人脐血干细胞分化为鼻黏膜纤毛上皮细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.32.008

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (32): 4764-4770.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.32.008

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人脐血干细胞分化为鼻黏膜纤毛上皮细胞

董金辉，任秀敏，徐鸥，王建星

河北医科大学第二医院耳鼻喉科，河北省石家庄市 050000

修回日期:2016-06-01 出版日期:2016-08-05 发布日期:2016-08-05
通讯作者: 董金辉，河北医科大学第二医院耳鼻喉科，河北省石家庄市050000
作者简介:董金辉，男，1975年生，内蒙古自治区人，汉族， 2010河北医科大学毕业，硕士，主治医师。
基金资助:
2014年度河北省医学科学研究重点课题计划(ZL20140002)

Human umbilical cord blood stem cells differentiate into nasal ciliated epithelial cells

Dong Jin-hui, Ren Xiu-min, Xu Ou, Wang Jian-xing

Department of Otolaryngology, Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China

Revised:2016-06-01 Online:2016-08-05 Published:2016-08-05
Contact: Dong Jin-hui, Department of Otolaryngology, Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China
About author:Dong Jin-hui, Master, Attending physician, Department of Otolaryngology, Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China
Supported by:
the Medical Research Project of Hebei Province of China in 2014, No. ZL20140002

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脐血干细胞：其具备自我更新和增殖的能力，并能在特定因素的影响或诱导下，向各种细胞或组织分化。同时，脐血具有淋巴细胞抗原性弱、功能相对不成熟、移植后发生移植物抗宿主病的风险较低等特点，并且来源广，不受伦理和道德的限制，因此是干细胞移植的重要来源之一，具有广泛应用于临床组织工程学的巨大潜能。
鼻黏膜纤毛上皮细胞：其与外界环境想通，属于不稳定细胞，受损后导致鼻黏膜生物功能严重创伤。临床上常采用鼻内窥镜手术进行长期、定时随访观察鼻腔内容物，防止鼻腔黏膜粘连和炎症复发。术后使用黏液促排剂及其他局部生物材料来改善鼻黏膜的修复，但是由于随访时间不易控，时间长达数月也不能完全治愈，不但给患者带来了沉重的经济负担，而且也严重影响了患者的生活质量。

摘要
背景：鼻黏膜纤毛上皮细胞受损后导致鼻黏膜生物功能严重创伤。相对于其他成体干细胞，人脐血干细胞具有更好的诱导分化潜能。
目的：观察人脐血干细胞通过体外培养、诱导分化为鼻黏膜纤毛上皮细胞的可行性。
方法：收集正常健康人脐血，分离人脐血干细胞，通过体外培养，鉴定干细胞表面标记物后进行传代培养；取第3代脐血干细胞，用携带增强型绿色荧光蛋白重组腺相关病毒进行感染，采用气液界面培养法，分别于诱导感染1，2周后对干细胞进行MUC8基因PCR检测。在脐血干细胞培养3周后进行FOXJ1免疫荧光染色。
结果与结论：①培养鉴定结果：原代人脐血干细胞传代至第3代时，细胞形态较均一，折光性良好，可表达干细胞表面标记物；②转染鉴定结果：细胞转染3 h后，可见第3代干细胞呈现出绿色荧光，培养48 h后，流式细胞仪检测细胞阳性率达96.2%，说明干细胞转染效果很好；③RT-PCR检测：人脐血干细胞MUC8 mRNA无表达，而鼻黏膜上皮细胞MUC8 mRNA呈现出强表达，培养1周时 MUC8 mRNA呈现弱表达，培养2周后有一定的增强；④免疫荧光染色：在转染的绿色荧光蛋白背景下可观测到FOXJ1红色荧光呈现阳性表达结果；⑤结果说明：人脐血干细胞在适宜培养条件下可分化为鼻黏膜纤毛上皮细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-7736-0966(董金辉)

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 鼻黏膜上皮细胞, 人脐血干细胞, 气液界面培养法, 分化, 鼻黏膜纤毛上皮细胞, MUC8, FOXJ1, 鼻窦炎

Abstract:

BACKGROUND: Damage to nasal ciliated epithelial cells can lead to a severe injury in nasal biological function. Compared with other adult stem cells, human umbilical cord blood stem cells have better differentiation potential.
OBJECTIVE: To explore the feasibility of human umbilical cord blood stem cells differentiating into nasal ciliated epithelial cells through in vitro culture and induction techniques.
METHODS: Normal and healthy umbilical cord blood samples were collected to isolate human umbilical cord blood stem cells, followed by identification and subculture in vitro. Umbilical cord blood stem cells at passage 3 were infected with recombinant adeno-associated virus carrying enhanced green fluorescent protein and cultured using air liquid interface culture method. Thereafter, PCR assay was employed for detecting MUCS expression in cultured stem cells at 1 and 2 weeks after induction, and immunofluorescent staining for FOXJ1 was performed at 3 weeks.
RESULTS AND CONCLUSION: After subculture, passage 3 umbilical cord blood stem cells that could express stem cell surface markers were visible in a uniform shape and had good refraction. After 3 hours of gene transfection, green fluorescence issued from the passage 3 cells were visible, and the cell positive rate was up to 96.2% until 48 hours, indicating good transfection efficiency. RT-PCR findings showed that MUC8 mRNA had no expression in the umbilical cord blood stem cells, but expressed strongly in the nasal ciliated epithelial cells, whose expression was weak at 1 week of culture and increased at 2 weeks. Additionally, the positive expression of FOXJ1 red fluorescence was observed under the transfection of green fluorescent protein. These results suggest that human umbilical cord blood stem cells could differentiate into nasal epithelial cells under suitable conditions.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Tissue Engineering, inusitis

中图分类号:

R394.2

董金辉，任秀敏，徐鸥，王建星. 人脐血干细胞分化为鼻黏膜纤毛上皮细胞[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(32): 4764-4770.

Dong Jin-hui, Ren Xiu-min, Xu Ou, Wang Jian-xing. Human umbilical cord blood stem cells differentiate into nasal ciliated epithelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(32): 4764-4770.

图/表（结果） 1

2.1 人脐血干细胞显微形态 原代人脐血干细胞接种后，于37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度培养箱培养1周后，干细胞正常贴壁生长，出现多种形态，主要形态呈现为圆形细胞、梭形或不规则，有形成集落的趋势。换取培养基后继续于培养箱中培养至第4周时，脐血干细胞融合达80%以上，可正常传代。干细胞传至第3代时，光学显微镜下观察，可见脐血干细胞形态较均一，折光性良好，见图1。

2.2 人脐血干细胞表面抗原标记物表达特征 经流式细胞仪检测结果显示，P3代脐血间充质干细胞稳定地高表达CD13和CD44等表面抗原标记物，阳性率分别为86.18%和90.30%，弱表达CD34和CD45等造血细胞标志，表明间充质干细胞是存在于脐血中区别于造血细胞的一群非定向干/祖细胞，这与骨髓间充质干细胞的表面抗原标志相一致，见图2。

2.3 人脐血干细胞的转染及转染率结果 第3代人脐血干细胞被重组腺相关病毒转染3 h后，于荧光倒置显微镜下观察，可见第3代干细胞呈现出绿色荧光(图3)，而对照组细胞未见绿色荧光。干细胞培养48 h后，经流式细胞仪检测，细胞阳性率达96.2%，说明干细胞转染效果较好。

2.4 MUC8基因的表达 RT-PCR结果显示：人脐血干细胞MUC8 mRNA无表达；鼻黏膜上皮细胞MUC8 mRNA呈现出强表达，而且随重组腺相关病毒诱导培养时间的延长，培养1周时MUC8 mRNA呈现弱表达，培养2周后有一定的增强。内参照基因为GAPDH，阳性条带为308 bp，见图4。

2.5 细胞免疫荧光染色检测结果 人脐血干细胞培养3周后进行免疫荧光染色，显微镜下未检测到β-Tubulin表达，而在转染的绿色荧光蛋白背景下可观测到FOXJ1红色荧光呈现阳性表达结果。共聚焦显微镜下可观察到部分标记绿色荧光的脐血干细胞细胞核内可见红色 FOXJ1荧光表达，见图5。

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引言

慢性鼻-鼻窦炎是临床上常见的慢性疾病，病程甚至长达数月^[1]。慢性鼻-鼻窦炎长期迁延不愈会有并发症发生，有些并发症发生甚至会有生命危险，还能显著降低患者生活水平^[2-3]，目前对其发病原因及发病机制还未完全清楚^[5-8]。鼻黏膜纤毛上皮细胞与外界环境想通，属于不稳定细胞，受损后导致鼻黏膜生物功能严重创伤。临床上常采用鼻内窥镜检查进行长期、定时随访观察鼻腔内容物，防止鼻腔黏膜粘连和炎症复发。术后使用类固醇喷雾、黏液促排剂及其他局部生物材料来改善鼻黏膜的修复，但是由于随访时间不易控，时间长达数月也不能完全治愈，不但给患者带来了沉重的经济负担，而且也严重影响了患者的生活质量。因此，寻找一种可以使病变黏膜重新恢复正常的替代物是目前科学家关注的重点。

干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，其在体外适当诱发环境下可以分化为多种细胞，并具备组织的生物功能。近期文献报道表明，体外人工分离、培养干细胞，并通过移植技术治疗恶性肿瘤等慢性疾病已取得一定成效^[9-13]。目前用于研究的干细胞包括间充质干细胞、造血干细胞及脂肪源性干细胞等^[14-22]。

人脐血干细胞是从人脐带中分离获得，获取过程不违背伦理，含量高，免疫原性低，增殖能力强。相对于其他成体干细胞来说，人脐血干细胞显得更加的“年轻”，具有更好的诱导分化潜能，是宝贵的细胞来源。Kogler等^[23]认为脐血间充质干细胞可以分化为3个胚层的不同细胞。有研究将人脐血间充质干细胞与损伤小气道上皮细胞联合培养后，一些间充质干细胞迅速分化为上皮样细胞，修复单层上皮，并表达许多正常小气道上皮细胞的基因特点^[24]。有研究观察人脐血干细胞蛛网膜下腔移植治疗中枢神经系统损伤患者在体内向神经干细胞(NSCs)分化的状态^[25]。

因此，实验通过分离、纯化人脐血干细胞，采用气液界面培养法培养人脐血干细胞及人鼻黏膜上皮细胞，观察细胞形态学，诱导分化成纤毛细胞的可能性，对研究人脐血干细胞向鼻黏膜纤毛上皮细胞的分化具有重要意义。

材料方法

1.1 设计 细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 于2015年3至12月在河北医科大学第二医院实验室完成。

1.3 材料

人脐血来源：采用封闭式采血法采集来自河北医科大学第二医院妇产科健康、正常足月分娩胎儿的脐血18 份，由河北医科大学第二医院产科协助完成。所有产妇无传染性疾病，胎儿无畸形，乙肝病毒和梅毒检查均阴性。产妇孕34-40周自然分娩或剖宫产，新生儿娩出正常断脐带后，消毒脐带侧，行脐静脉穿刺，抽取存留在胎盘内的血液，采集胎儿脐血20-80 mL，置入预先消毒的玻璃瓶中(肝素20-30 U/mL)摇动混匀。所有标本置于4 ℃冰箱保存，于采集后12 h内分离。实验前均已征得产妇及家属授权同意和医院伦理委员会批准。

1.4 实验方法

1.4.1 人脐血干细胞的分离、培养及鉴定 取30 mL脐血，置于50 mL EP离心管(带盖)中，再加入HES 10 mL，振摇混匀，静置1 h；取上层液体20 mL，置于50 mL EP离心管中，加入20 mL PBS，振摇混匀，以2 000 r/min低温离心20 min；弃去上清液，再加入溶血素50 mL，用玻璃吸管慢慢吹打均匀，置于37℃、体积分数50%CO₂培养箱中培养30 min，包被培养瓶，加DMEM/F12完全培养液重悬细胞，用玻璃吸管慢慢吹打均匀，计数后，调整细胞浓度接种于细胞培养瓶中，于培养箱中培养，培养3 d后换培养液，细胞贴壁生长融合约90%时，加入体积分数0.25%胰蛋白酶溶液消化，得原代脐血干细胞，传代培养，于显微下观察干细胞生长状态。

1.4.2 人脐血干细胞的转染及转染率的检测 取正常生长的第3代人脐血干细胞，慢慢倒去上层培养基，用DMEM培养基润洗培养皿3次，再用2 mL DMEM培养基重悬细胞，加入重组腺相关病毒(携带增强型绿色荧光蛋白)感染，置于37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度培养箱中孵育，采用磷酸盐缓冲液假感染作为阴性对照。培养箱中培养3 h后弃去重组腺相关病毒的培养液，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液，并于感染后 3，24，48 h，置于倒置相差荧光显微镜下观察相关病毒的感染情况，采用流式细胞仪检测48 h细胞转染效率^[26]，根据荧光标记细胞，计算转染细胞百分率。

1.4.3 转染后人脐血干细胞的气液界面培养 转染方法同1.4.2，转染成功后，取生长状态良好的人脐血干细胞，置于倒置相差荧光显微镜下观察相关病毒的感染情况，培养48 h后用0.25%胰蛋白酶消化5 min，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，计数，调整细胞浓度为5×10⁸ L^-¹，精密移取1 mL接种于Transwell小室内(已经被鼠尾胶原蛋白Ⅰ型包被)，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液于培养箱中培养24 h后，除去培养液，再加入不含血清的支气管上皮细胞培养基，建立气液界面培养模式，观察细胞生长状态，及时更换培养基。

1.4.4 细胞总RNA的提取及MUC8基因的表达检测 分别于转染前及转染后培养1，2周后收集干细胞，计数后，调整细胞浓度，按总RNA抽提试剂盒说明书操作，进行细胞总RNA的提取，采用紫外分光光度计检测RNA浓度。加入MUC8，GAPDH基因引物，采用RT-PCR法检测转染前及转染后细胞MUC8基因的表达。以正常鼻黏膜上皮细胞作为阳性对照。取PCR产物适量，精密加入含琼脂糖的加样孔内，用凝胶成像分析系统分析，以MUC8基因条带的灰度值与GAPDH内参物条带的灰度值的比值评定结果。

1.4.5 免疫荧光染色检测 人脐血干细胞培养3周后进行免疫荧光染色，再用无菌PBS润洗2次，于室温下，用40 g/L多聚甲醛固定30 min，再用无菌PBS润洗2次；透化后，用PBS润洗2次，加入一抗，阴性对照加入无菌PBS，37 ℃ 2 h，PBS润洗2次后加入荧光标记，避光37 ℃ 1 h，无菌PBS润洗2次，甘油封固，于激光共聚焦微显微镜下观察。

1.5 主要观察指标 人脐血干细胞形态，细胞的转染及转染率，转染后人脐血干细胞的气液界面培养形态，细胞MUC8基因表达及免疫荧光染色结果。

1.6 统计学分析 计量资料以x(_)±s表示，采用SPSS 17.0软件进行数据分析，组间数据差异的比较釆用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

哺乳动物呼吸道鼻黏膜上皮主要由杯状细胞、基底细胞和纤毛细胞组成，主要起到免疫防御作用。正常鼻、鼻窦黏膜上皮完整，黏膜表面光滑，基底膜无增厚，间质无水肿，炎性细胞极少^[27]。鼻黏膜具有调节温度、湿润和洁净等作用^[28-32]，其损伤会造成过度通气，鼻腔干痂，入睡困难，睡眠状态欠佳等，严重影响患者的生活学习。

目前，干细胞在鼻黏膜上皮细胞的修复方面的研究也已取得一定成效。研究表明，体外培养的人脐血干细胞在特定条件下可以分化为胚层组织^[33-34]。以往研究通常采用胚胎干细胞和骨髓间充质干细胞进行修复呼吸道上皮细胞，但是发现胚胎干细胞取材涉及伦理问题，而骨髓间充质干细胞修复效果有限^[35-36]。近年来，从人脐带中成功分离获得脐血干细胞，研究发现将骨髓间充质干细胞在含有脐血基础培养基中培养数周后，经鼠尾静脉注射至低剂量辐照非肥胖性糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠体内，结果发现含有脐血的干细胞不仅可以分化成为纤毛细胞，而且还可以定植到肺部，发挥修复作用^[37-39]。随着干细胞技术的不断发展，其来源不断扩新，分化细胞不断更新，干细胞用于治疗疾病的潜力将有目共睹^[40-46]。

实验通过分离、纯化人脐血干细胞，采用气液界面培养法培养人脐血干细胞及人鼻黏膜上皮细胞，观察细胞形态学，诱导分化成纤毛细胞的可能性；原代人脐血干细胞于37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度培养箱培养1周后，形态呈现为圆形细胞、梭形或不规则。传代至第3代时，于显微镜下观察，可见脐血干细胞形态较均一，折光性良好，标记物鉴定结果显示，干细胞高表面抗原标记物表达CD13和CD44 等表面抗原标记物，阳性率分别为 86.18%和90.30%，弱表达 CD34和CD45等造血细胞标志物，表明间充质干细胞是存在于脐血中，这与骨髓间充质干细胞的细胞表面抗原标志物表达相一致。

实验结果发现，细胞转染3 h后，脐血干细胞转染后显微镜下发出绿色荧光，培养48 h后，流式细胞仪检测细胞阳性率达96.2%，说明干细胞转染效果很好。PCR测定结果显示，人脐血干细胞不表达MUC8 mRNA，显微镜下未检测到抗β-Tubulin抗体表达，而在转染的绿色荧光蛋白背景下可观测到FOXJ1红色荧光呈现阳性表达结果。实验结果提示，人脐血干细胞在适宜条件下可分化为鼻黏膜纤毛上皮细胞。文章结果验证了早产胎儿脐血更易得到可以传代和纯化的干细胞，可能与其脐血中间充质干细胞量更多有关，但足月胎儿脐血也可以获得一定数量纯化和具有增殖分化能力的干细胞，目前各种优化条件还在研究中，尚缺乏统一有效的方法。

人脐血干细胞分化为鼻黏膜纤毛上皮细胞

Human umbilical cord blood stem cells differentiate into nasal ciliated epithelial cells

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