2.1  人牙周膜干细胞的形态学变化  在倒置显微镜下观察原代培养的人牙周膜干细胞可见，培养7 d后细胞呈现贴壁生长，多为长梭形或多边形，较分散，见图1A。培养14 d后，细胞量增多并逐渐融合，呈现以组织块为中心的放射状排列，见图1B。传代后，细胞形态与原代相同，长梭形，细胞胞体饱满，胞浆均匀，呈束状整齐排布，见图1C。

2.2  免疫荧光染色鉴定人牙周膜干细胞的来源  对P4代生长良好的人牙周膜干细胞行免疫荧光染色可见：波形丝蛋白在人牙周膜干细胞的细胞质中呈阳性表达，显示为红染，见图2A；荧光染料Hoechst 33258将细胞核染为蓝色，见图2B；两者复合，见图2C。综上，提示所培养的细胞是间充质来源。

2.3  各组细胞超微结构变化  扫描电子显微镜下可见，胶原蛋白支架呈现网状结构，内部含有大量彼此相通的孔隙，见图3A。在实验组中，载杜仲叶提取物的人牙周膜干细胞与胶原蛋白支架复合培养7 d，可见大量细胞附着于支架表面，细胞突触与支架紧密相连，部分细胞呈现扁平伸展，表面呈现颗粒状突起；细胞间相互接触、紧密相连，见图3B。阳性对照组人牙周膜干细胞与胶原蛋白支架复合培养7 d可见，细胞生长状态良好，细胞数量较实验组少，散在黏附于支架表面，见图3C。

2.4  人牙周膜干细胞在支架材料上的附着情况  随着接种时间的延长，人牙周膜干细胞对支架材料的附着力增加，实验组和阳性对照组的细胞黏附率均呈现上升趋势。培养4 h后两组材料的黏附率达50%以上；培养8 h后两组材料的黏附率约达70%；培养12 h后两组材料的黏附率超过90%。实验组支架材料上细胞的的黏附更好，实验组与阳性对照组之间的细胞黏附率差异有显著性意义(P < 0.05)。培养24 h后，两组黏附率均达到最大值，两组间差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3。

2.5  各组细胞增殖能力  各组人牙周膜干细胞的增殖活性随着培养时间的延长而增强。培养第1天时，各组吸光度值都较低，增殖速度较慢，实验组与空白、阳性对照组之间都差异无显著性意义(P > 0.05)。各组细胞的增殖率从培养第3-7天显著增快，其间实验组测得的吸光度值高于阳性对照组(P < 0.05)；而两者的吸光度值都显著高于空白对照组(P < 0.01)。培养第7天，实验组和阳性对照组人牙周膜干细胞的增殖率都达到最高。结果显示，与实验组相比，阳性对照组的人牙周膜干细胞增殖缓慢(P < 0.05)，实验组和阳性对照组的细胞增殖能力都高于没有支架的空白对照组(P < 0.01)，见图4。

2.6  碱性磷酸酶活性测定  分别对实验组、阳性对照组和空白对照组的人牙周膜干细胞进行成骨诱导，碱性磷酸酶用于检测成骨诱导效果。结果表明，成骨诱导3 d后，3组ALP活性无显著差异(P > 0.05)。诱导至第7，14天时，实验组人牙周膜干细胞的碱性磷酸酶活性高于阳性对照组(P < 0.05)，且两组的碱性磷酸酶测量值都显著高于空白对照组(P < 0.01)。说明成骨诱导后，与杜仲叶提取物作用的人牙周膜干细胞和胶原蛋白支架复合培养后，其碱性磷酸酶活性水平的增加最为显著，见图5。

2.7  各组成骨相关基因的表达变化  在成骨诱导刺激 21 d后，RT-PCR用于检测各组人牙周膜干细胞成骨相关的基因表达。结果表明，实验组和阳性对照组成骨基因Runx2，OPN和OCN的表达均显著高于空白对照组(P < 0.01)。同时，实验组Runx2和OPN基因的表达水平都高于阳性对照组(P < 0.05)，而OCN基因的表达量在实验组中更是显著高于阳性对照组(P < 0.01)。可见，在与胶原蛋白支架共培养后，载杜仲叶提取物的人牙周膜干细胞的成骨相关基因Runx2，OPN和OCN mRNA的表达量都显著上调，见图6。

2.8  不良反应及生物相容性评价  见表4。

根尖周炎、牙周炎及咬合创伤等原因导致的牙槽骨缺损会影响患者的咬合功能，降低咀嚼效率。临床上对于牙槽骨缺损的治疗，多采用自体骨或羟基磷灰石移植，但术后存在疼痛和炎症等问题^[1]。随着生物信号分子研究的不断深入和组织工程技术、材料的不断更新，骨的修复重建也迎来了飞速发展的新时期。如何成功构建具有与天然骨相似的理化和生物学特性的细胞-支架复合物的体外模型，将其植入体内病变，继而形成具有正常组织结构和生理功能的骨已成为研究的热点^[2]。

人牙周膜干细胞可从牙周韧带中分离获得，同人体其他来源的成体间充质干细胞类似，人牙周膜干细胞增殖能力旺盛，具有多向分化潜能^[3]。牙周韧带细胞、骨样细胞、脂肪样细胞、软骨样细胞和成纤维细胞都可以在特定的体外诱导条件下由人牙周膜干细胞分化形成^[4]。然而，体外扩增培养的间充质干细胞存在许多限制其临床应用的问题，例如维持干细胞的性状稳定、保持生物活性及自主分化潜能、延迟干性衰退、防止归巢能力减弱等^[5-7]。最近，研究表明体内干细胞的微环境密切调节其自我更新能力和分化方向，因此，通过精确模拟体内微环境，获得适宜的干细胞体外培养条件已成为提高其扩增效率和分化潜能的重要策略^[8-9]。

通过将体外三维培养的骨髓间充质干细胞和胶原支架的复合体重植入病损部位，颅骨缺损的动物模型得以成功修复。其机制可能是胶原蛋白可以有效地启动和控制骨髓间充质干细胞的矿化过程，这有利于新骨形成；此外，在胶原蛋白表面沉积矿物位点可以诱导新生矿物的沉积^[10]。有研究结果显示，中药杜仲可以刺激骨髓间充质干细胞向成骨方向分化^[11]。这与杜仲补肝肾，强筋骨的功效密不可分；杜仲还可以提高成骨细胞的活性，抑制骨吸收，提高骨密度，加速骨痂改建，临床上常配伍他药用于治疗骨质疏松、骨性关节炎、骨折等疾病^[12]。与骨髓间充质干细胞类似，人牙周膜干细胞的多向分化潜能也已有文献证实^[3]。然而，杜仲对于人牙周膜干细胞的作用尚未有报道。

实验将探讨通过体外共培养，胶原蛋白支架对载杜仲叶提取物的人牙周膜干细胞增殖和成骨分化有无影响，以期为牙槽骨缺损的治疗提供实验依据，奠定理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  细胞学体外实验。

1.2  时间及地点  于2017年10月至2019年5月在包头医学院中心实验室完成。

1.3  材料  胶原蛋白支架，见表1。

牙样本：健康年轻恒牙，取自16-18周岁患者的正畸拔牙的前磨牙样本，由包头医学院第一附属医院口腔科提供。实验通过包头医学院医学伦理委员会审查批准，并与受试者及其监护人均签署知情同意书。

药物：干杜仲叶购自同仁堂中药药房，干燥工艺由药房完成。

1.4  实验方法

1.4.1  杜仲叶提取物的制备  将充分干燥的杜仲叶精细研磨成粉末。取1 g置于10 mL甲醇溶液中，在室温下震荡1 h，并静置过夜。以15 000 r/min离心10 min后，弃去沉淀物，收集上清液并进行真空浓缩。加水至10 mL以溶解残余物来获得杜仲叶提取物。提取物经0.22 µm膜过滤，-20 ℃保存。

1.4.2  分离纯化人牙周膜干细胞并鉴定细胞来源  标本纳入标准为16-18周岁，正畸治疗需拔除的前磨牙，并且所有个体都未患全身性系统疾病。拔除牙有龋坏、牙髓及根尖周病变、牙周及黏膜疾患者予以排除。

用PBS清洗牙根部3-5次，在牙根中1/3处刮取牙周膜组织，并在无菌条件下将组织块修剪至1 mm³大小。将其均匀地平铺在培养瓶底部，翻转并倒置培养瓶。在37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中孵育4 h后，加入体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基正置培养瓶继续培养。培养24 h后，向培养瓶内补加1 ml培养基并在第4天首次、全量换液，弃去未附着的细胞，以后每隔2 d换液1次。待细胞长满单层后，分离纯化人牙周膜干细胞并传代培养。选择P4细胞进行实验，在倒置显微镜下观察细胞形态。

通过免疫荧光染色鉴定波形丝蛋白的表达。首先制备人牙周膜干细胞的细胞爬片，PBS冲洗，40 g/L多聚甲醛固定30 min，体积分数1%牛血清白蛋白封闭30 min，加入一抗置于湿盒中过夜。一抗为小鼠抗人波形丝蛋白(vimitin)单克隆IgG抗体(工作浓度1∶500，Dako公司)。次日 PBS冲洗，避光条件下，用羊抗小鼠IgG-TRITC 荧光二抗(工作浓度1∶100，Sigma公司)孵育1 h。PBS冲洗后用Hoechst 33258(Sigma公司)复染细胞核5 min，甘油封固、标记，并在荧光显微镜下观察细胞表面标志记物波形丝蛋白的表达。波形丝蛋白阳性表达可见胞浆红染，阴性表达则胞浆未被染色。

1.4.3  载杜仲叶提取物的人牙周膜干细胞与胶原蛋白支架复合培养  所购进的胶原蛋白海绵为高纯度医用胶原蛋白冻干品，主要成分是从牛跟腱中提取的Ⅰ型胶原。将无菌医用胶原蛋白海绵于超净工作台内裁剪成1 cm³大小，置于24孔培养板内预先润湿，一个支架材料置于1个孔内。    

实验分为3组：空白对照组，阳性对照组和实验组，每组各自设置3个平行对照孔。在实验组中，将通过胰蛋白酶消化和离心收集的P4代人牙周膜干细胞与杜仲叶提取物充分混合，制备浓度为2×10⁸ L^-1的细胞悬液。将细胞悬液反复滴加到支架材料中，每支架正反面各接种0.25 mL细胞悬液，间隔时间2 h。4 h后，加入培养基以确保支架完全被浸润，并且隔天换液。阳性对照组为经胰蛋白酶消化的人牙周膜干细胞(不与杜仲叶提取物作用)，并将细胞细胞浓度调节为2×10⁸ L^-1，如上所述将细胞悬液接种到胶原蛋白支架上。空白对照组为2×10⁸ L^-1的人牙周膜干细胞悬液(不与杜仲叶提取物复合)直接铺板不加胶原蛋白支架。当测定细胞黏附率和增殖时，每组使用含有体积分数10%胎牛血清的 DMEM培养基。检测成骨分化时，各组人牙周膜干细胞接种后分别继续培养7 d，更换培养基为加入成骨诱导剂 (10^-8 mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、质量浓度50 mg/L抗坏血酸)的含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基。

1.4.4  扫描电镜观察细胞和支架的复合培养物  通过扫描电子显微镜观察分别培养7 d的实验组和阳性对照组的细胞与支架的复合物，将其在体积分数3%戊二醛溶液中固定，用PBS冲洗3次，并通过乙醇分级分离脱水，将样品浸入醋酸异戊酯中。在临界点干燥后，喷金镀膜，并通过扫描电子显微镜观察共培养物。

1.4.5  细胞的黏附率检测  在接种后1，4，8，12和24 h测量实验组和阳性对照组的细胞黏附率。每次每组取3个重复孔。弃去每组的细胞-支架复合物，并收集24孔板内含有未贴壁细胞的培养基；以体积分数0.25%胰蛋白酶消化、收集附着于培养板的人牙周膜干细胞，将两部分细胞混合并进行计数，取3个孔的平均值作为未附着细胞数。

细胞黏附率(%)=[(C0-C)/C0]×100%(其中C0为种植细胞数，C为未附着细胞数)。

1.4.6  MTT法检测细胞增殖  将实验组和阳性对照组的细胞-支架复合物和空白对照组的细胞分别在24孔培养板中培养1，3，5和7 d，每组设3个重复孔。向每个孔中加入400 µL无血清DMEM培养基和100 µL MTT溶液，并在37 ℃、CO₂培养箱中继续孵育4 h。吸出上清液，加入   500 µL二甲基亚砜，振荡混合物10-15 min，使结晶物充分溶解。每孔取3份150 µL的溶解液吸入96孔板中，选择570 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定每孔的吸光度值。

1.4.7  碱性磷酸酶活性的测定  将实验组和阳性对照组的细胞-支架复合物及空白对照组细胞在24孔培养板中孵育7 d后，根据实验设计更换培养条件进行成骨诱导，继续分别培养3，7和14 d后收集细胞进行碱性磷酸酶定量检测，每组设3个重复孔。检测按碱性磷酸酶试剂盒上所示的步骤进行。

1.4.8  RT-PCR检测成骨相关基因  分别根据3个实验设计组接种并常规培养人牙周膜干细胞7 d，更换培养条件进行成骨诱导21 d后，采用Trizol法提取各组细胞总RNA，用Nano Drop仪器对所提取的RNA进行定性检测。用反转录试剂盒将 RNA反转录成cDNA(以β-actin为内参，反转录Runx2、骨桥蛋白(OPN)和骨钙蛋白(OCN)目的基因50 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min，16 ℃ 10 min，合成cDNA第一链。然后利用Nano Drop仪器测定浓度，将其配平到50 mg/L，作为模板待用。按每孔20 μL体系加入96孔板，每组重复3次，进行RT-PCR扩增。扩增条件为：95 ℃   10 min；95 ℃ 15 s，60-64 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环25-32次；72 ℃延伸7 min。扩增引物序列及反应体系见表2。

1.5  主要观察指标  分别将载杜仲叶提取物的人牙周膜干细胞与胶原蛋白支架、人牙周膜干细胞与胶原蛋白支架体外复合培养，并将人牙周膜干细胞常规培养后，观察3组细胞在支架上的黏附、增殖及成骨分化情况。

1.6  统计学分析  采用SPSS 17.0软件对所得实验数据进行处理，计量资料用x(_)±s表示，两组间比较采用配对t 检验，多组间差异比较采用方差分析，事后检验采用SNK检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

炎症、肿瘤及创伤等原因所致的牙槽骨缺损是临床的常见、多发性疾病，而由于牙槽骨解剖形态和生理功能的特殊性，其缺损的治疗过程就显得复杂和缓慢^[13-14]；相较于常规的治疗手段，骨组织工程研究的快速发展在推动牙槽骨的修复重建和再生的进程中功不可没^[15]。目前，大量的研究主要集中在选择合适的种子细胞、构建具有良好生物性能的支架材料及相关调控因素的研究^[16-18]。

作为牙周组织工程重要的种子细胞，牙周膜干细胞的生物活性及其与支架材料微环境的相容性被广泛关注。已有研究证实，牙周膜干细胞比骨髓间充质干细胞和脐带脐血干细胞更具增殖活力和分化潜能，主要表现为体外培养的牙周膜干细胞具有更长的生存期和更高的倍增率，且牙周膜干细胞更倾向于形成牙周、牙槽骨样组织结构。这些证据表明在牙周组织工程中， 人牙周膜干细胞的临床应用具有绝对的优势^[19]。但如何诱导人牙周膜干细胞在体外得以高效扩增并维持其干性特征及定向(成骨及成牙周膜)分化，是当前基础研究和临床治疗中面临的瓶颈问题。有报道已证实模拟体内微环境(细胞因子^[20-21]、天然基质和仿生支 架^[22-25]、理化信号及力学刺激等^[26])在促进干细胞的干性扩增和分化潜能方面大有裨益。来源于动物皮肤和肌腱的胶原蛋白被设计、加工成海绵状三维多孔的固体结构，可用于止血、抗炎、促进伤口愈合、残腔填充和骨修复及软骨损伤，是临床中较为成熟的医用组织工程支架材料^[27]。杜仲的化学活性成分已被证实可以调节骨代谢、促进成骨。曾建春等^[11]发现，含杜仲的血清可刺激骨髓间充质干细胞分化形成骨样细胞，此过程中波形丝蛋白和核纤层蛋白A的表达水平上调，加快了细胞的成骨分化；而钙网织蛋白的表达水平下调，细胞内钙被释出，促进矿化，这些效应都与杜仲有效化学成分密切相关。目前报道多集中于杜仲对于成骨细胞、骨髓间充质干细胞矿化和成骨的促进作用，而其对于人牙周膜干细胞的成骨影响尚无研究。实验将种子细胞人牙周膜干细胞与杜仲叶提取物充分作用，经成骨诱导后，实验组细胞的碱性磷酸酶活性和成骨基因Runx2，OPN和OCN的mRNA表达均高于阳性对照组，结果证实了杜仲对于人牙周膜干细胞的成骨具有正向促进作用。

实验将载杜仲叶提取物的人牙周膜干细胞与胶原蛋白支架共培养，探讨其可否为人牙周膜干细胞的体外增殖及成骨分化提供合适的环境。为了评价支架的生物相容性，通过扫描电镜分别观察有、无载杜仲叶提取物的人牙周膜干细胞与胶原蛋白支架共培养后，细胞的形态和与支架的附着情况；并测定两组细胞在支架材料上的黏附率。扫描电镜结果显示载杜仲叶提取物的人牙周膜干细胞与胶原蛋白支架共培养组有更多细胞附着，并且实验组的细胞表面有突触与支架紧密相连，细胞彼此接触，生长状态良好；在共培养4，8和12 h的细胞黏附率测定结果均显示实验组高于对照组。这些结果表明胶原蛋白支架对于载杜仲叶提取物的人牙周膜干细胞具有良好的生物相容性，这是作为细胞生物材料构建物及其成功的临床应用的先决条件。MTT结果证实，载杜仲叶提取物的人牙周膜干细胞接种于胶原蛋白支架上共培养，比单纯牙周膜干细胞在胶原蛋白支架上共培养和无支架培养的情况下，人牙周膜干细胞具有更高的增殖活性。这种对于人牙周膜干细胞增殖的促进作用意味着更多的多能干细胞可在该支架上生长，此效应在促进骨组织或牙周组织的再生方面意义重大。在矿化诱导条件下，人牙周膜干细胞可以特异性表达牙骨质/成骨样特性标记物，表明它们具有分化为成骨细胞的功能。碱性磷酸酶是参与胶原蛋白的去磷酸化和成骨细胞钙化的必需酶，被认为是矿化细胞外基质的早期标记物。实验结果表明在载杜仲叶提取物的人牙周膜干细胞在胶原蛋白支架上培养后具有更高的碱性磷酸酶活性。作为成骨转录因子，Runx2可调节间充质干细胞向成骨方向分化。同样关键的成骨基因OPN及OCN的表达与人牙周膜干细胞形成矿化基质的能力是一致的，因此也可以作为人牙周膜干细胞成骨分化和矿化能力的特殊标记^[28-29]。在成骨诱导培养21 d后，RT-PCR检测Runx2，OPN及OCN mRNA的表达水平，结果表明这3种基因的表达量在实验组均为最高。成骨相关标志物的基因表达的提高进一步证明了载杜仲叶提取物的人牙周膜干细胞在胶原蛋白支架上共培养可以促进人牙周膜干细胞的成骨分化能力。

综上，载杜仲叶提取物的人牙周膜干细胞在胶原蛋白支架上不仅具有良好的生物相容性，而且共培养后的人牙周膜干细胞具有良好的体外增殖和成骨分化能力。未来实验将进一步研究该细胞-支架复合物在体内的成骨作用以及临床应用的免疫学特性和安全性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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文题释义：

杜仲：是中国特有的杜仲科植物，其活性成分具有促进某些间充质干细胞的增殖，调节骨代谢和促进骨生成，同时抑制骨吸收，并加速骨痂改建的药理作用。临床上，杜仲主要用于预防和治疗骨质疏松症、骨关节炎和骨折等疾病。

人牙周膜干细胞：一种来自牙周韧带的多能间充质干细胞，具有良好的自我更新和多向分化潜能。通过不同的体外诱导条件刺激，它可以分化成骨样细胞、软骨样细胞、牙周韧带细胞、脂肪样细胞和神经元样细胞，并且就细胞来源而言，它是用于牙周组织再生的优选种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

实验的创新之处在于通过组织块黏附法成功分离纯化人牙周膜干细胞并进行传代培养。将载杜仲叶提取物处理后的细胞，于体外和胶原蛋白支架共培养，并进行生物相容性、细胞增殖活性和成骨分化能力的评估。结果证实，胶原蛋白支架与载杜仲叶提取物的人牙周膜干细胞具有良好的生物相容性。它还促进细胞的增殖和成骨分化，是理想的牙周组织工程材料。

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