纳米羟基磷灰石牙体修复材料的生物性能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.34.005

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
纳米级羟基磷灰石材料：与人体内组织成分更为相似，具有更佳的生物性能。纳米羟基磷灰石晶体结构与天然骨的无机成分相似，与人体细胞膜表层多糖和蛋白质以氢键结合，无细胞毒性，具有高度的生物相容性和优良的成骨活性。目前纳米羟基磷灰石被广泛应用于临床多个专业，尤其是在体液作用下，纳米羟基磷灰石会出现降解，释放出处于游离状态的钙和磷，并被人体组织吸收和利用，进而形成新的组织，发挥出骨传导作用。
理想的骨替代材料：需满足以下条件：有良好的生物相容性；有骨传导和骨诱导特征；不会传播感染性疾病；抗原性应最小；使用方便；费用低；易消毒性等。但现在应用于临床及实验中的各种材料，却没有一种能够完全符合上述标准。

背景：纳米羟基磷灰石的成分与天然骨十分接近，且具有纳米材料的特点，被广泛应用各种骨缺损修复治疗中。
目的：通过细胞毒性实验检测纳米羟基磷灰石牙体修复材料的细胞毒性，并观察其修复动物牙槽骨缺损的效果。
方法：①体外实验：采用10%、50%、100%浓度的纳米羟基磷灰石材料浸提液(或羟基磷灰石材料浸提液)分别培养牙周膜成纤维样细胞与L-929细胞各7 d，分析材料的细胞毒性；②体内实验：取成年家兔45只，制备牙槽骨缺损模型后随机分组，实验组于骨缺损处置入纳米羟基磷灰石，对照组置入羟基磷灰石，空白对照组不置入任何材料。术后1，2，3周观察各组新骨形成情况。
结果与结论：①体外实验结果：不同浓度的纳米羟基磷灰石材料浸提液与细胞发生直接接触之后，细胞毒性在0至1级之间，未发生细胞毒性；②体内实验结果：随着时间的延长，3组新生骨所占视野总面积比例均不断上升，实验组不同时间点的新生骨多于对照组、空白对照组(P < 0.05)；③结果表明：纳米羟基磷灰石材料无细胞毒性，并且可促进牙槽骨缺损修复。
ORCID: 0000-0003-2890-7096(黄涛)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 纳米材料, 纳米羟基磷灰石, 细胞毒性, 牙槽骨缺损, 骨缺损修复

Abstract:

BACKGROUND: Nanohydroxyapatite composition is similar to that of the natural bone, and because of its characteristics of nanomaterials, it has been widely used in the bone defect repair.
OBJECTIVE: To observe the effect of nanohydroxyapatite composite materials in the repair of alveolar bone defect in animal models by detecting its cytotoxicity.
METHODS: (1) In vitro experiment: nanohydroxyapatite extracts with concentrations of 10%, 50%, 100% (or hydroxyapatite leaching extracts) were used to culture periodontal ligament fibroblast-like cells and L-929 cells for 7 days, respectively, followed by cell cytotoxicity analysis. (2) In vivo experiment: 45 adult rabbits were used to make animal models of alveolar bone defects and then were randomized into three groups: experimental group implanted with nanohydroxyapatite, control group with hydroxyapatite, and blank control group with no implant material. New bone formation was observed at 1, 2 and 3 weeks after operation.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In vitro experiment: after directly cultured with 10%, 50%, 100% nanohydroxyapatite extracts, the cell cytotoxicity was graded 0 to 1, indicating no presence of cytotoxicity. (2) In vivo experiment: in the three groups, the percentage of new bone area accounting for the total visual field was gradually in a rise over time. Moreover, the amount of new bone tissues was higher in the experimental group than the other two groups at different time (P < 0.05). These findings demonstrate that the nanohydroxyapatite materials have no cytotoxicity that can be used to promote the repair of alveolar bone defects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Nanostructures, Hydroxyapatites, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

黄涛，陈汉. 纳米羟基磷灰石牙体修复材料的生物性能[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(34): 5045-5050.

Huang Tao, Chen Han. Biological properties of nanohydroxyapatite composite for dental restoration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(34): 5045-5050.

图/表（结果） 4

2.1 体外细胞毒性检测结果经检测和统计，与羟基磷灰石组比较，纳米羟基磷灰石组呈现出较高的细胞增殖率，不同浓度纳米羟基磷灰石材料浸提液的的细胞毒性在0至1级之间，未发生细胞毒性，各组吸光度值具体结果见表1，2。

2.2 体内实验结果

2.2.1 实验动物数量分析与实验流程 45只兔均全部进行进入最终的结果分析。

2.2.2 各组大体情况术后各组动物均正常饮食、饮水、活动，术后7 d左右，伤口一期愈合，未出现伤口感染或者死亡现象。术后3周观察，纳米羟基磷灰石组和羟基磷灰石组骨缺损区均良好愈合。

2.2.3 各组组织学检测结果

术后1周：空白对照组出现炎性细胞浸润，可见成骨细胞稀少量骨痂；羟基磷灰石组存在一定的成纤维细胞和毛细血管，可见成骨细胞骨痂，有少量炎性细胞浸润；纳米羟基磷灰石组可观察到较多的成纤维细胞和毛细血管及明显的成骨细胞骨痂，有少量炎性细胞浸润。

术后2周：空白对照组存在少量炎性细胞浸润，可见成骨细胞骨痂；羟基磷灰石组存在较多的成纤维细胞和毛细血管，可见明显的成骨细胞骨痂，有少量炎性细胞浸润，纳米羟基磷灰石组可观察到大量成纤维细胞和毛细血管及较多的成骨细胞骨痂。

术后3周：空白对照组出现少量的新生骨组织，可观察到稀松骨小梁，见图1A；羟基磷灰石组出现大量新生骨组织，骨小梁致密，粗大，部分融合成片，见图1B；纳米羟基磷灰石组可观察到大量新生骨及更加明显的成骨现象，局部可观察到板层骨，与成熟骨组织十分接近，见图1C。

2.2.4 术后不同时间点新生骨所占视野总面积随着时间的延长，3组新生骨所占视野总面积比例均呈现出不断上升情况，经统计学比较，纳米羟基磷灰石组术后1，2，3周的新生骨所占视野总面积比例均显著高于空白对照组和羟基磷灰石组(P < 0.05)，羟基磷灰石组不同时间点新生骨所占视野总面积比例均显著高于空白对照组(P < 0.05)，具体结果见表3。

参考文献

[1] 石铁,王泓杰,高秀秋,等.纳米羟基磷灰石及其复合材料对牙周膜细胞的影响[J].中国组织工程研究与临床康复, 2009,13(3):553-556.
[2] 王健平,周立波,岳红霞,等.氟纳米羟基磷灰石封闭人离体牙牙本质小管的生物相容性[J].中国组织工程研究, 2012, 16(16):2951-2954.
[3] 张艺君,尹路,张翼,等.掺钾纳米羟基磷灰石脱敏材料对ZPCC与牙本质粘结强度的影响[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2015,25(10):596-601.
[4] 胡图强,何俐,李祖兵,等.纳米羟基磷灰石/PRP修复牙槽突裂的实验研究[J].口腔医学研究, 2008,24(3):262-265.
[5] 邱伟,时咏梅,徐进云,等.纳米羟基磷灰石直接盖髓诱导牙本质桥早期形成的可行性[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(21):3869-3872.
[6] 叶眉,陈芳,姜大川,等.富血小板血浆和纳米羟基磷灰石胶原支架对人脂肪干细胞成骨分化的影响[J].口腔医学研究,2009,25(4):420-423.
[7] 鲁红,吴织芬,田宇,等.一种新型纳米羟基磷灰石材料应用于牙周组织工程的可行性研究[J].牙体牙髓牙周病学杂志, 2005,15(1):6-9.
[8] 赵熙儒,赵刚,莫宏兵,等,壳聚糖修饰后的纳米羟基磷灰石作为BMP-2输送载体转染细胞的研究[J].黑龙江医药科学, 2012,35(1):3-4．
[9] Hernandez ML,Alonso LM,Pradas MM,et al. Composites of Poly(methyl methacrylate) with Hybrid Fillers (Micro/Nanohydroxyapatite): Mechanical, Setting Properties, Bioactivity and Cytotoxicity In Vitro. Polym Compos.2013;34(11):1927-1937.
[10] 胡图强,何俐,喻学洲,等.纳米羟基磷灰石/混旋聚乳酸修复牙槽突裂的实验研究[J].郧阳医学院学报, 2008,27(4): 307-310,封2.
[11] 胡图强,何俐,李祖兵,等.纳米羟基磷灰石修复牙槽突裂的实验研究[J].临床口腔医学杂志,2007,23(5):288-290.
[12] 杨清岭,李宝花,尹蒙熔,等.纳米羟基磷灰石和纳米羟基磷灰石/聚酰胺66直接盖髓术的组织学对比观察[J].黑龙江医药科学,2010,33(3):27-28.
[13] 刘冰,陈鹏,臧晓霞,等.活性纳米羟基磷灰石复合胶原/聚乳酸材料对拔牙创早期愈合及牙槽嵴吸收影响的实验研究[J].口腔医学,2010,30(1):38-41.
[14] Liu L,Wang Y,Guo S,et al.Porous polycaprolactone/ nanohydroxyapatite tissue engineering scaffolds fabricated by combining NaCl and PEG as co-porogens: structure, property, and chondrocyte- scaffold interaction in vitro.J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2012;100(4):956-966.
[15] 刘泉,黄文.拔牙后牙槽窝即刻植入纳米羟基磷灰石的临床观察[J].口腔医学研究,2007,23(5):560-562.
[16] 韩纪梅,李玉宝,梁新杰,等.纳米羟基磷灰石与牙无机质的比较研究[J].功能材料,2005,36(7):1069-1071.
[17] 孙卫斌.纳米羟基磷灰石诱导人牙周膜细胞骨化分化的研究[D].四川大学,2005.
[18] Sharifi S,Kamali M,Mohtaram NK,et al.Preparation, mechanical properties, and in vitro biocompatibility of novel nanocomposites based on polyhexamethylene carbonate fumarate and nanohydroxyapatite.Polym Adv Technol.2011;22(5):605-611.
[19] Qiao Z,Perestrelo R,Shi X,et al.An exploratory study to evaluate the potential of nanohydroxyapatite as a powerful sorbent for efficient extraction of volatile organic metabolites, potential biomarkers of cancer. Anal Methods.2014;6(15):6051-6057.
[20] 孙庆顺,孟祥才,梁楠,等.纳米羟基磷灰石修复牙槽骨缺损的动物实验研究[J].黑龙江医药科学,2003,26(3):6-7.
[21] 韦纪英,何霞,贺于奇,等.PRP复合纳米羟基磷灰石对兔牙槽骨缺损的修复作用[J].广东医学, 2009,30(12):1786-1788.
[22] 王云,王青山.牙体修复性纳米羟基磷灰石复合材料的机械性能研究[J].现代口腔医学杂志,2011,25(2):115-117.
[23] 方厂云,曹莹,夏宇,等.大鼠牙乳头细胞与纳米羟基磷灰石的体外复合培养[J].中南大学学报(医学版), 2007,32 (1):114-118.
[24] Li M,Liu W,Sun J,et al.Culturing primary human osteoblasts on electrospun poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(lactic-co-glycolic acid)/nanohydroxyapatite scaffolds for bone tissue engineering.ACS Appl Mater Interfaces. 2013;5(13):5921-5926.
[25] Lin BN,Whu SW,Chen CH,et al.Bone marrow mesenchymal stem cells, platelet-rich plasma and nanohydroxyapatite-type I collagen beads were integral parts of biomimetic bone substitutes for bone regeneration.J Tissue Eng Regen Med. 2013;7(11): 841-854.
[26] 邢晓艳,张青松.纳米羟基磷灰石在口腔医学中的应用[J].继续医学教育,2013,27(10):54-55.
[27] 郑谦,周立伟,魏世成等.纳米羟基磷灰石/聚酰胺(n-HA/ PA66)凝胶重建牙槽嵴的动物实验研究[J].中华老年口腔医学杂志,2003,1(3):137-139.
[28] Remya KR,Joseph J,Mani S,et al.Nanohydroxyapatite incorporated electrospun polycaprolactone/ polycaprolactone-polyethyleneglycol-polycaprolactone blend scaffold for bone tissue engineering applications.J Biomed Nanotechnol. 2013;9(9):1483-1494.
[29] 鲁红,吴织芬,田宇,等.应用生长因子-支架构建方式的组织工程方法再生牙周组织的实验研究[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2005,15(1):10-13.
[30] Grenho L,Manso MC,Monteiro FJ,et al.Adhesion of Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, and Pseudomonas aeruginosa onto nanohydroxyapatite as a bone regeneration material.J Biomed Mater Res A.2012; 100A(7):1823-1830.
[31] 孔祥盼.纳米羟基磷灰石修复即刻种植牙骨缺损的实验研究[D].佳木斯大学,2007.
[32] 鲁红,吴织芬,田宇,等.异体脱矿松质骨基质和纳米羟基磷灰石材料应用于牙周组织工程中的可行性探讨[J].中国临床康复,2002,6(17):2538-2539.
[33] Wu DJ,Liu SL,Hao AH,et al.Enhanced repair of segmental bone defects of rats with hVEGF-165 gene-modified endothelial progenitor cells seeded in nanohydroxyapatite/collagen/poly(L-lactic acid) scaffolds.J Bioact Compat Pol.2012;27(3):227-243.
[34] Qian X,Yuan F,Zhimin Z,et al.Dynamic perfusion bioreactor system for 3D culture of rat bone marrow mesenchymal stem cells on nanohydroxyapatite/ polyamide 66 scaffold in vitro.J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2013;101(6):893-901.
[35] 孙卫斌,吴亚菲,丁一,等.纳米羟基磷灰石诱导人牙周膜细胞碱性磷酸酶表达的研究[J].中华口腔医学杂志, 2006, 41(6):348-349.
[36] Jaiswal AK,Chandra V,Bhonde RR,et al.Mineralization of nanohydroxyapatite on electrospun poly(L-lactic acid)/gelatin by an alternate soaking process: A biomimetic scaffold for bone regeneration.J Bioact Compat Pol.2012;27(4):356-374.
[37] 赵刚,尹蒙熔,李德超,等.纳米羟基磷灰石修复牙槽骨缺损后正畸牙齿移动的可行性研究[J].黑龙江医药科学, 2010, 33(3):10-11.
[38] 闫永发,王春兰,范月静,等.纳米羟基磷灰石复合胶原植入术治疗牙周病骨缺损的疗效观察[J].中华临床医师杂志(电子版),2011,5(1):239-240.

引言

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，体内动物观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015年8至12月在哈励逊国际和平医院口腔科完成。

1.3 材料牙周膜成纤维样细胞与L-929细胞均由上海盈公生物技术有限公司提供，羟基磷灰石由石家庄科兴新技术产品有限公司提供，纳米羟基磷灰石由北京市意华健科贸有限责任公司提供。

实验动物：3月龄雄性家兔45只，体质量3.5 kg左右，由安徽省盛鹏实验动物科技有限公司提供，许可证号：SCXK(皖)2016-001，一般状况良好，饲养于哈励逊国际和平医院动物中心SPF环境。此次研究相关方案均提交本院医学伦理部门审核，并经批准，符合相关伦理学要求。

1.4 实验方法

1.4.1 体外细胞学实验

材料浸提液的制备：取羟基磷灰石与纳米羟基磷灰石，制备材料浸提液。取材料10 mg，置于无菌小玻璃瓶内，于120 ℃、444.82 kPa高温高压消毒20 min，再用紫外灯照射30 min后，无菌环境下加入10 mL细胞维持液(含体积分数5%小牛血清，20×10⁴ U青霉素和20×10⁴ U链霉素)，然后置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中120 h，即成材料浸提液，用细胞维持液分别稀释成浓度为10%、50%、100%的材料浸提液备用。

细胞毒性检测^[9]：对牙周膜成纤维样细胞进行常规原代和传代培养，收集第5代细胞用于细胞毒性实验。将第5代牙周膜成纤维样细胞与L-929细胞悬液分别接种在培养板中，观察细胞生长情况，待细胞贴壁之后，去掉原培养液，分别添加不同浓度羟基磷灰石与纳米羟基磷灰石材料浸提液，并将新鲜细胞维持液(含体积分数5%小牛血清，20×10⁴U青霉素和20×10⁴ U链霉素)培养设为阴性对照组，培养1-7 d，添加MTT、二甲基亚砜，测定吸光度值(490 nm)。细胞增殖率=实验组A值/阴性对照组A值×100%，按照细胞增殖率判断细胞毒性，大于100%时，细胞毒性为0级；99%≤细胞增殖率≤75%时，细胞毒性为1级；74%≤细胞增殖率≤50%时，细胞毒性为2级；49%≤细胞增殖率≤25%时，细胞毒性为3级；24%≤细胞增殖率≤1%时，细胞毒性为4级；细胞增殖率≤0%时，细胞毒性为5级。0级和1级被认为没有细胞毒性，2级为轻度细胞毒性，3级和4级为中度细胞毒性，5级为明显的细胞毒性。

1.4.2 体内修复实验

实验分组及干预：将45只家兔随机分为3组，每组15只，分别设为纳米羟基磷灰石组、羟基磷灰石组和空白对照组，均制备牙槽骨缺损模型^[10]。动物肌注麻醉，无菌条件下暴露下颌骨，用牙科钻在各组实验动物下颌右侧第一磨牙近中造成长5 mm×宽3 mm×深8 mm的牙槽骨缺损。模型制备完毕后，空白对照组不置入任何材料，纳米羟基磷灰石组和羟基磷灰石组分别置入纳米羟基磷灰石和羟基磷灰石进行牙槽骨缺损修复。术后缝合切口，常规抗感染治疗和喂养。

新生骨定量分析与组织学检测：术后1，2，3周，分别麻醉处死3组各5只动物，获得完整下颌骨标本。制备组织学切片，置于显微镜下，于100倍视野下观察新骨形成情况，近牙槽嵴定出现薄层骨密质，表面覆盖较厚的纤维结缔组织则视为新骨形成，计算新骨形成面积在总视野面积中所占的比例^[11]。并进行组织学检测，获取标本，制备切片，常规苏木精-伊红染色后观察。

1.5 主要观察指标材料的细胞毒性检测结果；各组新骨形成情况。

1.6 统计学分析对研究过程中获得的数据进行收集，使用的统计学软件为SPSS公司的SPSS 18.0。组间各项资料均利用单因素方差分析方式进行比较，如果P < 0.05则表明差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

牙槽骨缺损影响语音功能，并影响到牙胚，致使受累牙数目、形态及位置发生变化，导致口颌畸形。目前牙槽骨缺损的手术修复主要采用自体髂骨松质骨移植。近年来，许多学者热衷于替代材料的研究，用于骨缺损修复，包括各种生物材料及添加生长因子。移植材料的研究始终是骨缺损修复领域的重要课题。理想的骨替代材料需满足以下条件：有良好的生物相容性；有骨传导和骨诱导特征；不会传播感染性疾病；抗原性应最小；使用方便；费用低；易消毒性等。但现在应用于临床及实验中的各种材料，却没有一种能够完全符合上述标准。骨组织缺损修复最理想的材料是天然骨，但因来源有限及存在感染问题，使其应用受限。目前采用的人造骨材料机械性能不同于天然骨，生物性能不佳，修复效果不理想。不锈钢、钛合金等能损伤与之接触的正常骨组织，其粗糙表面及释放的有毒离子可导致过敏和炎症反应；生物陶瓷尽管能直接与骨组织接触，但脆性大；高分子生物降解材料，如聚乳酸、聚乙二酸等，虽能在人体内被逐渐降解，但力学性能不佳。

纳米级羟基磷灰石材料与人体内组织成分更为相似，具有更佳的生物性能。纳米羟基磷灰石晶体结构与天然骨的无机成分相似，与人体细胞膜表层多糖和蛋白质以氢键结合，无细胞毒性，具有高度的生物相容性和优良的成骨活性。目前纳米羟基磷灰石被广泛应用于临床多个专业，尤其是在体液作用下，纳米羟基磷灰石会出现降解，释放出处于游离状态的钙和磷，并被人体组织吸收和利用，进而形成新的组织，发挥出骨传导作用^[12-15]。韩纪梅等^[16]通过水热合成法制备了纳米磷灰石晶体，并与牙无机质进行比较分析发现，在组成、结构和形貌晶体与牙无机质十分相似，二者均含有钠离子和碳酸根及羟基等。羟基磷灰石有着良好的空间网状结构和良好的组织、细胞相容性^[17-22]。方厂云等^[23]在体外环境下对大鼠牙乳头细胞与纳米羟基磷灰石进行复合培养，经过观察发现纳米羟基磷灰石具有良好的生物相容性，可有效促进牙乳头细胞增殖，明显增强细胞活性。

在临床牙科修复治疗过程中，羟基磷灰石及纳米羟基磷灰石均为常用的材料^[24-28]。在对牙科修复材料进行细胞毒性检测的过程中，可选择不同的细胞类型^[29-33]。在此次实验中，考虑到所检测的纳米羟基磷灰石需要应用于牙槽骨缺损的修复之中，材料的接触环境中存在大量的成纤维细胞^[34-36]。为此，在此次实验中，选择利用L-929细胞、牙周膜成纤维样细胞进行细胞毒性实验。实验结果显示，不同浓度纳米羟基磷灰石材料浸提液与细胞发生直接接触之后，细胞毒性在0至1级之间，未发生细胞毒性。上述结果表明，羟基磷灰石和纳米羟基磷灰石均具有良好的细胞相容性，且纳米羟基磷灰石具有更好的细胞增殖效果。赵刚等^[37]制备兔牙槽骨缺损后的牙齿移动模型，实施纳米羟基磷灰石修复，并通过与正常牙槽骨进行比较发现，经纳米羟基磷灰石修复治疗可行正畸牙齿移动，获得理想的修复效果。此次实验中，术后3周观察，纳米羟基磷灰石组和羟基磷灰石组骨缺损区均良好愈合。术后1，2，3周，对各组新生骨所占视野总面积情况进行统计，纳米羟基磷灰石组新生骨所占视野总面积比例均显著高于空白对照组和羟基磷灰石组(P < 0.05)，即表明纳米羟基磷灰材料发挥出较好的骨缺损修复效果。分析出现这一结果的原因，是因为纳米羟基磷灰石复合材料具有良好的骨引导性，促进牙槽骨缺损的修复^[38]。以往研究也报道，纳米羟基磷灰材料具有骨诱导和骨传导双重作用，是一种良好的生物移植材料，与此研究结果一致。

综上所述，通过此次实验初步证实，纳米羟基磷灰石牙体修复材料无细胞毒性，是一种安全的修复材料，且具有很高的黏附性及生物相容性，更适合细胞的黏附、生长及功能发挥，在体内可通过对成骨和骨降解的促进而发挥二者之间的协同作用，为新骨再生提供良好的微环境，有效促进骨缺损修复，加速骨组织改建，利用其进行兔牙槽骨缺损修复，可获得理想的修复效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程