胚胎神经干细胞移植治疗阿尔茨海默病

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.32.014

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
神经干细胞：存在于成体脑组织中，是一种具有多潜能的干细胞。1997年在Science杂志上，Mckay指出神经干细胞具有分化为星形胶质细胞、神经元、少突胶质细胞的能力，并且可以自我更新且提供大量中枢神经系统组织细胞，是在文献中经常提到的神经祖细胞和神经前体细胞。
神经干细胞分化为神经元所处的微环境：通常含有3个方面：①由星形细胞作为的微环境细胞；②基底膜和与基底膜相随的新生血管；③微环境中存在着对神经干细胞分化成神经元起着重要作用的胚胎蛋白。

摘要
背景：近年来，干细胞疗法得到广泛关注，外源性干细胞通过自我复制及分化补充和替代受损或死亡的神经组织细胞，为神经系统损伤带来了希望。
目的：探讨神经干细胞移植治疗阿尔茨海默病的效果。
方法：①选取30只APP/PS1双转基因AD小鼠，随机分为3组，分别为模型组、细胞液移植组、细胞移植组，每组10只；另选取10只C57BL/6小鼠作为对照组；②获取E18的C57BL/6小鼠胚胎，制成神经干细胞悬液，按照感染复数值为1，5，10，15，20加入携带有GFP基因的慢病毒载体稀释液进行神经干细胞转染；③根据脑立体定位技术将含有GFP基因的神经干细胞移植到阿尔茨海默病小鼠脑内海马中，细胞液移植组采用上述相同的移植方法注射同体积完全培养基；④移植后2周进行Morris水迷宫实验，移植4周后获取大脑标本，进行组织学检测。
结果与结论：①模型组、细胞移植组、细胞液移植组的潜伏期均显著长于对照组，目标象限次数均显著少于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。细胞移植组的潜伏期显著短于细胞液移植组和模型组，进入目标象限的次数则显著高于上述两组，差异有显著性意义(P < 0.05)；②移植4周后，与模型组比较，细胞移植组神经元形态较为完整，且数量显著增加；③结果表明，神经干细胞移植治疗阿尔茨海默病小鼠，可以在行为学和形态学上有所改善。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0759-3086(赵辉)

关键词: 干细胞, 移植, 阿尔茨海默病, 干细胞移植, 神经干细胞, 动物模型

Abstract:

BACKGROUND: More recently, stem cell therapy has become an issue of concern. Exogenous neural stem cell transplantation brings new hope for the treatment of nervous system injury by self-replication and differentiation to complement and replace damaged or dead nerve cells.
OBJECTIVE: To explore the therapeutic efficacy of neural stem cell transplantation on Alzheimer’s disease.
METHODS: Thirty APP/PS1 mice with Alzheimer’s disease were randomly assigned into model group, cell solution transplantation group or cell transplantation group (n=10 per group). Another 10 C57BL/6 mice were selected as controls. Embryos of C57BL/6 mice at 18 embryonic days were taken to make neural stem cell suspension followed by transfection using lentiviral vectors carrying GFP gene at different multiplicities of infection (1, 5, 10, 15, 20). Afterwards, GFP-transfected neural stem cells were implanted into the hippocampus of Alzheimer’s disease mice in the cell transplantation group, while the same volume of complete medium was injected into the hippocampus of mice in the cell solution transplantation group. Morris water maze test was performed at 2 weeks after cell transplantation, and brain tissues of mice was taken and detected histologically at 4 weeks after cell transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the escape latency was significantly higher, and the number of crossings over the target quadrant was lower in the other three groups (P < 0.05). Compared with the cell solution transplantation and model groups, in contrast, the escape latency was significantly lower, and the number of crossings over the target quadrant was significantly higher in the cell transplantation group (P < 0.05). Four weeks after transplantation, more intact neurons were found in the cell transplantation group as compared with the model group. These findings indicate that neural stem cell transplantation can improve behavior and morphology performance of mice with Alzheimer’s disease.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Alzheimer Disease, Neural Stem Cells, Stem Cell Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

赵辉. 胚胎神经干细胞移植治疗阿尔茨海默病[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(32): 4805-4810.

Zhao Hui. Embryonic neural stem cell transplantation for Alzheimer’s disease[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(32): 4805-4810.

图/表（结果） 2

2.1 神经干细胞培养结果 神经干细胞原代培养5 d后，可观察到神经球(图1A)。连续培养7 d，神经球体积显著增大，核心部分颜色加深(图1B)。

2.2 神经干细胞的慢病毒转染检测结果 慢病毒转染48 h后，MOI为0的对照组未发现荧光，其余各组均可观察到不同程度的绿色荧光。慢病毒转染72 h后，MOI为0的对照组未发现荧光，其余各组荧光强度有所增强。其中，MOI值为1，5，10的观察组细胞转染阳性率经过组间两两比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.3 Morris水迷宫实验结果 模型组、细胞移植组、细胞液移植组的潜伏期均显著长于对照组，目标象限次数均显著少于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。细胞移植组的潜伏期显著短于细胞液移植组和模型组，进入目标象限的次数则显著高于上述2组，差异有显著性意义(P < 0.05)。模型组与细胞液移植组比较，潜伏期以及目标象限次数差异均无显著性意义(P > 0. 05)，见表2。

2.4 组织学检测结果 移植4周后，经苏木精-伊红染色观察发现，模型组神经元数量明显减少，胞体发生退化，细胞核出现固缩，核仁不明显，部分细胞出现空泡(图2A)；与模型组比较，细胞移植组神经元形态较为完整，且数量显著增加(图2B)；细胞液移植组与模型组进行比较，神经细胞形态未出现明显改变(图2C)；对照组海马结构完整，形态清晰，神经元大多呈球形，且体积较大(图2D)。

经荧光显微镜观察，细胞移植组可以观察到神经干细胞发出绿色荧光分布于侧脑室附近区域(图3)。移植细胞向海马、胼胝体、穹窿海马伞、针道周围、丘脑等部位迁移，且大多呈现出条带状排列。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年8至12月在南阳市中心医院实验室完成。

1.3 材料 选取30只APP/PS1双转基因AD雄性小鼠，6周龄，体质量35 g左右，随机分为模型组、细胞液移植组、细胞移植组，每组10只，均购于中国医学科学院医学实验动物研究所。另选取10只C57BL/6雄性小鼠作为对照组，6周龄，体质量36 g左右，由安徽省盛鹏实验动物科技有限公司提供。孕18 d的C57BL/6雌性小鼠10只用于分离培养神经干细胞，由兰州大学基础医学院医学实验动物中心提供。研究方案符合相关动物伦理学要求。

1.4 实验方法

1.4.1 神经干细胞分离培养与鉴定 取孕18 d的C57BL/6雌性小鼠10只，处死后获得胚胎，分离出端脑，移至盛有无血清完全培养基的培养皿中，培养皿置于冰块上。用眼科剪充分剪碎，反复吹打制成细胞悬液，过滤、离心后去掉上清液，添加神经干细胞基础培养基，接种于培养瓶，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱内培养，每隔3 d半量换液，每5-7 d传代1次。收集第3代细胞，进行细胞重悬，并将细胞接种在预先放置涂有多聚赖氨酸的盖玻片的24孔板中，培养4 h，待神经球贴于盖玻片上，取出，进行Nestin细胞免疫荧光检测。

1.4.2 神经干细胞慢病毒转染 将GFP基因以慢病毒为介导转染祌经干细胞。取第4-6代的神经球，胰蛋白酶消化，离心，弃去上清液，用神经干细胞完全培养基重悬细胞，接种于24孔板内，置于培养箱中培养4 h后取出，各孔按照不同的MOI值(0，1，5，10，15，20)加入慢病毒稀释液，MOI值为0的孔设为对照组，培养10 h后进行半量换液，培养72 h后，加入胰蛋白酶消化，机械吹打后获得单细胞悬液，上流式细胞仪检测细胞的转染阳性率。

1.4.3 分组治疗 实验动物给予10%水合氯酸腹腔注射麻醉，然后固定在立体定位仪上，备皮、消毒后于头皮正中线做切口，拨离颅脑表面结缔组织膜，并使用H₂O₂在骨板上进行烧灼，直至变白停止，观察骨缝，找到囟点。根据动物脑立体定位图谱，确定右侧海马齿状回位置，即为移植点。细胞移植组利用微量进样器吸取神经干细胞悬液5 μL(细胞浓度1×10⁸ L^-¹)，进针止于海马CA1区位置，注射结束后留针2 min，之后缓慢退出针头，缝合头皮。术后进行青霉素腹腔注射，连续7 d。细胞液移植组采用上述相同的移植方法，注射同体积无血清完全培养基。对照组和模型组不进行注射移植。

1.4.4 Morris水迷宫实验 移植后2周对各组动物进行Morris水迷宫实验，参照文献[7]方法进行，利用自动录像系统记录小鼠行为：①小鼠从入水开始直至寻找并爬上平台所需的时间，即潜伏期，若小鼠在120 s内没有找到平台，需要实验人员用手将小鼠引导至平台上，潜伏期则记为120 s；②在第6天撤去平台，随机选择一个入水点，记录小鼠在120 s内进出目标象限的总次数。

1.4.5 组织学检测 移植后4周，大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后处死，获取脑组织标本，浸入多聚甲醛溶液中固定，依次放入梯度蔗糖溶液处理，包埋，制备切片，部分贴于载玻片上，移至荧光显微镜下观察。部分切片贴在多聚赖氨酸处理过的载玻片上，置于室温环境下晾干，进行苏木精-伊红染色，显微镜下观察。

1.5 主要观察指标 ①神经干细胞培养结果；②神经干细胞的慢病毒转染结果；③Morris水迷宫实验结果；④组织学检测结果。

1.6 统计学分析 使用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

阿尔茨海默病是多发生于老年人的一种原发性退行性脑病，是一种持续性高级神经功能活动障碍，如记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面的障碍^[8]，病理特征为大脑皮质萎缩伴β-淀粉样蛋白沉积、记忆性神经元减少^[9]。

成体神经干细胞主要存在于脑内两个狭小的区域——侧脑室的室管膜下区和海马齿状回颗粒下区，且数量非常稀少，识别、解析其分子特征及分化谱系困难重重^[10-12]。更令人遗憾的是，通常情况下处于静息状态的神经干细胞，虽然接收到损伤信号后开始激活，但往往朝着胶质细胞的方向分化，形成瘢痕，堵住了本来可以恢复的通道，而不是朝着具有神经传导功能的神经元分化，这就好似一根电线不“导电”，造成神经损伤性疾病难以痊愈^[13]，常规治疗大多无法获得理想的效果。

1992 年，Reynolds与Weiss学者在成年啮齿动物室管膜下区分离和培养出存在一群特殊的细胞，这种细胞具有一定的自我增殖能力和干细胞特性，并提出了“神经干细胞”这一概念。随后，神经干细胞得到了人们的广泛关注，并为各种神经系统疾病的治疗提供了新思路。神经干细胞是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞，具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力^[14-26]。研究结果显示，神经干细胞移植后可以在宿主体内存活，并不断增殖，并发现神经干细胞沿海马区排列成条状带迁移^[27-30]。由此可以推测，在海马和齿状回的脑室内可能存在一些特殊的物质，可以诱导神经干细胞迁移。但具体是哪种物质可以导致神经干细胞的迁移，则需要进一步的研究。

将外源性基因导入神经干细胞内，关键是载体如何选择^[31]。理想的载体应具备有效表达相应外源基因且转染率高等特点^[32-33]。实验选择利用慢病毒介导的GFP基因作为载体对神经干细胞进行转染。结果显示，慢病毒转染48 h后，MOI为0的对照组未发现荧光，其余各组均可观察到不同程度的绿色荧光。慢病毒转染72 h后，MOI为0的对照组未发现荧光，其余各组荧光强度有所增强，提示慢病毒是一个理想的转染基因载体。

以往陈双庆等^[34]用神经干细胞移植治疗APP-PS1转基因阿尔茨海默病小鼠，脑内代谢得到显著改善，获得理想的治疗效果。实验利用Morris水迷宫实验检测神经干细胞移植治疗效果。模型组、细胞移植组、细胞液移植组的潜伏期均显著长于对照组，目标象限次数均显著少于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。细胞移植组的潜伏期显著短于细胞液移植组和模型组，进入目标象限的次数则显著高于上述两组，差异有显著性意义(P < 0.05)。模型组与细胞液移植组比较，潜伏期以及目标象限次数差异均无显著性意义(P > 0. 05)，这一结果表明，神经干细胞治疗有效改善了动物的行为学功能。移植4周后，脑切片苏木精-伊红染色观察可见，与模型组比较，细胞移植组神经元形态较为完整，且数量显著增加，说明神经干细胞移植可以改善小鼠的组织学形态。

综上所述，神经干细胞移植治疗阿尔茨海默病小鼠，可以在行为学和形态学上有所改善，从而为中枢神经系统疾病的治疗提供了一定的参考和借鉴。