脂肪间充质干细胞移植治疗肝功能衰竭

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.32.015

摘要/Abstract

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文题释义：
肝衰竭分类：急性肝衰竭、亚急性肝衰竭、慢加急性(亚急性)肝衰竭和慢性肝衰竭。急性肝衰竭的特征是起病急，发病2周内出现以Ⅱ度以上肝性脑病为特征的肝衰竭症候群；亚急性肝衰竭起病较急，发病15 d至26周内出现肝衰竭症候群；慢加急性(亚急性)肝衰竭是在慢性肝病基础上出现的急性肝功能失代偿；慢性肝衰竭是在肝硬化基础上，肝功能进行性减退导致的以腹水或门静脉高压、凝血功能障碍和肝性脑病等为主要表现的慢性肝功能失代偿。
间充质干细胞移植治疗肝功能衰竭：间充质干细胞的存在具有极大的科研和临床价值，目前国际上虽对间充质的研究取得进步，但对其生物学特性、体外诱导分化方法及其应用于肝功能衰竭的作用机制等方面的研究仍不够充分，因而不论是对于其实验研究还是临床研究，皆有待于进一步探索研究。

摘要
背景：有研究发现骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞对肝功能衰竭具有治疗作用，而关于脂肪间充质干细胞移植治疗肝功能衰竭的研究不多。
目的：探讨脂肪间充质干细胞移植对大鼠肝功能衰竭的治疗作用。
方法：将45只SD大鼠随机等分为移植组、模型组和对照组。移植组和模型组大鼠腹腔注射D-氨基半乳糖建立肝功能衰竭动物模型，造模后1周，移植组大鼠经尾静脉注射1 mL脂肪间充质干细胞。
结果与结论：与模型组相比，经脂肪间充质干细胞移植治疗的大鼠丙氨酸转氨酶和天门冬氨酸氨基转移酶明显下降，B超结果明显改善，肝细胞排列尚整齐，炎症细胞减少，肝小叶结构基本比较完整。表明脂肪间充质干细胞治疗大鼠肝功能衰竭可以改善大鼠的肝功能及改善大鼠的肝脏病理形态学改变，对大鼠肝功能衰竭具有一定的治疗作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0003-2157-1921(胡晓阳)

关键词: 干细胞, 移植, 脂肪间充质干细胞, 肝功能衰竭, B超, 肝功能, 丙氨酸转氨酶, 天门冬氨酸氨基转移酶

Abstract:

BACKGROUND: Studies have found that both bone marrow mesenchymal stem cells and umbilical cord mesenchymal stem cells have therapeutic effects on liver failure, but little is reported on adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation for treatment of liver failure.
OBJECTIVE: To discuss the therapeutic effect of adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation on rat liver failure.
METHODS: Forty-five Sprague-Dawley rats were equally randomized into transplantation, model and control group. Except the control group, animal models of liver failure were made by intraperitoneal injection of D-galactosaminein in the transplantation and model groups. One week after modeling, rats in the transplantation group were given 1 mL of adipose-derived mesenchymal stem cells via the tail vein.
RESULTS AND CONCLUSION: Adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation successfully upregulated alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase levels, and moreover, neatly arranged liver cells, reduced inflammatory cells and intact hepatic lobule were shown on B ultrasound after cell transplantation. All these findings indicate that adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation has therapeutic effects on rat liver failure by improving rat’s liver function and pathological changes.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Liver Failure, Liver Function Tests

中图分类号:

R394.2

胡晓阳，冷辉国，毛翠艳，张远. 脂肪间充质干细胞移植治疗肝功能衰竭[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(32): 4811-4817.

Hu Xiao-yang, Leng Hui-guo, Mao Cui-yan, Zhang Yuan. Adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation for treatment of liver failure[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(32): 4811-4817.

图/表（结果） 2

2.1 脂肪间充质干细胞的培养 原代培养4 h后出现贴壁现象(图1A)，24 h换液去除没有贴壁细胞，贴壁细胞主要为三角形或者梭形，折光性比较好，培养至第4天时，细胞明显增多，部分细胞呈现集落样生长，培养至第10天时可达90%融合。传代培养后细胞主要为梭形，传代培养1.5 h出现贴壁现象，12 h出现完全贴壁，传代第3天细胞增殖加快，出现对数生长，传代培养第5天，细胞大完全融合，呈现为线条状细胞群(图1B)。

2.2 脂肪间充质干细胞的鉴定结果 免疫组化染色结果显示，第3代脂肪间充质干细胞的CD44阳性表达率为93.5%，CD105阳性表达率91.3%(图2)，且未见CD34、HLA-DR和CD106阳性表达，表明脂肪间充质干细胞表达间充质干细胞表面标志。

2.3 实验动物数量分析 动物实验全部进入结果分析，实验动物数量为45只，无脱落。

2.4 肝功能变化 移植后，移植组和模型组大鼠天门氨酸转氨酶水平明显上升，且高于对照组(P < 0.05)，同时移植组大鼠天门氨酸转氨酶水平明显低于模型组(P < 0.05；表1)。移植后，移植组和模型组大鼠谷丙转氨酶水平谷丙转氨酶水平明显上升，且明显高于对照组(P < 0.05)，移植组大鼠谷丙转氨酶水平明显低于模型组(P < 0.05；表2)。

2.5 B超检查结果 肝脏B超结果显示，对照组大鼠肝实质为细小均匀回声，包膜光滑，血管走行比较清晰，门静脉血管期相性好；模型组大鼠肝实质回声不均匀或呈结节状，比较粗糙，包膜毛糙不平或呈锯齿状，血管狭窄，走行不太清晰，门静脉血流期相性比较地平或消失；移植组大鼠肝实质回声不均匀，包膜欠光滑，血管欠清晰，门静脉血流期相性降低。其中正常对照组无肝功能衰竭阳性大鼠，模型组15只大鼠均肝功能衰竭阳性，移植组有10只大鼠肝功能衰竭阳性。

2.6 肝脏病理组织学形态 苏木精-伊红染色结果显示，对照组大鼠肝脏内肝细胞排列比较整齐，没有炎症细胞浸润，肝小叶结构正常；模型组大鼠的肝脏组织淤血肿胀，干细胞出现变形坏死，细胞核碎裂，出现大量炎症细胞，肝小叶结构被破坏，肝窦淤血扩张等肝功能衰竭病理表现；移植组经脂肪间充质干细胞治疗后肝细胞排列尚整齐，炎症细胞减少，肝小叶结构基本比较完整(图3)。

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引言

肝炎和肝硬化是中国比较常见的肝脏疾病，两者的发生率有不断升高趋势，且晚期阶段往往累及肝脏实质细胞，引起肝脏功能的异常，从而导致肝功能衰竭^[1]。随着肝炎和肝硬化发生率的升高，肝功能衰竭的发生率也呈现升高趋势，由于肝功能衰竭的死亡率极高。由于肝功能衰竭的保肝治疗无明显效果，而肝脏移植能够代替肝脏细胞，是一种比较理想的治疗肝功能衰竭的方法，但由于肝脏的来源有限，价格昂贵，并且肝脏移植后出现的免疫排斥反应，使肝脏移植在临床中的应用受到限制。

近年来，随着组织工程研究的不断进步和发展，干细胞移植治疗肝功能衰竭成为比较有前景的研究方向。干细胞具有自我更新和增殖能力，能够在体外进行扩增，能够促进肝脏细胞的修复和再生，是治疗肝功能衰竭比较理想的选择。间充质干细胞可以分化为肝样细胞，对肝细胞起到修复作用，还可以分泌细胞因子抑制炎症反应，可以分泌抗纤维化物质产生抗纤维化的作用^[2-4]。既往研究多使用骨髓间充质干细胞以及脐带间充质干细胞治疗肝功能衰竭，而脂肪间充质干细胞移植治疗肝功能衰竭的研究较为罕见。间充质干细胞的存在具有极大的科研和临床价值，目前国际上虽对间充质的研究取得进步，但对其生物学特性、体外诱导分化方法及其应用于肝功能衰竭的作用机制等方面的研究仍不够充分，因而不论是对于其实验研究还是临床研究，皆有待于进一步探索研究。

作者拟对肝功能衰竭模型大鼠进行脂肪间充质干细胞移植治疗，观察大鼠肝功能及肝脏病理形态的变化。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年3月至2015年6月在青岛市胶州中心医院实验室完成。

1.3 材料

动物：清洁级健康SD大鼠50只，鼠龄6-8周，体质量180-210 g，购自山东省实验动物中心。许可证号：SCXK(鲁)2009007。实验前按照实验动物标准饲养1周，饲养于实验室大鼠专用鼠笼。所有大鼠符合卫生部一级动物标准，所有大鼠经过青岛市胶州中心医院动物伦理学委员会批准同意。其中5只用于制备脂肪间充质干细胞，45只用于实验研究。

1.4 方法

1.4.1 脂肪间充质干细胞的分离和培养 取5只SD大鼠，脱颈处死，取颈后皮下脂肪组织，分离血管和筋膜，PBS洗，剪成小组织块，Ⅰ型胶原酶消化，过滤后离心，加入红细胞裂解液进行重悬，离心后弃去上清液，向离心管中加入RPMI1640生长培养基进行培养，24 h后进行首次换液，以后每2 d或3 d进行一次换液。当细胞生长至达90%以上融合时进行胰蛋白酶消化，然后传代培养，每2 d进行一次换液，至细胞生长至铺满瓶底时，重复传代。显微镜下观察细胞的生长情况。

1.4.2 大鼠脂肪间充质干细胞的鉴定 选择第3代细胞进行鉴定，细胞经甲醛固定，PBS洗，H₂O₂孵育，蒸馏水洗涤，加入一抗孵育，PBS洗，加入二抗孵育，PBS洗，加入SABC孵育，PBS洗，DAB显色，苏木精复染。

1.4.3 动物分组 将45只大鼠随机分为移植组、模型组和对照组，各15只。

1.4.4 建立大鼠肝功能衰竭模型 将D-氨基半乳糖(1.6 g/kg)注射到移植组和模型组大鼠腹腔内，造模后给予正常饮食饮水。对照组大鼠腹腔内注射等量的生理盐水。造模成功标准为血液中谷丙转氨酶和天门氨酸转氨酶水平升高。

1.4.5 脂肪间充质干细胞移植 造模后1周，移植组大鼠经尾静脉注射1 mL脂肪间充质干细胞(5×10⁵个)。模型组和对照组大鼠经尾静脉注射等量的PBS。

1.4.6 肝功能检测 建模前以及移植后21 d时，取各组大鼠尾静脉血，采用全自动生化仪检测谷丙转氨酶和天门氨酸转氨酶水平。

1.4.7 B超检查 移植后21 d，大鼠麻醉后，空腹进行肝脏B超检查，主要检查大鼠的肝脏实质回声情况、肝脏包膜情况、肝脏门静脉及其他血管情况。B超检查结果分为5级^[5]：Ⅰ级肝实质为细小均匀回声，包膜光滑，血管清晰，门静脉血管期相性好；Ⅱ级肝实质较Ⅰ级增密增粗，包膜光滑，血管尚清晰，门静脉血管期相性尚好；Ⅲ级肝实质回声不均匀，较Ⅱ级增密增粗，包膜欠光滑，血管欠清晰，门静脉血流期相性降低；Ⅳ级肝实质回声不均匀，比较粗糙，包膜毛糙，血管不清晰，门静脉血流期相性比较地平，Ⅴ级肝实质呈结节状，回声粗糙，包膜呈锯齿状，血管狭窄，不清晰，门静脉血流期相性基本消失。肝功能衰竭阳性指B超结果≥Ⅲ级。

1.4.8 病理观察 移植后21 d时，处死大鼠，取肝脏组织，甲醛固定，石蜡包埋，切片经过二甲苯和乙醇脱蜡，蒸馏水进行洗涤，苏木精进行染色，自来水冲洗，盐酸乙醇分色，自来水冲洗，乙醇进行脱水，酸化伊红染色，乙醇进行分色，加入二甲苯石碳酸，最后二甲苯进行透明，中性树脂进行封固。

1.5 主要观察指标 移植后大鼠肝功能、B超检查肝脏情况以及大鼠肝脏的病理形态学变化。

1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0软件进行处理，计量资料用x(_)±s表示，组间均数比较采用ANOVA法，取P=0.05为显著标准。

讨论

肝功能衰竭是各种肝病的最后阶段，死亡率比较高。肝功能衰竭的病因主要是病毒感染，其中乙肝病毒感染是最长建的原因^[6-7]，乙肝病毒在肝脏内大量复制，导致肝脏的大面积变性坏死，引起肝功能紊乱，最终导致干功能衰竭的发生。肝功能衰竭传统的治疗方法有抗病毒治疗、免疫治疗、人工肝治疗^[8]、肝移植等，但由于抗病毒治疗对阻止病情发展有一定作用，但对已经坏死的干细胞无法修复和再生；免疫治疗疗效尚不确切；人工肝只能暂时性替代肝脏功能；肝移植是目前最为有效的方法，但由于供体比较缺乏、术后免疫反应大，价格比较昂贵，使其在临床应用中受到限制。因此出现了多种治疗肝功能呢衰竭的新的方法和技术：①非生物型人工肝技术^[9-10]：主要包括血浆的置换治疗、血液的滤过治疗、分子吸附再循环系统以及普罗米修斯系统等模拟肝脏的正常功能^[11-13]，清除体内的有毒物质。②生物人工肝技术^[14]：生物人工肝技术是比较理想的肝脏支持治疗方法。③混合人工肝技术^[15]：采用非生物人工肝和生物人工肝相结合的方法治疗肝功能衰竭。但上述方法均只能改善肝功能衰竭的临床症状，对于已经坏死的肝细胞没有逆转作用。干细胞移植为肝功能衰竭的治疗提供了新的思路。

肝细胞包括有肝成体干细胞^[16]、间充质干细胞和胚胎干细胞^[17]，其中应用最多的是间充质干细胞。干细胞治疗肝功能衰竭的机制主要有：①干细胞在一定条件下可以分化为干细胞，替代受损以及坏死的干细胞对肝功能衰竭起到治疗作用^[18-19]。②减少干细胞的凋亡，促进干细胞再生：干细胞能够分泌多种细胞因子减少肝脏细胞的凋亡，促进肝细胞再生^[20-24]。③抑制肝脏纤维化：干细胞移植后可以通过多种途径抑制肝脏纤维化^[25-27]。④免疫调节作用：肝功能衰竭过程中炎症反应和免疫反应发挥中重要作用，干细胞的免疫调节作用是治疗肝功能衰竭的重要因素^[28-32]。⑤搭载基因：干细胞具有低免疫原性，是基因治疗比较好的载体，可以通过搭载基因对干衰竭起到治疗作用^[33-36]。

治疗肝功能衰竭的干细胞主要有：①骨髓间充质干细胞：骨髓间充质干细胞是一种具有低免疫原性，能够自我更新和分化的干细胞，能够促进损伤肝细胞的修复和再生^[37-39]。②脐带间充质干细胞：脐带间充质干细胞分化和增殖能力比较强，免疫原性比较低，也是治疗肝功能衰竭的一种比较理想的种子细胞^[40-41]。③脂肪间充质干细胞：脂肪间充质干细胞也可以改善肝功能衰竭的肝功能^[42-46]。目前关于骨髓间充质干细胞移植治疗肝功能衰竭的研究比较多，而关于脂肪间充质干细胞移植治疗肝功能衰竭的研究不多。实验对肝功能衰竭大鼠进行脂肪间充质干细胞移植，结果发现大鼠天门氨酸转氨酶和谷丙转氨酶明显降低，表明经脂肪间充质干细胞移植治疗后肝功能衰竭大鼠的肝功能明显好转，且B超结果显示，肝实质回声不均匀，包膜欠光滑，血管欠清晰，门静脉血流期相性降低，10只大鼠呈肝功能衰竭阳性，同时苏木精-伊红染色显示，肝细胞排列尚整齐，炎症细胞减少，肝小叶结构基本比较完整。以上结果均提示移植组较肝功能衰竭组生化及病理有一定改善，考率为移植后在受体内分布、迁移、转分化，部分分化为类肝样细胞，从而参与肝功能的修复和重构。另一方面，干细胞能分泌多种细胞因子，如肝细胞生长因子、白细胞介素、干细胞因子、转化生长因子及神经生长因子等。这些细胞因子在肝细胞修复的微环境中诱导干细胞向受损肝脏定植，并在其免疫调节、抑制肝脏炎症反应及和干细胞迁移中起重要作用。

综上，脂肪间充质干细胞治疗大鼠肝功能衰竭可以改善大鼠的肝功能及改善大鼠的肝脏病理形态学改变，对大鼠肝功能衰竭具有一定的治疗作用。