常组大鼠不做任何处理。移植24 h后取各组部分胰腺组织和肺组织进行苏木精-伊红染色；取胰腺组织和肺组织检测肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β mRNA表达量；用ELISA试剂盒测定血清C-反应蛋白和肿瘤坏死因子α水平。
结果与结论：①苏木精-伊红染色显示，造模后的大鼠胰腺组织损伤区域有大量炎性细胞浸润，腺泡的结构不完整，小叶结构破坏严重，肺部组织肺泡分界不明显，肺泡壁变厚，肺泡内有大量的炎性细胞浸润，表明实验所用模型建模成功。移植后，胰腺组织受损部位炎性细胞浸润减少，小叶结构清晰完整，腺泡未见出血；肺部组织结构清晰，肺泡壁完整，间距有所减宽；②免疫组织化学结果显示，移植经过DAPI标记的骨髓间充质干细胞大量聚集在胰腺组织和肺组织，不均匀分布在受损部位。对照组大鼠胰腺组织和肺组织均未见DAPI免疫荧光显色。这显示骨髓间充质干细胞经大鼠尾静脉注射后通过血液迁移至受损的胰腺组织和肺组织处，进一步修复损伤区域；③RT-PCR检测结果表明：移植后大鼠胰腺组织和肺组织的肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β含量明显低于对照组(P < 0.05)；④血清结果显示，模型组C-反应蛋白、肿瘤坏死因子α含量较正常对照组显著升高(P < 0.01)，而移植组C-反应蛋白、肿瘤坏死因子α含量较模型组显著下降(P < 0.05)；⑤结果表明，骨髓间充质干细胞能够修复重症急性胰腺炎肺损伤模型，可能与其减少炎症反应和转化为胰腺组织和肺组织相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-6717-7092(陈进玲)

关键词: 干细胞, 移植, 重症急性胰腺炎肺损伤, 骨髓间充质干细胞, 干细胞移植, 大鼠尾静脉

Abstract:

BACKGROUND: A large number of studies have confirmed that bone marrow mesenchymal stem cells can couple with the circulation of the blood to other organs, promote pancreatic tissue repair injury and reduce pulmonary fibrosis, which have certain therapeutic effects on pancreas and lung injuries.
OBJECTIVE: To study the therapeutic effect on severe acute pancreatitis-associated lung injury in rats after the transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Animal models of severe acute pancreatitis-associated lung injury were prepared in rats via retrograde injection of 4% sodium taurocholate. Sprague-Dawley rats were randomized into three groups and received bone marrow mesencnymal stem cell injection via the tail vein in transplantation group, the same volume of normal saline in control group, or no treatment in normal groups. All the treatments in each group were performed 24 hours after modeling. Twenty-four hours after transplantation, hematoxylin-eosin staining of the pancreatic and lung tissues was performed. mRNA expressions of tumor necrosis factor-α and interleukin-1β in pancreatic and lung tissues were detected. ELISA kit was used to detect levels of serum C-reactive protein and tumor necrosis factor-α.
RESULTS AND CONCLUSION: After modeling, under hematoxylin-eosin staining, there were a large number of inflammatory cells infiltrating in the damaged pancreatic tissues, accompanied by incomplete acinar structures, seriously destroyed lobular structures, alveolar fusion in the lung tissues, thickening of the alveolar walls, and a large amount of inflammatory cells infiltrating in the alveoli. These findings indicated successful modeling of severe acute pancreatitis-associated lung injury in rats. After cell transplantation, the number of infiltrated inflammatory cells in the damaged pancreatic tissue was reduced, with clear lobular structures and no bleeding from the acini; the structure of lung tissues was clear, with complete alveolar walls, and the width of alveolar space was reduced. Immunohistochemical results showed that transplanted DAPI-labeled bone marrow mesenchymal stem cells were aggregated in the pancreas and lung tissue, and uneven distributed in the damaged area. No DAPI expression in the pancreas and lung tissue was found in the control group, indicating transplanted bone marrow mesenchymal stem cells migrated into the damaged pancreas and lung tissue through the blood circulation, to further repair the damage area. RT-PCR test results showed that compared with the control group, bone marrow mesenchymal stem cell transplantation significantly reduced the levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-1β in the pancreatic and lung tissues (P < 0.05). Higher levels of C-reactive protein and tumor necrosis factor-α were found in the control group compared with the normal group (P < 0.01), while the lower levels were obtained in the control group (P < 0.05). To conclude, our findings suggest that bone marrow mesenchymal stem cell transplantation is an effective therapy for severe acute pancreatitis-associated lung injury, and its mechanism may be associated with the reduction of inflammatory reactions and translation into the pancreas and lung tissue.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Pancreatitis, Acute Necrotizing, Mesenchymal Stem Cells, Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

陈进玲，陈艳霞，张志勇. 骨髓间充质干细胞移植治疗重症急性胰腺炎肺损伤[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(45): 6774-6781.

Chen Jin-ling, Chen Yan-xia, Zhang Zhi-yong . Transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells in the treatment of severe acute pancreatitis-associated lung injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(45): 6774-6781.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 实验中所用到的SD大鼠30只，全部进入结果分析，无脱失。

2.2 流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞结果 流式检测结果显示，原代培养细胞的细胞群中CD29⁺CD44⁺CD45^-群为骨髓间充质干细胞细胞群，经过传代培养后CD29⁺CD4⁺CD45^-群所占比例逐渐增大，至P3代时，CD29⁺CD44⁺CD45^-群达到95%以上。经过连续传代培养，骨髓间充质干细胞的百分比不断升高，到P3代CD29⁺CD44⁺CD45^-群达到97%，见图1。

2.3 大鼠移植组胰腺组织和肺组织DAPI染色结果 移植组胰腺组织和肺组织可见DAPI标记的骨髓间充质干细胞，胞核呈亮蓝色，见图2。

2.4 各组大鼠胰腺组织和肺组织苏木精-伊红染色结果

2.4.1 胰腺组织 结果显示，与正常组比较，模型组胰腺组织呈现成片坏死，结构界限模糊不清，腺泡结构明显被破坏，整个组织充满炎性细胞浸润；移植组胰腺组织出血量及坏死部位均比前者减少，炎症程度减轻，结构界限清晰，腺泡大小规则可见。

病理评分结果显示：模型组19.34±1.78，移植组9.67±0.99，两者相比差异有显著性意义，移植组显著性低于模型组(P < 0.05)，见图3。

2.4.2 肺组织 结果显示模型组比正常组肺组织间质水肿严重，充满炎性细胞浸润，肺泡间隔变大，病理情况严重；移植组肺组织结构清晰，间距未见增宽，无水肿，病理情况有所减轻。

病理评分结果显示：模型组肺泡炎4.09±0.78，移植组肺泡炎2.67±0.59，移植组显著性低于模型组，两者相比差异有显著性意义(P < 0.05)；模型组肺纤维化1.99±0.03，移植组肺纤维化1.22±0.11，两者相比移植组有所降低，但差异无显著性意义，见图4。

2.5 肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β mRNA表达量 表1 mRNA表达结果显示：与对照组比较，模型组胰腺组织和肺组织中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β mRNA的表达量显著高于正常组，差异有显著性意义 (P < 0.05，P < 0.01)；与模型组对比，移植组中胰腺组织和肺组织中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β显著低于模型组，差异有显著性意义(P < 0.05，P < 0.01)。

2.6 血清中血清C-反应蛋白和肿瘤坏死因子α水平 表2结果显示：与对照组对比，模型组血清中C-反应蛋白、肿瘤坏死因子α水平显著高于正常组，差异有显著性意义(P < 0.05)；与模型组对比，移植组血清C-反应蛋白和肿瘤坏死因子α水平显著低于模型组，差异有显著性意义(P < 0.05)。

参考文献

[1] Marsboom G, Janssens S. Endothelial progenitor cells: new perspectives and applications in cardiovascular therapies.Expert Rev Cardiovasc Ther.2008；6(5): 687-701.
[2] Hattar K, Fink L, Fietzner K,et al. Cell density regulates neutrophil IL-8 synthesis: role of IL-1 receptor antagonist and soluble TNF receptors. J Immunol. 2001;166(10):6287-6293.
[3] Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science.1998;282:1145-1147.
[4] Kim JH, Auerbach JM, Rodriguez JA, et al. Dopamine neurons derived fromembryonic stem cells function in an animal model of Parkinson disease. Nature. 2002; 418:50-56.
[5] Inoue M, Ino Y, Gibo J, et al. The role of MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1)in experimental chronic pancreatitis model induced by dibutyltin dichloride in rats. Pancreas.2002;25:e64-70.
[6] Friedenstein AJ, Gorskaja JF, Kulagina NN. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Hematol. 1976;4:267-274
[7] Pournasr B, Mohamadnejad M, Bagheri M, et al. In vitro differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells. Archives of iranian Medicine. 2011;4(14):244-249.
[8] Tiaii H, Bharadwaj S,Liu Y, et al. Differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into bladder cells: potential for urological tisstue engineering. Tissue Eng Part A.2010;16(5):1769-1779.
[9] Farrell E,Both SK. Odorfer KI, et al. In-vivo generation of bone via endochondral ossification by in-vitro chondrogenic priming of adult human and rat mesenchymal stem cells. Orthop Res.2011; 29(7): 1075-1080.
[10] Polisetti N,Chaitanya VG,Babu PP, et al. Isolation,characterization and differentiation potential of rat bone marrow stromal cells. Neurol India 2010; 58:201-208.
[11] 王丹丹,张华勇,顾志.骨髓间充质干细胞对原发性胆汁性肝硬化动物模型治疗作用研究初探[J].中华风湿病学杂志,2009,13(11): 778.
[12] 李华,乙肝患者骨髓间充质干细胞乙肝病毒感染状况的研究[M].中山大学,2007.
[13] 曾令兰,熊开钧,黄华芳,等.乙肝病毒体外感染正常人骨髓中3种细胞的动态研究[J].同济医科大学学报,1996.25(2): 128-130.
[14] 中华人民共和国科学技术部.关于善待实验动物的指导性意见.2006-09-30.
[15] 邱嘉华,陈奕金,贾林,等.牛磺胆酸钠诱导急性坏死性胰腺炎大鼠模型的理想浓度[J].中华胰腺病, 2010,10(2): 120-122.
[16] Tokalov SV，Gruener S，Schindler S, et al. A number of bone marrow mesenchymal stem but neither phenotype nor differentiation capacities changes with age of rats. Mol Cells. 2007;24(2):255-260.
[17] Hudson LD, Steinberg KP. Epidemiology o f acute lung in-jury and A RDS. Chest.1999;116:74S .
[18] Steer M. Relationship between pancreatitis and lung diseases. Respir Physiol. 2001;1 28:13 .
[19] 程石,何三光,张佳林.肺泡巨噬细胞活化在急性坏死性胰腺炎大鼠肺损伤中的作用[J]. 中华外科杂志, 2002,40(8): 609.
[20] Aho HJ, Koskensalo SM, Nevalainen TJ. Experimental pancreatitis in the rat. Sodium taurocholate-induced acute hacmorrhagic pancreatitis. Scand J Gastroenterol.1980; 15(4):411-416.
[21] 习佳飞,王锰芳,裴雪涛.成体干细胞及其在再生医学中的应用[J].生命科学,2006,18:328-332.
[22] Tamir APT, Stetler K, Stetler K,et al.Stem eell faetor inhibits erythroid differentiations by modulating the activity of G1 cyclin dependent kinase complexes: a role for P27 in erythroid differentiation coupled G1 arrest .CellGrowth.2000:11:269-277.
[23] Quirici N, Soligo D , Bossolaseo P , et al. Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by anti-nerve growth factor receptor antibodies. Exp Hematol.2002: 30(7):78-791.
[24] Rojas M, Xu J. Bone marrow-derived mesenehymal stem cells in repair of the injured lung.Am J Respir Cell Mol Biol.2005;33:145-152.
[25] 江学良,李兆申,崔慧斐.骨髓间充质干细胞在胰腺生理更新和病理再生中的作用[J].世界华人消化杂志,2006: 14(4): 398-404.
[26] Cui HF, Bai ZL. Protective effects of transplanted and mobilized bone marrow stem cells on mice with severe acute panereatitis. World J Gastroenterol.2003; 9(10): 2274-2277.
[27] 王欣燕, 吴晓梅,康小文,等.骨髓间质干细胞移植对博莱霉素诱导大鼠肺纤维化的治疗作用[J].中国呼吸与危重监护杂志,2009,1(8):57-62.
[28] 李奇智,吴新民,郭亚民.相关细胞因子在重症急性胰腺炎相关肺损伤中的作用[J].中国普外基础与临床杂志,2011, 3(18):258-260.
[29] 姜战武,李厚祥,邵苏吉.血清PLA2对急性胰腺炎的诊断和预后判断价值[J].南通医学院学报,1996,16(3): 326-327.
[30] 付林,程书榜,高海斌,等. IL-10区域动脉灌注减轻急性胰腺炎大鼠肺损伤的实验研究[J].中国普通外科杂志, 2006, 15(8): 619-621.
[31] 莫坚,刘欣,何海燕,等.倍他米松对大鼠重症急性胰腺炎肺损伤NF-JB、ICAM-1及IL-6的影响[J].湖北民族学院学报:医学版, 2005,22(4):14-16.
[32] Seamas C, Strieter RM , Reid PT, et al. The association between mortality rates and decreased concent rations of interleukin- 10 and interleukin- 1 receptor antagonist in the lung fluids of patient s with the adult respiratory distress syndrome. Ann Intern Med.1996;125(3):191.
[33] Leme AS, Lichtenstein A, Arantes Costa FM, et al. Acute lung injury in experimental pancreatitis in rats: pulmonary protective effects of crotapotin and N-acetylcysteine.Shock.2002;18(5):428-433.
[34] 陆海华,史忠,刘波,等.急性胰腺炎相关性肺损伤早期血清TNF-α、IL-1、IL-6的变化及其临床意义[J].重庆医学,2007, 36(18): 1818-1819.
[35] Altavilla D, Famulari C, Passaniti M, et al. Lipid peroxidation inhibition reduces NF-JB activation and attenuates cerulein-induced pancreatitis. Free Radic Res.2003; 37(4):425-435.
[36] 周粼,梁道明,陈嘉勇,等.依达拉奉对大鼠重症急性胰腺炎肺损伤的影响[J].中国普外基础与临床杂志, 2010,17(2): 125-154.

引言

重症急性胰腺炎是指急性胰腺炎伴随着脏器功能障碍，出现全身或局部组织并发症，造成血液渗出、低血容量和脏器功能障碍等综合征^[1]，其最常见的病发症之一是肺损伤，对其机制尚未十分明确，以致针对其治疗方案是一项重要课题^[2]。现代治疗手段在不断前进，进行干细胞移植体内，利用其高度增殖分化的能力，达到修复损伤的组织器官并且起到再生组织目的^[3-4]。干细胞移植为修复急性重症胰腺炎并治疗其带来的并发症肺损伤带来了新的治疗方向^[5]。因为自身胰腺干细胞的数量较少，再生和分化的能力较弱，无法满足修复损伤的组织需要，寻找能够代替其或者能转化为胰腺干细胞的方法迫在眉睫。

骨髓间充质干细胞属于中胚层的一类多能干细胞，属于多功能组织工程种子细胞，有很广泛的应用前景。骨髓间充质干细胞具有取材方便、对人损伤性小和移植免疫排斥影响小等优点，在临床上被广泛应用于各种疾病的组织修复与再生^[6-10]。它能够在特定的条件下，分化成为血管、肺脏、心脏、胰腺、肌肉和神经细胞的组织细胞。国内外文献报道，移植骨髓间充质干细胞后，其能参与到胰腺的生理再生和病理的修复，可以抑制炎症反应。所以本实验采用骨髓间充质干细胞作为移植细胞^[11-13]。

实验是通过应用4%牛磺胆酸钠逆行注射法制备大鼠急性胰腺炎肺损伤模型，对模型大鼠进行骨髓间充质干细胞移植，研究骨髓间充质干细胞对重症急性胰腺炎肺损伤大鼠的治疗作用。

材料方法

1.1 设计 随机分组细胞学动物实验。

1.2 时间及地点 于2014年2月至12在河北医科大学附属唐山工人医院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：8-12周龄SPF雄性SD大鼠20只，体质量200-250 g，5只1月龄SD大鼠，采购于南方医科大学实验动物中心，合格证书号为SCXK粤2014-0024，购回后于本实验中心在温度(25±2) ℃、湿度(50±5)%下适应性喂养1周。其中5只1月龄SD大鼠，使骨髓腔暴露，用生理盐水冲洗骨髓腔，收集冲洗液，进行分离纯化。实验的整个过程，以及最后对SD大鼠的处置均符合2006年中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准^[14]。

主要试剂及设备：DMEM(Gibco公司)；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(Hyclon公司)；磷酸盐缓冲液(上海麦莎生物科技有限公司)；DMSO、DAPI、牛黄胆酸钠(Sigma公司)；荧光抗体(美国BD公司)；反转录试剂盒、荧光扩增试剂盒、低温离心机(Thermo公司)；EPICS-XL型流式细胞仪(Beckman Coulter公司)；CO₂恒温培养箱(美国 Queue 公司)；IX71型倒置相差显微镜(Olympus日本公司)；RT-PCR仪7500(美国ABI公司)；大鼠ELISA试剂盒(上海酶联生物)；酶标仪(美国Molecular Devices)；戊巴比妥钠、多聚甲醛、甲醛溶液(天津市化学试剂六厂)。

1.4 实验方法

1.4.1 重症急性胰腺炎肺损伤模型 随机分为3组，每组10只，分别为正常对照组，模型对照组，移植组。实验前大鼠禁食12 h。用1%戊巴比妥钠(剂量35 mg/kg)腹腔注射进行将SD大鼠麻醉。大鼠麻醉成功后，用手术剪打开腹腔，找到胆胰管与十二指肠交结处，呈喇叭行的形态，在其无血管肠壁处，用24 G静脉留置套管针穿刺，回抽针芯至离套管口0.5-1.0 mm的距离，用棉签轻压穿刺点两侧，使套管平滑地向胆胰管开口方向慢慢进入，到达十二指肠乳头部入口逆行插入胆胰管0.5 cm处，使用小动脉夹隔断胆胰管上下端，用注射器向胆胰管内注射4%牛磺胆酸钠(剂量1 mL/kg)，5 min内匀速注射^[15]。

1.4.2 骨髓间充质干细胞的分离、培养 采用全骨髓冲洗法将5只1月龄SD大鼠断颈处死，无菌条件下分离出大鼠股骨、腔骨，剔除干净其覆着的肌肉、肌腱及结缔组织，用低糖DMEM培养液反复冲洗股骨、腔骨骨髓腔，经200目不绣钢滤网过滤后用离心机1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入适量含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM培养基混匀。运用差速贴壁联合，在24 h后首次换液方法。混勻后的细胞均匀铺满在90 mm培养皿，1.5 h后将上层细胞悬液转移至75 cm²培养瓶中培养，24 h后首次换液。待原代细胞长至底部90%时，按1∶3比例进行传代培养。

1.4.3 骨髓间充质干细胞的鉴定及DAPI标记和移植 取长势好的P3代骨髓间充质干细胞，用胰蛋白酶消化收集细胞，PBS洗涤3遍，并且用过滤网过滤制成单细胞悬液，细胞浓度1×10⁹ L^-¹，用体积分数75%冷乙醇5 mL固定10 min。取6管100 μL细胞悬浮液，分别加入各20 μL CD29、CD44、CD45 单克隆荧光抗体，混匀，室温避光孵育40 min。避光孵育后，离心冲洗未结合的抗体和同型2次^[16]，用流式细胞仪测定：检测同时CD29、CD44阳性及CD45阴性区域的细胞。骨髓间充质干细胞培养瓶中加入无血清培养基含4，6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)50 mg/L，避光孵育标记细胞24 h，用PBS冲洗去除未结合DAPI，用0.25%的胰蛋白酶消化，吹打，加入10 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，2次，再用1 500 r/min离心5 min，弃去上清液，加入培养液，调整细胞浓度至1.0×10⁹ L^-¹悬浮于DMEM培养基中备用。重症急性胰腺炎肺损伤模型建立24 h后，移植组经尾静脉注射移植骨髓间充质干细胞(1.0×10⁹ L^-¹)，模型组注射等量的生理盐水，而正常组大鼠不作任何处理。

1.4.4 大鼠胰腺组织和肺组织苏木精-伊红染色 移植24 h后，剪取胰腺、右肺下叶组织置于体积分数4%中性甲醛溶液中固定，用于苏木精-伊红染色。苏木精-伊红染色后，由病理科医师在光镜下阅片，每张切片随机选择5个高倍视野(×400)，根据Sehmidt评分标准，对胰腺和肺组织水肿、腺泡坏死、出血和脂肪坏死、炎细胞浸润进行评分。常规制备冰冻切片，用荧光显微镜检测DAPI标记的骨髓间充质干细胞在胰腺组织和肺组织的分布情况。

1.4.5 检测肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β mRNA表达量 RT-PCR检测细胞因子mRNA的表达：①采用一步法抽提50 mg大鼠胰腺组织和肺组织总RNA；②反转录cDNA：根据反转录试剂盒说明书，依次加入试剂及4 μg抽提得到的总RNA，反应体积40 μL，反应条件： 42 ℃延伸1 h，95 ℃，5 min；③PCR扩增：按试剂盒说明书，依次加入混合试剂、上下游引物及cDNA 5 μL，反应总体积25 μL，反应条件：94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1，5 min，共30个循环，72 ℃延伸5 min。

引物序列：

肿瘤坏死因子α 上游引物：5’- TAC TGA ACT TCG GGG TGA TTG GTC C- 3’；

下游引物：5’-CAG CCT TGT CCC TTG AAG AGA ACC- 3’，扩增后片段长度 295 bp。

白细胞介素1β上游引物：5’- GAA GCT GTG GCA GCT ACC TAT GTC T - 3’；

下游引物：5’-CTC TGC TTG AGA GGT GCT GAT GTA C- 3’，扩增后片段长度520 bp。

β-actin上游引物：5’-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GC- 3’；

下游引物：5’-CAC AGA GTA CTT GCG CT- CAG-3’，扩增后片段长度645 bp。

1.4.6 测定血清C-反应蛋白和肿瘤坏死因子α水平 移植24 h后，麻醉动物，开腹，下腔静脉取血，3 500 r/min离心10 min，取血清-80 ℃保存，用双抗体夹心ABC-ELISA法测定血清C-反应蛋白、肿瘤坏死因子α，按照试剂盒说明书操作。

1.5 主要观察指标 ①流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞结果；②大鼠移植组胰腺组织和肺组织DAPI染色结果；③各组大鼠胰腺组织和肺组织苏木精-伊红染色结果；④肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β mRNA表达量；⑤血清中血清C-反应蛋白和肿瘤坏死因子α水平。

1.6 统计学分析 实验数据采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计量资料以x(_)±s表示，采用单因素的方差分析，组与组间比较釆用t 检验，以P < 0.05，P < 0.01为差异有显著性意义。

讨论

重症急性胰腺炎作为临床上常见的急腹症，是一种快速病情发展、并发症多、治愈率低的急症重症疾病。早期容易诱发多脏器功能衰退，尤其是肺损伤，经数据统计死亡病例中有50%伴随着肺组织损伤^[17-18]。急性胰腺炎发生时，被激活的胰酶同时激活炎症因子，如单核巨噬细胞，中性粒细胞和淋巴细胞等进入血循环中，释放出毒性物质造成肺部的接连损伤^[18]。1980年Aho等^[20]首次用高浓度5%牛黄胆酸钠逆行胰胆管注射名为逆行注射法，该模型复制大鼠急性出血性胰腺炎模型，与临床急性出血坏死型胰腺炎相似，包括病因、致病机制及病变等方面的相似，且诱发并发症成功率高，重复性高。该方法目前应用最为广泛科学，实验采取其方法造模，苏木精-伊红染色结果发现胰腺组织和肺组织均有不同程度的损伤和伴随着炎症反应的产生，可见组织的结构受到破坏和坏死，表明此方法造模成功。

干细胞作为现今社会中比较新兴的再生医疗技术，可以对干细胞进行分离纯化，定向诱导其成为特定的细胞、组织和器官，这项技术具有传统治疗方法无法对比的优点^[21]。骨髓间充质干细胞是指不同于造血干细胞以外在骨髓间的另一类干细胞，具有强大的增殖和分化的潜能^[22]。治疗重症急性胰腺炎肺损伤最直接的干细胞应为胰腺干细胞，但因其数量较少，不易分离纯化，再生能力低，故无法满足修复胰腺损伤的需要。骨髓干细胞具有取材方便、具有多向分化功能，数量多易培养的特点，临床多用于分化成为神经细胞、肌肉、血管、肺脏、胰腺等组织细胞来治疗多种疾病^[23-24]。文献结果显示将大鼠自身间充质干细胞回输到急性胰腺炎和正常组骨髓腔中^[25]，发现标记信号的间充质干细胞可以随着血液到达正常的胰腺组织和损伤的胰腺组织中，而其在受损的胰腺组织的分布高于正常组，则显示自身骨髓间充质干细胞回输至身体内后可以修复损伤的胰腺组织，发挥重生组织的作用。研究者Cui等^[26]对L-精氨酸诱导的重症急性胰腺炎病症，通过注射移植骨髓间充质干细胞或移植粒细胞集落刺激因子，结果显示经过48 h和72 h，治疗组血清淀粉酶水平明显低于对照组。这一结果显示骨髓间充质干细胞能够起到治疗重症急性胰腺炎的作用。骨髓间充质干细胞在肺损伤疾病中有相关的治疗作用，研究发现骨髓间充质干细胞可定位于受损的肺组织^[27]，分化为肺泡上皮细胞修复肺组织，可以治疗博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化。

重症急性胰腺炎肺损伤模型相关肺损伤的机制是由于致病因子诱发胰腺腺泡细胞的损伤，从而导致有活性的胰酶释放到血液中，单核巨噬细胞和中性粒细胞被激活，释放出大量炎性递质，炎性因子之间相互作用，导致促炎与抗炎细胞因子系统失衡，引起全身炎症反应，并最终导致肺脏器官还有其他器官损害^[28-32]。白细胞介素1由巨噬细胞产生，在重症急性胰腺炎病症中其含量明显提高，并促使胰酶的合成与释放，造成胰腺组织进一步被破坏，加剧重症急性胰腺炎病理状态^[33]。文献报道，在急性胰腺炎肺损伤时，模型组组血清中白细胞介素1水平相对于对照组明显升高^[34]，提示白细胞介素1参与了急性胰腺炎肺损伤的病理过程并加剧损伤的病理程度。肿瘤坏死因子α能够直接损伤组织器官，介导其他细胞炎症介质的表达和释放，产生氧自由基和花生四烯酸代谢产物等，形成炎症级联反应，并且诱导白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素8等炎症因子的基因表达升高，使其生成量增多，而过量的肿瘤坏死因子α可以提高促凝血物质活性，增加肺血管内皮通透性，促使血液的流失，并可导致肺缺血和血栓形成等病症^[35]，同时引起中性粒细胞活化，诱导肺内皮细胞表达黏附因子，最终导致内皮细胞受损。陆海华等^[34]的临床研究发现，急性胰腺炎急性肺损伤组肿瘤坏死因子α表达水平明显高于正常组。同时研究证实，大鼠重症急性胰腺炎模型肺损伤时血清及肺组织中肿瘤坏死因子α表达明显增高^[36]。肿瘤坏死因子α可以促使内皮细胞表达ICAM-1、VCAM-1，促进肝细胞合成C-反应蛋白。

实验研究PCR结果显示与对照组比较，模型组胰腺组织和肺组织中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β mRNA的表达量显著高于正常组，差异有显著性意义 (P < 0.05，P < 0.01)；与模型组对比，移植组中胰腺组织和肺组织中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β显著低于模型组，差异有显著性意义(P < 0.05，P < 0.01)。与对照组对比，模型组血清中C-反应蛋白、肿瘤坏死因子α水平显著高于正常组，差异有显著性意义(P < 0.05)；与模型组对比，移植组血清C-反应蛋白和肿瘤坏死因子α水平显著低于模型组，差异有显著性意义 (P < 0.05)。

实验结果表明，DAPI标记的骨髓充间质干细胞移植后在胰腺组织中有所表达，证明骨髓充间质干细胞随着血液循环游走到受损的胰腺组织中，可能起到修复胰腺组织和重生组织。苏木精-伊红染色结果显示，移植骨髓间充质干细胞胰腺组织和肺组织的病理情况均有不同程度改善(P < 0.05)，说明骨髓间充质干细胞经大鼠尾静脉移植后通过血循环到达胰腺组织和肺组织受损区域，进一步重生成新组织修复受损组织。

实验提示移植的骨髓间充质干细胞向受损部位分布，并且抑制炎症反应中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和C-反应蛋白等细胞因子的释放，这提示其通过修复胰腺和肺组织并且减轻炎症反应来起到治疗重症急性胰腺炎肺损伤大鼠的作用。