2.1  丝素蛋白/壳聚糖复合支架的红外光谱检测结果  图1为丝素蛋白/壳聚糖复合支架的红外光谱，羧化壳聚糖的红外谱图中的吸收峰在1 652 cm^-1(C=O伸缩) 和1 522 cm^-1 (N-H变形)，而1 051 cm^-1的吸收峰与C-O伸缩有关，丝素蛋白的红外特征峰出现在1 652，1 531，1 236 cm^-1处，而丝素蛋白/壳聚糖复合支架材料出现了1 652，1 531，1 236，   1 079 cm^-1 4个峰，证明所制备的支架含有丝素蛋白和羧化壳聚糖。

2.2  丝素蛋白/壳聚糖复合支架的扫描电镜结果  图2为丝素蛋白/壳聚糖复合支架的扫描电镜图，从扫描电镜图可以观察出所制得的丝素蛋白/壳聚糖复合支架具体良好的三维孔洞结构，孔径为50-100 μm。

2.3  丝素蛋白/壳聚糖复合支架的热重分析结果  图3为丝素蛋白/壳聚糖复合支架的热重分析结果，由图可以得知，当温度小于200 ℃时，3种支架材料的质量损失下降速度较低，差异不明显，主要原因是这阶段的质量损失多为水分子的丧失，大分子未发生降解；当温度上升至200-500 ℃范围时，3种支架质量损失速度开始加快，损失量增多，这是因为大分子降解作用开始也参与；在800 ℃时，丝素蛋白支架的残余质量为3.7%，壳聚糖支架的残余质量为12.7%，而丝素蛋白/壳聚糖复合支架(8∶2)的残余质量最高，为38%。

2.4  丝素蛋白/壳聚糖复合支架的力学性能检测结果  图4为丝素蛋白/壳聚糖复合支架力学性能检测结果，从图中可以看出丝素蛋白/壳聚糖复合支架的最大应变可以达到94.94%，最大承受应力为7.01 MPa。

2.5  丝素蛋白/壳聚糖复合支架的细胞毒性检测结果  图5为丝素蛋白/壳聚糖复合支架的细胞毒性检测结果，可以看出丝素蛋白/壳聚糖复合支架对兔骨髓间充质干细胞没有细胞毒性，而且吸光度随时间延长有明显增加，证明所制得的丝素蛋白/壳聚糖复合支架有良好的细胞相容性。

2.6  季铵化壳聚糖的核磁氢谱结果  图6为季铵化壳聚糖的核磁氢谱结果，图中δ=1.94 ppm处单峰是残留的乙酰基的甲基信号；δ=2.91 ppm处的单峰质子信号为叔胺基- N(CH₃)₂上甲基信号，说明氨基上只有2个甲基取代；δ=3.26 ppm处的单峰质子信号为季铵基-N+(CH₃)₃上甲基信号，说明为目标产物的甲基信号；δ=3.66-4.10 ppm处的多重质子信号为葡萄糖胺结构单元上次甲基和亚甲基的质子信号；δ=5.00 ppm处被氘代水的残留质子信号掩埋，为糖苷端基质子信号；叔胺化和季铵化的比例约为4∶1，所以季铵化程度约为20%。

2.7  季铵化壳聚糖的Zeta电位和粒径分布结果  季铵化壳聚糖的粒径分布为(588.56±52.39) nm，季铵化壳聚糖颗粒的表面带正电荷，电位为(16.3±3.92) mV，有利于与DNA结合。

2.8  季铵化壳聚糖材料保护DNA情况验证凝胶电泳实验结果  图7为用季铵化壳聚糖材料保护DNA后进行凝胶电泳实验的结果，从实验结果中可见季铵化壳聚糖材料的比例越高对DNA的包裹越好，图中1-7代表Naked pDNA∶季铵化壳聚糖的比值，当二者比例为1∶3时，季铵化壳聚糖材料刚好对DNA达到包裹作用，也就是说的量是Naked pDNA的3倍或者以上时就可以完全将DNA包裹。

2.9  季铵化壳聚糖/DNA的透射电镜检测  图8为季铵化壳聚糖/DNA的透射电镜检测图，从图中可以看到大部分的微粒呈实心圆形，微粒粒径差别较小，平均粒径约为200 nm，纳米粒子的分布比较均匀，无团聚现象。

丝素蛋白是从蚕丝中提取出来的一种纯天然高分子材料^[1]，亦是蚕丝中的主要构成成分。蚕丝因其质地柔软、穿着透气舒适等优良特性而备受人们青睐，也是国内外产量最多的天然纤维之一，在中国具有悠久的历史，其来源丰富且相对其他材料成本低。随着科技的快速发展，大量研究表明丝素蛋白具有良好的力学性能、生物相容性及生物降解性^[2-5]，而且价廉、无毒害及较其他材料获取简单^[6-8]，被广泛应用于人工骨、支架材料、韧带等多重生物医学领域。虽然丝素蛋白具有诸多优点，但是研究表明将其单独使用有一定缺陷，如降解慢、干燥后易碎、成骨诱导性不强及支架性能仍不够理想等^[9-12]，故常和其他材料联合应用于支架材料的制作。壳聚糖是通过甲壳素脱乙酰后获得的产物^[13]，是自然界中唯一阳离子天然碱性多糖，亦被称为脱乙酰甲壳素^[14]，同样具有良好的生物相容性、可降解性及抗菌性，同时还有骨传导及促进骨生长等优点^[15-17]，被广泛用于复合支架材料的制作，主要包括支架在体外培养的作用、体内修复骨缺损等。壳聚糖与黏多糖(胺基葡聚糖)结构类似，可以通过不同处理得到不同性能的支架^[18-19]。壳聚糖的降解产物为氨基葡萄糖，具有一定碱性，对人体无毒害^[20]，但单独使用时机械强度、生物活性及生物响应性低^[16，21]。虽然丝素蛋白与壳聚糖来源广，获取成本低，但单独使用时具有诸多缺点。将两者通过混合使用可以互为改性，充分发挥优点，获取理想的复合支架材料^[22-23]。实验以丝素蛋白和壳聚糖为原材料共混制备复合支架材料，并对其性能进行了一系列测试，旨在为临床提供一种制备简便、成本低廉而且性能优异的人工复合材料。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  细胞学体外实验。

1.2  时间及地点  实验于2017年12月至2018年12月在广西中医药大学动物实验室完成。

1.3  材料  蚕茧由浙江大学提供；兔骨髓间充质干细胞由武汉普诺赛生命科技有限公司提供；ZIP1质粒由赛业(广州)生物科技有限公司合成；羧化壳聚糖由南通绿神生物科技有限公司合成，见表1。

实验用主要试剂：氯化钠、淀粉试纸、0.25%胰酶消化液、CCK-8检测试剂盒、琼脂糖、6×loading buffer、TAE电泳液、碳酸钠、溴化锂、冰乙酸、碘化钾、1-甲基-2-吡咯烷酮、氢氧化钠、碘甲烷(碧云天)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)；溴乙锭(广州化学试剂厂)；PBS(Hyclone)。

实验用主要仪器：恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)；真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；磁力搅拌器(德国艾卡)；台式高速离心机(湖南湘仪集团)；冷冻干燥机(宁波新芝生物)；傅里叶红外光谱仪(德国布鲁克)；热重分析仪(德国耐驰仪器公司)；博士ElectroForce^®3220高精度生物材料试验机(美国Bose公司)；场发射扫描电子显微镜(FS-SEM，日立高新技术公司)；酶标仪(Thermo Fisher Scientific)；Zeta电位仪(马尔文公司)；水平电泳槽、电泳仪、电泳装置(Tanon)。

1.4  实验方法

1.4.1  丝素蛋白的制备  将剪碎的蚕茧加入到0.02 mol/L的Na₂CO₃水溶液中，加热煮沸1 h，用去离子水不断进行冲洗直到样本pH值接近中性，再去除多余的丝胶，随后将标本放入到60 ℃的烘箱进行烘干。将干燥后的丝素蛋白与浓度为9.3 mol/L的LiBr溶液按1∶10的比例结合，将溶液温度调至60 ℃加热5 h。然后将所得到的溶液用透析袋(截留分子质量为10 kD)透析3 d，并且每天换一次水。将透析后的丝素蛋白溶液在室温下进行离心(5 000 r/min离心    10 min)，提取丝素蛋白溶液(浓度约为3.5%)，保存至4 ℃环境中备用。

1.4.2  丝素蛋白/壳聚糖复合支架的制备  将壳聚糖溶于浓度为1%的冰乙酸，制备成质量浓度为35 g/L的壳聚糖溶液并与丝素蛋白溶液融合，将丝素蛋白与羧化壳聚糖按照8∶2体积比混合，再将混合溶液注入48孔板中，每孔注入1 mL。最后通过冷冻干燥得到丝素蛋白/壳聚糖复合支架。

1.4.3  基因载体季铵化壳聚糖的合成  将5 g壳聚糖、13 g碘化钾、27.5 mL NaOH(15%)、28.75 mL碘甲烷依次倒入180 mL的1-甲基-2-吡咯烷酮，保持在60 ℃的水浴下搅拌融合并静置2 h。然后将反应液倒入足量的乙醇中沉淀并用乙醇清洗2遍，将所得产物用NaCl水溶液溶解，用透析袋(截留相对分子质量3 500)分别以1 mol/L的NaCl溶液与三蒸水透析4 d与3 d(每天更换2次透析液)，最后淀粉是指检测无碘残留后，将产物冻干标记为季铵化壳聚糖。

1.4.4  支架及材料表征和检测

丝素蛋白/壳聚糖复合支架的红外光谱检测：采用KBr片法，以傅里叶红外光谱仪表征丝素蛋白/壳聚糖复合支架、丝素蛋白、壳聚糖的红外吸收特征，扫描范围为500- 4 000 cm^-1。

丝素蛋白/壳聚糖复合支架扫描电镜检测：将干燥好的丝素蛋白/壳聚糖复合支架固定在铜台上并喷金处理，运用场发射扫描电子显微镜观察。

丝素蛋白/壳聚糖复合支架热重分析：将羧化壳聚糖、丝素蛋白、丝素蛋白/壳聚糖复合支架进行热重分析。将  10 mg待检验的样品放于氮气环境下进行检测，测试度升高控制范围为30-800 ℃，温度上升速度为10 ℃/min。

丝素蛋白/壳聚糖复合支架的压缩性能检测：在正常条件下，用博士ElectroForce^®3220生物材料检测机对丝素蛋白/壳聚糖复合支架进行压缩应力和压缩模量测试。测试样品：丝素蛋白/壳聚糖复合支架支架。样品大小：直径为    6 mm，高度为5-7 mm。测试条件为：以225 N的附加压力与1 mm/min的线速度将支架压缩至原先高度的一半。

丝素蛋白/壳聚糖复合支架的细胞毒性检测：画好培养板加样分布图，取培养良好的兔骨髓间充质干细胞，消化离心，配好细胞悬液，计数、传代，按500 µL体积特定细胞数来配制细胞悬液(全培)。取24孔板，一个浓度设置两三个平行组，另留2个空白对照，每孔铺5万-10万个细胞，每孔500 µL，培养12 h；移出全培，吸走5孔加5孔，不用PBS洗，加入已配好的OPTI-MEM培养基+体积分数10%胎牛血清，每孔400 µL，处理一二小时，移出液体，PBS洗2次；饥饿1 h时进行材料和DNA复合，编号，每子弹头取2 µg DNA(ZIP1质粒，每孔需2 µg)，轻微吹打，复合    30 min后再向复合物中加入OPTI-MEM凑齐100 µL；向复合体中加入OPTI-MEM培养基+体积分化10%胎牛血清(总体积达到500 µL)，移出培养板液体，移入该液体，每孔  500 µL，培养1，4，7，10 d时移出培养板液体，PBS洗2次，移入已配好的DMEM+体积分数10%胎牛血清500 µL，培养24-48 h观察，采用CCK-8试剂盒对细胞毒性进行检查。

季铵化壳聚糖的核磁氢谱：将所制得的季铵化壳聚糖溶解于D2O中，用核磁共振仪表征季铵化壳聚糖的核磁氢谱。

季铵化壳聚糖的Zeta电位和粒径分布：用Zeta电位仪对所制得的季铵化壳聚糖的电位和粒径分布进行检测。

季铵化壳聚糖材料保护DNA情况验证凝胶电泳实验：将1 g琼脂糖溶于100 mL 1×TAE溶液配制1%凝胶电泳胶，在微波炉中加热使其充分溶解，待温度降至60 ℃左右加入5 µL溴乙啶(10 g/L)，摇晃均匀倒入已插好梳子的制胶架中，室温下水平放置30 min左右使其凝固；按照所需比例吸取不同体积的材料溶液与10 µL质粒DNA(2 mg/L)，室温孵育30 min；将已凝固的凝胶放入加满1×TAE溶液的电泳槽内(没过胶面2 mm为宜)，加样，每孔加入10 µL复合材料，样本需预先加入2 µL loading buffer；插上电泳仪电源，设置电流强度300 mA，电压强度140 V，时间设置35 min；待loading buffer跑至接近凝胶底部时关闭电泳仪，取出凝胶，在凝胶电泳成像仪中成像。

季铵化壳聚糖/DNA的透射电镜检测：将适量鱼精DNA溶于PBS中，配成质量浓度为0.5 g/L的DNA溶液，置于37 ℃恒温水容易备用；在5 mL离心管中，加入以上鱼精DNA溶液(0.5 g/L)0.2 mL，然后加入0.8 mL含0.5 g/L季铵化壳聚糖的PBS溶液(0.8 g/L，经0.22 μm滤膜过滤，37 ℃预热)，混合后保持在37 ℃恒温水箱中震荡搅拌10 min后取出。最后将溶液放置于有聚合物薄膜的铜网上以37 ℃烘干，在透射电镜下进行观察粒子的形貌和大小。

1.5  主要观察指标  丝素蛋白/壳聚糖复合支架的热重分析、力学性能及细胞毒性；季铵化壳聚糖的电位和粒径分布、保护DNA及与DNA结合的情况。

实验用主要试剂：氯化钠、淀粉试纸、0.25%胰酶消化液、CCK-8检测试剂盒、琼脂糖、6×loading buffer、TAE

电泳液、碳酸钠、溴化锂、冰乙酸、碘化钾、1-甲基-2-吡咯烷酮、氢氧化钠、碘甲烷(碧云天)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)；溴乙锭(广州化学试剂厂)；PBS(Hyclone)。

实验用主要仪器：恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)；真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；磁力搅拌器(德国艾卡)；台式高速离心机(湖南湘仪集团)；冷冻干燥机(宁波新芝生物)；傅里叶红外光谱仪(德国布鲁克)；热重分析仪(德国耐驰仪器公司)；博士ElectroForce^®3220高精度生物材料试验机(美国Bose公司)；场发射扫描电子显微镜(FS-SEM，日立高新技术公司)；酶标仪(Thermo Fisher Scientific)；Zeta电位仪(马尔文公司)；水平电泳槽、电泳仪、电泳装置(Tanon)。

1.4  实验方法

1.4.1  丝素蛋白的制备  将剪碎的蚕茧加入到0.02 mol/L的Na₂CO₃水溶液中，加热煮沸1 h，用去离子水不断进行冲洗直到样本pH值接近中性，再去除多余的丝胶，随后将标本放入到60 ℃的烘箱进行烘干。将干燥后的丝素蛋白与浓度为9.3 mol/L的LiBr溶液按1∶10的比例结合，将溶液温度调至60 ℃加热5 h。然后将所得到的溶液用透析袋(截留分子质量为10 kD)透析3 d，并且每天换一次水。将透析后的丝素蛋白溶液在室温下进行离心(5 000 r/min离心    10 min)，提取丝素蛋白溶液(浓度约为3.5%)，保存至4 ℃环境中备用。

1.4.2  丝素蛋白/壳聚糖复合支架的制备  将壳聚糖溶于浓度为1%的冰乙酸，制备成质量浓度为35 g/L的壳聚糖溶液并与丝素蛋白溶液融合，将丝素蛋白与羧化壳聚糖按照8∶2体积比混合，再将混合溶液注入48孔板中，每孔注入1 mL。最后通过冷冻干燥得到丝素蛋白/壳聚糖复合支架。

1.4.3  基因载体季铵化壳聚糖的合成  将5 g壳聚糖、13 g碘化钾、27.5 mL NaOH(15%)、28.75 mL碘甲烷依次倒入180 mL的1-甲基-2-吡咯烷酮，保持在60 ℃的水浴下搅拌融合并静置2 h。然后将反应液倒入足量的乙醇中沉淀并用乙醇清洗2遍，将所得产物用NaCl水溶液溶解，用透析袋(截留相对分子质量3 500)分别以1 mol/L的NaCl溶液与三蒸水透析4 d与3 d(每天更换2次透析液)，最后淀粉是指检测无碘残留后，将产物冻干标记为季铵化壳聚糖。

1.4.4  支架及材料表征和检测

丝素蛋白/壳聚糖复合支架的红外光谱检测：采用KBr片法，以傅里叶红外光谱仪表征丝素蛋白/壳聚糖复合支架、丝素蛋白、壳聚糖的红外吸收特征，扫描范围为500- 4 000 cm^-1。

丝素蛋白/壳聚糖复合支架扫描电镜检测：将干燥好的丝素蛋白/壳聚糖复合支架固定在铜台上并喷金处理，运用场发射扫描电子显微镜观察。

丝素蛋白/壳聚糖复合支架热重分析：将羧化壳聚糖、丝素蛋白、丝素蛋白/壳聚糖复合支架进行热重分析。将  10 mg待检验的样品放于氮气环境下进行检测，测试度升高控制范围为30-800 ℃，温度上升速度为10 ℃/min。

丝素蛋白/壳聚糖复合支架的压缩性能检测：在正常条件下，用博士ElectroForce^®3220生物材料检测机对丝素蛋白/壳聚糖复合支架进行压缩应力和压缩模量测试。测试样品：丝素蛋白/壳聚糖复合支架支架。样品大小：直径为    6 mm，高度为5-7 mm。测试条件为：以225 N的附加压力与1 mm/min的线速度将支架压缩至原先高度的一半。

丝素蛋白/壳聚糖复合支架的细胞毒性检测：画好培养板加样分布图，取培养良好的兔骨髓间充质干细胞，消化离心，配好细胞悬液，计数、传代，按500 µL体积特定细胞数来配制细胞悬液(全培)。取24孔板，一个浓度设置两三个平行组，另留2个空白对照，每孔铺5万-10万个细胞，每孔500 µL，培养12 h；移出全培，吸走5孔加5孔，不用PBS洗，加入已配好的OPTI-MEM培养基+体积分数10%胎牛血清，每孔400 µL，处理一二小时，移出液体，PBS洗2次；饥饿1 h时进行材料和DNA复合，编号，每子弹头取2 µg DNA(ZIP1质粒，每孔需2 µg)，轻微吹打，复合    30 min后再向复合物中加入OPTI-MEM凑齐100 µL；向复合体中加入OPTI-MEM培养基+体积分化10%胎牛血清(总体积达到500 µL)，移出培养板液体，移入该液体，每孔  500 µL，培养1，4，7，10 d时移出培养板液体，PBS洗2次，移入已配好的DMEM+体积分数10%胎牛血清500 µL，培养24-48 h观察，采用CCK-8试剂盒对细胞毒性进行检查。

季铵化壳聚糖的核磁氢谱：将所制得的季铵化壳聚糖溶解于D2O中，用核磁共振仪表征季铵化壳聚糖的核磁氢谱。

季铵化壳聚糖的Zeta电位和粒径分布：用Zeta电位仪对所制得的季铵化壳聚糖的电位和粒径分布进行检测。

季铵化壳聚糖材料保护DNA情况验证凝胶电泳实验：将1 g琼脂糖溶于100 mL 1×TAE溶液配制1%凝胶电泳胶，在微波炉中加热使其充分溶解，待温度降至60 ℃左右加入5 µL溴乙啶(10 g/L)，摇晃均匀倒入已插好梳子的制胶架中，室温下水平放置30 min左右使其凝固；按照所需比例吸取不同体积的材料溶液与10 µL质粒DNA(2 mg/L)，室温孵育30 min；将已凝固的凝胶放入加满1×TAE溶液的电泳槽内(没过胶面2 mm为宜)，加样，每孔加入10 µL复合材料，样本需预先加入2 µL loading buffer；插上电泳仪电源，设置电流强度300 mA，电压强度140 V，时间设置35 min；待loading buffer跑至接近凝胶底部时关闭电泳仪，取出凝胶，在凝胶电泳成像仪中成像。

季铵化壳聚糖/DNA的透射电镜检测：将适量鱼精DNA溶于PBS中，配成质量浓度为0.5 g/L的DNA溶液，置于37 ℃恒温水容易备用；在5 mL离心管中，加入以上鱼精DNA溶液(0.5 g/L)0.2 mL，然后加入0.8 mL含0.5 g/L季铵化壳聚糖的PBS溶液(0.8 g/L，经0.22 μm滤膜过滤，37 ℃预热)，混合后保持在37 ℃恒温水箱中震荡搅拌10 min后取出。最后将溶液放置于有聚合物薄膜的铜网上以37 ℃烘干，在透射电镜下进行观察粒子的形貌和大小。

1.5  主要观察指标  丝素蛋白/壳聚糖复合支架的热重分析、力学性能及细胞毒性；季铵化壳聚糖的电位和粒径分布、保护DNA及与DNA结合的情况。

当前治疗多种部位软骨组织或骨组织缺损常采取自体或异体骨移植、骨替代材料及正在初步开发的组织工程技术等作为主要的治疗方式，其中组织工程技术是当前的研究热门，它在一定程度上可以降低传统术式感染、排异反应、生物相容性差等发生率。当前复合支架作为组织工程技术的首选，是一种细胞外的培养载体，它需要在一些方面如力学性能、孔径、细胞毒性、生物降解速率等符合一定材料标准，并且在材料与细胞相结合时保证细胞的生长及代谢功能。支架材料的选择是决定支架性能的关键，而材料主要分为人工材料与天然材料。其中人工材料种类较多，如聚乳酸、羟基磷灰石、β-磷酸三钙等，相较于天然材料它虽然具有更好的机械力学性能与形态结构的调控性，但在生物相容性、细胞亲和力、材料降解速率上存在缺陷，易造成宿主体内组织或细胞的排异反应。因此天然材料以具有较高的细胞亲和力、易被机体吸收、细胞毒副作用小的优势备受广大学者的追捧。

目前丝素蛋白、壳聚糖、胶原蛋白为主要采用的天然材料。作为一种生物相容性良好的纤维蛋白，丝素蛋白在支架材料的选择中被广泛应用。丝素蛋白主要由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等18种氨基酸组成，主要由重链约390 kD、轻链约26 kD及糖蛋白链约28 kD 3部分组成。ALTMAN  等^[24]研究证实，丝素蛋白具有较好的力学性能、较高的可塑性、低生物毒性、适宜的生物降解速率、提取工艺简单、应用广泛等优点，但是作为单独支架使用时溶失率高、生物性能差，究其原因可能与材料内部空间较小、细胞无法长入有关。

壳聚糖作为一种多糖类也具备较高的生物相容性与良好的生物降解速率。但有研究者认为壳聚糖作为细胞外基质分泌的诱导剂能使软骨细胞易于黏附在壳聚糖表面，但壳聚糖本身机械应力较低，无法满足骨组织所应承接的力量，从而不起支架作用，需与其他材料进行复合使用^[25]。因此丝素蛋白/壳聚糖复合支架成为近几年支架材料的研究热点，这两种天然材料的结合在保证较好生物相容性及较低细胞毒副作用的同时，既可以改善天然材料支架的力学性能较差的缺点又有利于细胞在支架内部的生长与新陈代谢，但目前缺乏对该支架制备与性能检测的研究。实验通过制备丝素蛋白/壳聚糖复合支架并对其做多种性能检测，考察该支架多种性能情况，旨在为骨或软骨组织工程支架材料研究提供参考。物理和化学交联法、相分离法、快速成型技术、低温干燥法等是制备复合支架的主要方法。实验将经冷冻的材料放置于真空环境中，通过冰晶升华除去样品中的水分，规避了应力开裂，可通过调控冰晶成型达到对孔隙结构的控制，采取冷冻干燥法制备出具有多种微观孔隙结构、形态各异、力学性能较好的材料。

将丝素蛋白溶液与壳聚糖按体积比8∶2混合制备复合支架，结果显示复合支架具体良好的三维孔洞结构，孔径为50-100 μm。有学者认为孔径大小会影响细胞在支架上的活性，孔径过小会为造成细胞生长空间狭窄，无法保证支架内部细胞的营养输送和新陈代谢；而孔径过大则会影响支架的力学强度，减少细胞在支架上的依附。影响孔径大小的因素有很多，如丝素蛋白与壳聚糖的比例问题、制备时温度的变化等^[26]。有研究认为骨组织工程支架材料的孔径应保持在100-500 μm为宜^[27]，而平均孔径为67 µm左右是软骨组织工程对支架的要求，这保障支架的内部有足够的空间让细胞迁移^[28]。由此可见，当以丝素蛋白∶羧化壳聚糖=8∶2的比例制备支架的孔径大小较符合软骨组织工程要求。影响细胞生长的不仅只有孔径大小，其中还包括孔径率，该实验尚未对孔径率进行测算，这需要后期进一步做实验研究。

生物材料的降解率决定着支架在体内停留时间，通过对复合支架、丝素蛋白、壳聚糖3者的热重分析发现，当温度从0 ℃升至200 ℃时3者质量损失相差较少，但是仍以复合支架损失为最低；当温度上升至800 ℃时，3者具有明显的差异，丝素蛋白残余质量为3.7%，壳聚糖残余量为12.7%，而复合支架的残余质量最高，为38%。3者作为天然材料最终可被细胞组织吸收，但复合支架生物降解率较丝素蛋白、壳聚糖低，可为细胞生长提供更多的生长时间，降低更换的频率，从而减少治疗成本，并且较高的降解率可能无法为支架提供一定的力学性能。有研究制备了壳聚糖与海藻酸钙双相陶瓷骨支架材料，因含有陶瓷材料而具有较高的力学性能，但是其也具有较高的抗溶能力，这存在二次手术取出支架的可能，并且其有2至3级的细胞毒性，这可能增加患者的经济负担。支架力学性能与应力-应变曲线是指湿态下的支架在循环载荷下保持力学稳定的状态，这决定支架所能承受的外力和外力下支架的弯曲程度。此次实验应力-应变曲线显示复合支架均具有良好的黏弹性，测试结果最大应变可以达到94.94%，最大承受应力为7.01 MPa，证明该支架在传递力学的同时发挥了支撑作用，比叶鹏等^[29]研究制备的骨组织工程支架材料力学性能高，他认为支架的平均抗压能力为5.78 MPa能够满足骨组织临时固定的需要，但目前缺乏生物实验验证，这需要做进一步的研究。丝素蛋白与壳聚糖分别单独作为支架时已被多项研究证实细胞毒性较低^[30]，用两种材料制备的复合支架通过实验证实不存在细胞毒性，与细胞相容性较好，与人工材料相比降低了感染、组织炎症、细胞排异反应的发生率。

为了进一步研究该复合支架细胞通透性及与细胞的结合效果，运用壳聚糖制备出季铵化壳聚糖。季铵化壳聚糖是一种阳离子型壳聚糖衍生物，其在生理条件下溶解性好，可静电缩合pDNA形成季铵化壳聚糖/pDNA纳米复合物，从而使细胞间紧密连接，促进细胞旁路渗透^[31]。分别对季铵化壳聚糖进行了核磁氢谱、Zeta电位和粒径分布、保护DNA情况验证凝胶电泳实验、季铵化壳聚糖/DNA的透射电镜检测，发现季铵化壳聚糖颗粒的表面带正电荷，有利于与DNA的结合生成季铵化壳聚糖/pDNA纳米复合物，并且在凝胶电泳实验中发现季铵化壳聚糖材料的比例越高对DNA的包裹越好，当季铵化壳聚糖∶DNA=1∶3比例时，季铵化壳聚糖材料刚好对DNA达到包裹作用，这有助于保持复合物中DNA结构与功能的完整性，有助于实现基因表达。但有研究认为当复合物DNA结合力过强会使胞内释放量降低，使其体内外应用受到抑制，因此要对DNA的结合力进行有效调控，从而促进细胞在复合支架中的生长^[32-33]。

综上所述，实验采用冷冻干燥方法制备了丝素蛋白/壳聚糖复合支架，并对该复合支架的各项性能进行检测，结果表明将丝素蛋白∶壳聚糖按体积比为8∶2进行制备的复合支架有利于细胞生长及代谢，各项数据较符合软骨组织工程要求，部分条件符合骨组织工程要求，为软骨或骨组织工程支架材料研究拓展了方向，但有关此复合支架的体内软骨组织修复动物实验有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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文题释义：

丝素蛋白/壳聚糖复合支架：将壳聚糖溶于浓度为1%的冰乙酸，制备成质量浓度为35 g/L的壳聚糖溶液并与丝素蛋白溶液融合，将素蛋白与羧化壳聚糖按照体积比8∶2的比例混合，再将混合溶液注入48孔板中，每孔注入1 mL，最后通过冷冻干燥得到丝素蛋白/壳聚糖复合支架。

热重分析：是指在程序控制温度下测量待测样品的质量与温度变化关系的一种热分析技术，用来研究材料的热稳定性和组分。实验中将10 mg待检验的样品放于氮气环境下进行检测，测试温度升高控制范围为30-800 ℃，温度上升速度为10 ℃/min。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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实验的创新点在于目前人工材料仍具有较差的生物相容性，而天然材料相容性较高，但是力学性能较差，人们在寻找一种在细胞相容性与力学性能有较好结合的材料，这对于解决一些关节损伤具有临床意义。实验较以往的研究更系统更全面的检测丝素蛋白/壳聚糖复合支架的性能，既往相关支架论文缺少对支架细胞通透性及与细胞的结合效果，此次实验对两方面进行了详细的实验检测，结果提示要对DNA的结合力进行有效调控从而促进细胞在复合支架中的生长。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程