舒芬太尼联合脐血间充质干细胞移植对梗死心肌的保护作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.41.013

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
Caspase-3：Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基和两个小亚基组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡，但在凋亡晚期细胞和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
舒芬太尼：是新型的强效阿片类镇痛药，其起效快、消除半衰期短、镇痛作用强、对血流动力学影响小。研究表明，舒芬太尼预处理能够保护心肌细胞，其原理可能是通过刺激阿片受体来阻止心肌细胞凋亡。

摘要
背景：药物预处理的延迟性保护作用成为近年来预处理领域的研究热点，舒芬太尼是一种非选择性阿片受体激动剂，有明显的心肌保护作用。
目的：探讨舒芬太尼预处理联合脐血间充质干细胞移植对心肌梗死后损伤心肌的保护作用。
方法：采用结扎左冠状动脉前降支的方式建立大鼠心肌缺血再灌注模型(缺血30 min，再灌注180 min)，建模后随机分为缺血再灌注组，脐血间充质干细胞组，舒芬太尼+脐血间充质干细胞组，每组30只。缺血再灌注组于缺血再灌注前5 min经腹腔静脉注射1 mL生理盐水，脐血间充质干细胞组经腹腔静脉注射脐血间充质干细胞悬液1 mL，舒芬太尼+脐血间充质干细胞组在此基础上于冠脉阻断前10 min经腹腔静脉注射舒芬太尼10 μg/kg，治疗后2周进行相关指标检测。
结果与结论：①心肌梗死面积：舒芬太尼+脐血间充质干细胞组<脐血间充质干细胞组<缺血再灌注组，差异有显著性意义(P < 0.05)；②与缺血再灌注组比较，脐血间充质干细胞组血清肌酸激酶、乳酸脱氢酶及肌钙蛋白Ⅰ水平降低，一氧化氮水平增加，与脐血间充质干细胞组比较，舒芬太尼+脐血间充质干细胞组血清肌酸激酶、乳酸脱氢酶及肌钙蛋白I水平明显降低，一氧化氮水平增加更明显，差异有显著性意义(P < 0.05)；③Caspase-3蛋白表达：舒芬太尼+脐血间充质干细胞组<脐血间充质干细胞组<缺血再灌注组，差异有显著性意义(P < 0.05)；④血流动力学指标：与缺血再灌注组比较，脐血间充质干细胞组、舒芬太尼+脐血间充质干细胞组左心室舒张压升高，左心室舒张末压降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；⑤与缺血再灌注组比较，脐血间充质干细胞组心肌组织病理学损伤程度减轻，舒芬太尼+脐血间充质干细胞组明显减轻；⑥结果表明，舒芬太尼预处理联合脐血间充质干细胞移植能够减轻大鼠心肌梗死程度，保护损伤的心肌。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-9989-7310(张玉红)

关键词: 干细胞, 移植, 脐血间充质干细胞, 舒芬太尼, 大鼠, 心肌梗死, 心肌损伤

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, delayed protection of drug pretreatment has become a hot spot in the field of pretreatment, and sufentanil is a non-selective opioid receptor agonist that plays a significant myocardial protective role.
OBJECTIVE: To investigate the protective effect of sufentanil combined with umbilical cord blood stem cell transplantation on injured myocardium after myocardial infarction.
METHODS: Myocardial infarction model by ligating the left anterior descending coronary artery (ischemia 30 minutes and reperfusion 180 minutes) was made in 90 healthy adult Wistar rats, and then these rat models were randomly divided into ischemia-reperfusion (IR) group, cell transplantation group, combined treatment group (n=30/group). Rats in the IR group were given intraperitoneally intravenous injection of
1 mL normal saline 5 minutes before IR; rats in the cell transplantation group were given intraperitoneally intravenous injection of 1 mL umbilical cord blood stem cell suspension 5 minutes prior to IR; and rats in the combined treatment group were given intraperitoneally intravenous injection of 10 μg/kg sufentanil 10 minutes before IR and 1 mL umbilical cord blood stem cell suspension 5 minutes prior to IR. Two weeks later, related indicators were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the IR group, myocardial infarct size was reduced significantly in the combined treatment group, followed by the cell transplantation group (P < 0.05). Lowest levels of serum creatine kinase, lactate dehydrogenase and troponin I were obtained in the combined treatment group followed by the cell transplantation group and IR group, while highest level of nitric oxide was observed in the combined treatment group followed by the cell transplantation group and IR group(P < 0.05). Highest expression of Caspase-3 protein was recorded in the combined treatment group, followed by the cell transplantation group and IR group (P < 0.05). Significantly increased left ventricular diastolic blood pressure and decreased left ventricular end diastolic pressure were found in the two cell transplantation groups compared with the IR group (P < 0.05). Moreover, pathological injury of the myocardial tissues was mitigated in the cell transplantation group and significantly relived in the combined treatment group compared with the IR group. In conclusion, the combined use of sufentanil and umbilical cord blood mesenchymal stem cell transplantation can reduce the degree of myocardial infarction and protect against myocardial injury.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Cord Blood Stem Cell Transplantation, Sufentanil, Myocardial Infarction, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

张红玉. 舒芬太尼联合脐血间充质干细胞移植对梗死心肌的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(41): 6164-6170.

Zhang Hong-yu. Sufentanil combined with umbilical cord blood stem cells protects against myocardial infarction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(41): 6164-6170.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 参加实验90只Wistar大鼠，均进入结果分析，中途无脱落。

2.2 各组心肌梗死面积比较 脐血间充质干细胞组心肌梗死面积较缺血再灌注组减小，差异有显著性意义 (P < 0.05)，舒芬太尼+脐血间充质干细胞组与脐血间充质干细胞组比较心肌梗死面积明显减小，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.3 血清肌酸激酶、乳酸脱氢酶、心肌肌钙蛋白I、一氧化氮水平 见表2。与缺血再灌注组比较，脐血间充质干细胞组血清肌酸激酶、乳酸脱氢酶及肌钙蛋白I水平明显降低，一氧化氮水平显著增加，差异有显著性意义(P < 0.05)，舒芬太尼+脐血间充质干细胞组与脐血间充质干细胞组比较，血清肌酸激酶、乳酸脱氢酶及肌钙蛋白I水平明显降低，而一氧化氮水平明显增加，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 Western blot检测Caspase-3蛋白的表达 与缺血再灌注组比较，脐血间充质干细胞组Caspase-3蛋白表达明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，与脐血间充质干细胞组比较，舒芬太尼+脐血间充质干细胞组Caspase-3蛋白表达明显降低，，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1。

2.5 血流动力学指标 与缺血再灌注组比较，脐血间充质干细胞组、舒芬太尼+脐血间充质干细胞组左心室舒张压明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；与缺血再灌注组比较，脐血间充质干细胞组、舒芬太尼+脐血间充质干细胞组左心室舒张末压明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表3。

2.6 各组大鼠心肌组织病理学形态 苏木精-伊红染色后病理切片可见脐血间充质干细胞组心肌细胞数量明显减少，细胞核大小不规则，细胞分界不清楚；舒芬太尼+脐血间充质干细胞组的心肌细胞数量明显多于缺血再灌注组和脐血间充质干细胞组，见图2。

参考文献

[1] 刘宁,王玖.急性心肌梗死患者预后影响因素分析[J].中国疗养医学,2014, 23(12):1072-1075.
[2] 黄金和.急性心肌梗死的药物治疗新进展[J].中国民族民间医药,2012,21(1):10-11.
[3] Csonka C, Kupai K, Kocsis GF, et al. Measurement of myocardial infarct size in preclinical studies. J Pharmacol Toxicol Methods. 2010;61(2):163-170.
[4] 荣彦生,刘义,于晗.舒芬太尼后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的实验研究[J].中西医结合心血脑血管病杂志, 2011, 9(10):1228-1230.
[5] 何志裕,陆东风.人脐带血间充质干细胞移植对急性心肌梗死大鼠心功能的影响[J].血栓与止血学, 2010, 16(6): 244-249.
[6] 马会利,葛均波,钱菊英,等.骨髓干细胞移植治疗心肌梗死的临床疗效[J].心脏杂志,2008;20(5):593-595.
[7] Schächinger V, Erbs S, Elsässer A, et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N Engl J Med. 2006;355(12): 1210-1221.
[8] Meyer GP, Wollert KC, Lotz J, et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 2006;113(10):1287-1294.
[9] 阮光萍,姚翔,刘菊芬,等.人脐带间充质干细胞的作用：细胞移植、免疫调节及充当基因治疗靶细胞[J].中国组织工程研究,2014,18(41):6714-6718.
[10] Leor J, Guetta E, Feinberg MS, et al. Human umbilical cord blood-derived CD133+ cells enhance function and repair of the infarcted myocardium. Stem Cells. 2006;24(3):772-780.
[11] Ma N, Ladilov Y, Moebius JM, et al. Intramyocardial delivery of human CD133+ cells in a SCID mouse cryoinjury model: Bone marrow vs. cord blood-derived cells. Cardiovasc Res. 2006;71(1): 158-169.
[12] Sadat S, Gehmert S, Song YH, et al. The cardioprotective effect of mesenchymal stem cells is mediated by IGF-I and VEGF. Biochem Biophys Res Commun. 2007;363(3):674-679.
[13] Siepe M, Akhyari P, Lichtenberg A, et al. Stem cells used for cardiovascular tissue engineering. Eur J Cardiothorac Surg. 2008;34(2):242-247.
[14] Schächinger V, Aicher A, Döbert N, et al. Pilot trial on determinants of progenitor cell recruitment to the infarcted human myocardium. Circulation. 2008; 118(14):1425-1432.
[15] Hu X, Wang J, Chen J, et al. Optimal temporal delivery of bone marrow mesenchymal stem cells in rats with myocardial infarction. Eur J Cardiothorac Surg. 2007; 31(3):438-443.
[16] van den Akker F, Deddens JC, Doevendans PA, et al. Cardiac stem cell therapy to modulate inflammation upon myocardial infarction. Biochim Biophys Acta. 2013;1830(2):2449-2458.
[17] Henning RJ. Stem cells in cardiac repair. Future Cardiol. 2011;7(1):99-117.
[18] Chen Z, Li T, Zhang B. Morphine postconditioning protects against reperfusion injury in the isolated rat hearts. J Surg Res. 2008;145(2):287-294.
[19] Yellon DM, Opie LH. Postconditioning for protection of the infarcting heart. Lancet. 2006;367(9509):456- 458.
[20] Kaneda K, Miyamae M, Sugioka S, et al. Sevoflurane enhances ethanol-induced cardiac preconditioning through modulation of protein kinase C, mitochondrial KATP channels, and nitric oxide synthase, in guinea pig hearts. Anesth Analg. 2008;106(1):9-16.
[21] Gross ER, Hsu AK, Gross GJ. Diabetes abolishes morphine-induced cardioprotection via multiple pathways upstream of glycogen synthase kinase-3beta. Diabetes. 2007;56(1):127-136.
[22] Wong GT, Li R, Jiang LL, et al. Remifentanil post-conditioning attenuates cardiac ischemia-reperfusion injury via kappa or delta opioid receptor activation. Acta Anaesthesiol Scand. 2010; 54(4):510-518.
[23] 刘鲲鹏,廖旭,薛富善,等.舒芬太尼的药理学和临床应用[J].药物临床与应用,2005,7(6):454-457.
[24] 谢丽萍,代志刚,王胜,等. 舒芬太尼预处理在大鼠肝缺血再灌注损伤中的作用及其与ｐ３８ＭＡＰＫ关系的研究[J].重庆医学,2014,43(23):3037-3039.
[25] 刘鲲鹏,孙海涛,薛富善,等.不同剂量舒芬太尼预处理对大鼠的延迟性心肌保护作用[J].中华麻醉学杂志,2009, 29(5):405-408.
[26] 李进,袁世荧,丰新民,等.舒芬太尼延迟预处理对兔心肌缺血再灌注损伤的影响[J].中麻醉学杂志,2009,29(8): 692-695．
[27] 孙海涛,薛富善,刘鲲鹏,等.COX-2和mito-KATP通道在舒芬太尼预处理对心肌缺血再灌注大鼠延迟性心肌保护中的作用[J].中华麻醉学杂志,2010,30(4):456-460.
[28] 李雅娇.人脐血间充质干细胞治疗急性心肌梗死的研究[J].中国民族民间医药,2013,22(11):106-107.
[29] 吴云,顾尔伟,方卫平,等. 舒芬太尼后处理对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响[J].安徽医科大学学报, 2011, 46(7): 652-655.
[30] 刘祥,景桂霞,白娟,等.舒芬太尼预处理对大鼠心肌缺血再灌注时PI3K/Akt的影响[J].南方医科大学学报, 2014, 34(3): 335-340.
[31] 王嘉,赵国庆,高明.舒芬太尼预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响[J].中国实验诊断学,2012,16(7): 1162-1164.
[32] 朱健,王建刚,田首元,等.舒芬太尼后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其与PI3K-Akt-eNOS的关系[J].中西医结合心脑血管病杂志,2014,12(11):1365-1367.
[33] 李军,秦建伟,梁永年,等.依达拉奉在联合瓣膜置换术中对心肌的保护作用[J].南京医科大学学报:自然科学版, 2006, 26(9): 849-851.
[34] 张启霞,秦玲.碟脉灵注射液对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌肌钙蛋白I、T的影响[J].中国老年学杂志,2010, 30(1):58-59.
[35] Collinson PO, Gaze DC. Biomarkers of cardiovascular damage. Med Princ Pract. 2007;16(4):247-261.
[36] 冬梅,侯春丽,常业恬,等.舒芬太尼预处理对缺血再灌注大鼠心肌梗死范围及心肌酶的影响[J].实用医学杂志, 2009, 25(15):2430-2433．
[37] 陈中青,张冬梅,贾绍斌. 舒芬太尼对大鼠心肌缺血再灌注室性心律失常的影响[J].中国心脏起搏与心电生理杂志,2009,23(3):247-249.
[38] 杨玲,梁红霞.舒芬太尼延迟性预处理对心肌缺血再灌注损伤及Caspase-3的影响[J].中华胸心血管外科杂志, 2010,26(4):269-272.
[39] Ruixing Y, Al-Ghazali R, Wenwu L, et al. Pretreatment with probucol attenuates cardiomyocyte apoptosis in a rabbit model of ischemia/reperfusion. Scand J Clin Lab Invest. 2006;66(7):549-558.
[40] Vohra HA, Galiñanes M. Effect of the degree of ischaemic injury and reoxygenation time on the type of myocardial cell death in man: role of caspases. BMC Physiol. 2005;5:14.

引言

近年来，心肌梗死患病率和致死率逐年攀升，现已成为危害人类健康的主要原因^[1-2]，其发病后，最为有用的治疗措施是尽快恢复心肌缺血区的血流供给，然而近年来越来越多的证据显示，缺血心肌再灌注后一段时间内心肌损伤加重，可出现再灌注心律失常、心肌顿抑和细胞坏死等，即心肌缺血再灌注损伤^[3-4]。采取有用措施最大程度防止或减轻心肌缺血再灌注损伤已成为临床医师十分关注的问题。

骨髓干细胞移植治疗缺血性心脏疾病已进入临床测验阶段^[5-8]，同时有研究揭示，人脐血间充质干细胞能够定向分化为心肌细胞^[9]，移植入心肌缺血模型动物体内能够明显改善心功能，显著缩小心肌梗死面积^[7-11]，但是心肌梗死后炎症内环境可能导致移植干细胞的生存率和分化率降低^[12-14]。

心肌缺血预处理和后处理对于受损心肌的保护作用均已得到公认^[15]，但实际工作的不确定性因素限制了其在临床的应用，从而提出了药物预处理的概念，即在心肌再灌注前通过使用小剂量药物模仿或激活机体内源性保护机制^[16-17]。国内外药理实验表明，吗啡、瑞芬太尼等阿片类药物预处理能够减轻缺血再灌注损伤^[18-19]。舒芬太尼是新型的强效阿片类镇痛药，其起效快、消除半衰期短、镇痛作用强、对血流动力学影响小^[20]。研究表明，舒芬太尼预处理能够保护心肌细胞，其原理也许是通过刺激阿片受体来阻止心肌细胞凋亡^[21-24]。

实验建心肌缺血再灌注损伤模型，初步探索舒芬太尼预处理联合脐血间充质干细胞移植对大鼠心肌梗死后损伤心肌的保护作用。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年5月至2015年11月在河北医科大学动物实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 脐血标本 健康产妇婴儿的脐血，由河北医科大学附属医院产科提供，产妇和家属同意用于科学研究。

1.3.2 实验动物 健康成年雄性Wistar大鼠90只，体质量180-230 g，由河北医科大学动物实验室提供。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求，保持饲养环境清洁、恒温，平均每笼四五只。将大鼠随机分为3组：缺血再灌注组，脐血间充质干细胞组，舒芬太尼+脐血间充质干细胞组，每组30只。

1.3.3 主要试剂和仪器 舒芬太尼(批号091207，中检所)；大鼠CK，LDH，cTnI ELISA 检测试剂盒(上海酶联生物科技公司)；戊巴比妥钠、2，3，5- triphenyltetrazolium、二甲基亚砜(Sigma Chemical Co.)；Caspase-3兔多抗免疫组化试剂盒(北京九州天瑞科技有限公司)；酶标仪(美国Molecular Devices公司)；Finesse 325石蜡切片机(河北炸鸭炉制造厂)；石蜡包埋机(英国Shandon公司)；数码相机(英国Shandon公司)；Image Pro Plus 5.0图像分析软件(Media Cybernetics公司，美国)；HX300动物呼吸机(北京众实迪创科技)；TDZ5-WS低速离心机(湖南凯达)；恒温水浴锅(江苏金怡)；BL-420E生物机能实验系统(安徽正华)；强生6-0 Prolene线；JT3101N电子天平(美国奥豪斯)；GSP-9160MBE隔水式培养箱(上海泰益)。

1.4 实验方法

1.4.1 脐血间充质干细胞的培养^[25]

脐血收集和单个核细胞的分离：在无菌环境下收集健康产妇婴儿的脐血，每份70-120 mL，20 U/mL肝素抗凝，将脐血样本和D-Hank’s液以1︰1体积混合均匀，然后缓慢加于淋巴细胞分离液上层，以2 500 r/min离心15 min，移液管吸取白膜层界面的人脐血单个核细胞，加入PBS反复吹打，加入3倍体积的PBS，1 000 r/min离心10 min，洗涤3次，所分离的单个核细胞用于细胞培养。

脐血间充质干细胞的培养和传代：根据文献[25]，将分离得到的脐血单个核细胞以(1.0-2.0)×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种于含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，放在温度37 ℃、体积分数为5%的CO₂培养箱中培养，3-5 d后第1次半量换液，可见瓶底有贴壁细胞生长，换新鲜的低糖DMEM培养基继续培养。根据培养液颜色的变化每2-4 d换液1次。细胞长到铺满瓶底80%时吸出培养液，结束原代培养，PBS洗涤2次后加入0.25%胰蛋白酶消化液，37 ℃下消化3-5 min，发现细胞间隙变大后将胰蛋白酶吸出，加入体积分数为10%的胎牛血清终止消化，用枪头吹打瓶底未消化脱落的细胞，将所得细胞悬液按1︰2进行培养传代，3 d后半量换液，以后每3 d或4 d换液1次，待细胞铺满瓶底80%左右时，按1︰2比例进行传代培养。

1.4.2 建立心肌缺血再灌注大鼠模型^[26] 大鼠腹腔注射5 g/L戊巴比妥钠麻醉，仰卧在手术板上，将四肢以及皮下用电极针连接于生物机能实验系统，持续记录Ⅱ导联心电图。颈部去毛消毒后插管连接到动物呼吸机协助呼吸(呼吸频率70次/min，潮气量6.0-7.0 mL/次)，待心率和血压稳定后，在左侧胸壁第3，4肋间距离胸骨左缘约0.5 cm开胸，逐层钝性分离暴露心脏，以左冠状静脉主干为标志，在左心耳下方1.0-2.0 mm处以6-0的无损伤缝合线作线结，收紧结扎线即形成左冠状动脉闭塞心肌缺血模型，成功标志：心电图ST段明显抬高和结扎线以下心肌组织颜色由正常变苍白再变暗为心肌缺血。心肌缺血30 min再灌注180 min，再灌注成功的标志：开通冠脉后出现ST段下降或再灌注心律失常，心肌肉眼观测颜色恢复正常，平均动脉压较结扎后升高。术中热板法维持体温37.1 ℃，开放尾静脉用于补液给药。

缺血再灌注组大鼠在缺血再灌注前5 min给予腹腔静脉注射1 mL生理盐水，脐血间充质干细胞组大鼠给予腹腔静脉注射脐血间充质干细胞悬液1 mL(细胞数为2.5×10⁹)，舒芬太尼+脐血间充质干细胞组大鼠在冠脉结断前10 min给予腹腔静脉注射舒芬太尼10 μg/kg，缺血再灌注前5 min给予腹腔静脉注射脐血间充质干细胞悬液1 mL(细胞数为2.5×10⁹)。

1.4.3 计算心肌梗死面积 心肌缺血再灌注末，每组取5只大鼠再次结扎左冠状动脉，从左室导管注入5% Even Blue 1 mL，以区分心肌的梗死区(不染色)和非梗死区，2 min后注入空气使大鼠心跳停止，剪取心脏，用生理盐水灌洗，并除去心房组织，吸去水分称心脏湿质量，置-20 ℃冰箱5 min，将速冻后的心脏从心尖到心基部平行于房室沟方向切成四五片，每片厚2 mm，放入2 mL 1% TTC溶液中(pH 7.4)，37 ℃温孵20 min，染色，置于体积分数为10%甲醛中固定，缺血危险区为红色，梗死区为白色。每张心肌切片数码照相，采用ImagePro Plus 5.0图像分析软件(Media Cybernetics公司美国)测量左心室(LV)、右心室(RV)、缺血危险区和梗死区面积，心肌梗死的严重程度以梗死区/缺血危险区表示。

1.4.4 肌酸激酶、乳酸脱氢酶、心肌肌钙蛋白I、一氧化氮水平 治疗后2周，每组取5只大鼠血样进行离心分离(5 000 r/min，10 min)血清，严格按照酶联免疫检测试剂盒说明书操作。

1.4.5 Western blot检测Caspase-3蛋白的表达 治疗后2周，每组取5只大鼠，拖尾处死大鼠，迅速取出心脏并用冰生理盐水冲洗，取心内膜处发生紫绀病变的心肌组织，提取总蛋白，通过BCA法测定蛋白质浓度，吸取50 μg总蛋白，行10%SDS-PAGE电泳，通过电转移(40 V 150 min的转印条件)印迹到PVDF膜上，加入封闭液于37 ℃下孵育2 h。一抗孵育：加入1∶1 000稀释的Caspase-3多克隆一抗，4 ℃过夜，TBST洗膜5次，每次5 min，二抗孵育：加入1∶5 000 HRP标记的二抗和GAPDH，于37 ℃孵育2 h，PBS洗涤。暗室曝光X射线片，通过GDSS000凝胶自动成像系统摄像，漂洗并干燥后避光保存。Image-Pro Plus 8.0软件分析条带灰度值，以Caspase-3/GAPDH代表Caspase-3的相对表达量。

1.4.6 检测血流动力学指标^[27] 治疗后2周，每组取5只大鼠，采用生物机能实验系统连续监控并测定左心室变化压最高值(LVDP)以及左心室舒张末压(LVEDP)。

1.4.7 病理学观察 治疗后2周，每组取5只大鼠，拖尾处死大鼠，迅速取出心脏并用冰生理盐水冲洗，取出左心室心尖部组织，固定在体积分数为10%甲醛溶液中24 h，常规白蜡包裹，切片，进行苏木精-伊红染色观察组织形态变化。

1.5 主要观察指标 ①心肌梗死面积；②血清肌酸激酶、乳酸脱氢酶、心肌肌钙蛋白I、一氧化氮水平；③心肌组织Caspase-3蛋白的表达；④血流动力学指标；⑤心肌组织病理学形态。

1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料以x(_)±s表示，组内比较采用重复测量数据的方差分析，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

心肌缺血再灌注损伤是心肌组织在较长时间缺血后恢复血液灌流，反而出现比再灌注前更明显、更严重的损伤和功能障碍，包括收缩功能降低，冠脉流量下降及血管反应性改变。大鼠解剖学构造、冠状支配区和心血管系统与人体相近而常被用作缺血再灌注损伤模型的研究对象。实验通过结扎冠状动脉的方法制造心肌缺血再灌注模型^[28-29]。

磷酸肌酸激酶、乳酸脱氢酶的分布有明显的器官浓度特殊性，是诊断心肌疾病的一类重要酶类。心肌肌钙蛋白I发挥调节心肌伸缩的作用，它因独特的氨基酸序列而具有高度的心肌特异性，被称作鉴别心肌损伤水平的“金指标”^[30-32]。一氧化氮是反映内皮细胞能力的敏感指标。实验结果显示：与缺血再灌注组相比，脐血间充质干细胞移植组血清肌酸激酶、乳酸脱氢酶及心肌肌钙蛋白I水平降低，一氧化氮水平增加。舒芬太尼+脐血间充质干细胞组与脐血间充质干细胞组比较，血清肌酸激酶、乳酸脱氢酶及肌钙蛋白I水平明显降低，而一氧化氮水平明显增加，差异有显著性意义(P < 0.05)，提示脐血间充质干细胞移植和舒芬太尼都可减弱心肌缺血再灌注引发的心肌损害，减少心肌酶的释放。

心肌梗死面积亦是国际认可的反映心肌损伤水平的金标准，心肌梗死面积的测算也可用来评估心肌保护手段的效果^[33]。实验结果表明，脐血间充质干细胞组大鼠心肌梗死面积较缺血再灌注组变小，舒芬太尼+脐血间充质干细胞组与脐血间充质干细胞组比较心肌梗死面积明显变小。苏木精-伊红染色结果显示，脐血间充质干细胞组、舒芬太尼+脐血间充质干细胞组心肌组织病理学损伤水平有所减轻，舒芬太尼+脐血间充质干细胞组较脐血间充质干细胞组明显好转，说明脐血间充质干细胞移植治疗和舒芬太尼都可通过减小心肌梗死面积而减轻缺血再灌注形成的心肌损害，联合使用二者保护作用更加明显。

左心室功能改变是心肌缺血再灌注损伤的特征性表现^[34]。与缺血再灌注组比较，脐血间充质干细胞组、舒芬太尼+脐血间充质干细胞组左心室舒张压明显升高，左心室舒张末压明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，提示其对左室收缩及舒张功能均有保护作用。

缺血再灌注损伤的发病原理比较复杂，其首要机制之一即为细胞凋亡学说^[35-38]。最新研究结果表明发生凋亡的细胞数与Caspase-3呈现的高度活性状态有关^[39-40]，提示Caspase-3的活跃直接影响心肌细胞凋亡从而引发损伤。实验中Caspase-3蛋白水平：舒芬太尼+脐血间充质干细胞组<脐血间充质干细胞组<缺血再灌注组，提示舒芬太尼和脐血间充质干细胞组可通过抑制Caspase-3的活性来减少细胞发生凋亡的概率从而对受损心肌起到保护作用，联合应用作用效果更佳。