CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞活性与多药耐药的相关性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.32.007

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
肿瘤放疗和化疗中的肿瘤干细胞：因其具有很强耐受力，不容易被摧毁。目前肿瘤化疗药物主要是针对处于分裂周期的细胞，而肿瘤干细胞多处于静息期休眠状态，对化疗药物的敏感性差，这就是肿瘤化疗后缩小，而停药后仍可能原位复发的原因。近年来肿瘤干细胞学说越来越受到科学家的关注，目前已经成功在脑肿瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、皮肤癌等多种恶性肿瘤中成功分离出了肿瘤干细胞。肿瘤干细胞的提出为肿瘤发生和复发机制提供了合理解释，对于研发更有效的抗肿瘤药物及干细胞和细胞生物学研究均具有重大意义。但是，对肿瘤干细胞耐药的机制、自噬对肿瘤干细胞干性的影响、肿瘤干细胞由休眠到激活的调控等，都还需要长期的研究。
多药耐药：是导致肿瘤治疗失败的主要原因之一，肿瘤患者围手术期的化疗是控制复发转移的主要手段。通过对不同类型肿瘤耐药表型的研究，可以揭示其耐药特征，进而分析耐药基因表达与临床病理和预后的相关性，对提高治疗效果具有重要的临床意义。

摘要
背景：肿瘤干细胞与肿瘤的复发、转移以及耐药等之间存在十分密切的联系。
目的：探讨CD44⁺CD24^-/low乳腺癌干细胞活性与多药耐药的相关性。
方法：运用免疫磁珠法从多药耐药乳腺癌细胞株MCF-7/ADR中分选出CD44⁺CD24^-/low乳腺癌干细胞。流式细胞仪测定分选后CD44⁺CD24^-/low乳腺癌干细胞亚群比例和细胞膜P-gp荧光强度，RT-PCR法检测多药耐药基因MDR mRNA表达水平。
结果与结论：①获得的CD44⁺CD24^-/low乳腺癌干细胞比例在90%以上；②CD44⁺CD24^-/low细胞亚群成球比例明显强于non-CD44⁺CD24^-/low细胞亚群；③CD44⁺CD24^-/low细胞亚群的细胞膜P-gp荧光强度显著高于MFC-7/ADR细胞株(P < 0.05)；④CD44⁺CD24^-/low细胞亚群的MDR mRNA表达水平显著高于MFC-7/ADR细胞株(P < 0.05)；⑤结果表明，分选得到的CD44⁺CD24^-/low乳腺癌干细胞具有很强的体外成球能力，高表达P-gp蛋白和MDR mRNA可能是导致多药耐药的原因之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-6165-090X(翟晓建)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 乳腺癌, 细胞活性, 细胞分选, 多药耐药, 体外成球实验, 耐药基因

Abstract:

BACKGROUND: Tumor stem cells are found to be involved in the recurrence, metastasis and drug resistance of the tumor.
OBJECTIVE: To explore the relationship between cell activity and multidrug resistance of CD44⁺CD24^-/low breast cancer stem cells.
METHODS: CD44⁺CD24^-/low breast cancer stem cells sorted from multidrug resistant breast cancer cell line MCF-7/ADR were detected as percentage using flow cytometry. P-gp fluorescence intensity of the cell membrane and MDR mRNA expression in sorted cells and MCF-7/ADR were detected using flow cytometry and RT-PCR, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: After sorting by flow cytometry, the proportion of CD44⁺CD24^-/low breast cancer stem cells was more than 90%, indicating that the sorted cells could meet the needs of the subsequent experiment. CD44⁺CD24^-/low cell subsets exhibited stronger ability to form microspheres than non- CD44⁺CD24^-/low cell subsets. The P-gp fluorescence intensity and MDR mRNA expression of CD44⁺CD24^-/low cells were significantly higher than those of MFC-7/ADR cell line (P < 0.05). These experimental findings suggest that CD44⁺CD24^-/low breast cancer stem cells sorted from MCF-7/ADR cell lines have a strong ability to form cell microspheres in vitro, and significantly raise the level of P-gp protein and MDR mRNA expression, which may be one of the causes of multidrug resistance.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Breast Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, P-Glycoprotein, Drug Resistance, Neoplasm, Antigens, CD44, Antigens, CD24, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1.1 设计 体外观察性实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年1至2月在南阳市中心医院实验室完成。

1.3 材料 乳腺癌细胞株MCF-7/ADR由上海华研生物科技有限公司提供。

1.4 实验方法

1.4.1 多药耐药乳腺癌细胞株MCF-7/ADR培养^[9] 将多药耐药乳腺癌细胞株MCF-7/ADR接种于含体积分数为10%小牛血清、160 U/L胰岛素、100 mg/L链霉素和100 U/mL青霉素的RPMI 1640培养液中，在37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱培养。

1.4.2 CD44⁺CD24^-^/low乳腺癌干细胞分选^[10] 取对数期多药耐药乳腺癌MCF-7/ADR细胞，消化、离心、制备单细胞悬液，添加10 μL CD24-Biotin充分混合均匀，孵育15 min后添加20 μL Anti-biotin MicroBeads，充分混合均匀，孵育15 min后进行离心，利用MACD分选系统获得CD24^-^/low细胞，并按照上述相同的步骤进行分选，最终获得CD44⁺CD24^-^/low细胞。

1.4.3 流式细胞仪检测CD44⁺CD24^-^/low细胞比例^[11] 取生长良好的CD44⁺CD24^-^/low细胞亚群，PBS洗涤后制备单细胞悬液，添加5 μL鼠抗人CD24-FITC和0.625 μL兔抗人CD44-PE，置于避光环境下孵育0.5 h，流式细胞仪检测CD44⁺CD24^-^/low细胞比例。

1.4.4 体外成球实验^[12-13] 取生长良好的CD44⁺CD24^-^/low细胞亚群和non-CD44⁺CD24^-^/low细胞亚群，用含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、B27的DMEM/F12培养液进行重悬，置于CO₂培养箱中进行培养，每日观察细胞成球情况，连续观察7 d。

1.4.5 细胞膜P-gp荧光强度检测^[14] 取生长良好的CD44⁺CD24^-^/low细胞亚群和MFC-7/ADR细胞株，PBS洗涤后制备单细胞悬液，添加5 μL鼠抗人P-gp蛋白-PE，置于避光环境下孵育0.5 h，利用流式细胞仪检测细胞膜P-gp荧光强度。

1.4.6 RT-PCR检测MDR mRNA表达^[15] 取生长状态良好的CD44⁺CD24^-^/low细胞亚群和MFC-7/ADR细胞株，提取细胞总RNA，利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，然后利用PCR扩增仪进行PCR扩增，严格按照试剂盒说明书进行操作，最后用Rotor Gene6.0软件进行数据获取和分析。

1.5 主要观察指标 ①流式细胞仪检测CD44⁺CD24^-^/low细胞比例；②体外成球实验观察CD44⁺CD24^-^/low与 non-CD44⁺CD24^-^/low细胞亚群成球情况；③不同细胞亚群的细胞膜P-gp荧光强度以及MDR mRNA表达水平。

1.6 统计学分析 使用SPSS 18.0软件进行统计学分析，组间比较予以t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

乳腺癌术后较易出现耐药现象，影响治疗效果^[16]。随着干细胞相关理论的不断发展，从干细胞角度进行分析，肿瘤干细胞的出现是导致肿瘤产生的根本原因^[17-20]。Heimburgert等^[21]通过研究发现，在肿瘤细胞中存在一些特殊的干细胞，即肿瘤干细胞。随着肿瘤干细胞相关研究的不断丰富，人们逐渐发现，肿瘤干细胞与各种肿瘤的发生和发展以及耐药之间都存在十分密切联系^[22-24]。

CD44⁺CD24^-^/low是公认的乳腺癌干细胞标志物，从人乳腺癌转移淋巴结和癌性胸水中分离的CD44⁺CD24^-^/low表型的细胞被确定具有干性^[25-27]。在乳腺癌肿瘤细胞中CD44⁺CD24^-^/low表型的细胞亚群具有强大的成瘤能力。越来越多的研究显示，乳腺癌干细胞是乳腺癌发生和发展的源泉，完全杀灭和消除乳腺癌干细胞是彻底治愈乳腺癌的关键^[28-29]。以往Al-Hajj等^[30]分离出人乳腺癌干细胞，并通过研究发现，乳腺癌干细胞CD44⁺CD24^-^/low具有很强的自我更新以及多向分化能力。实验结果显示，经流式细胞仪分选，获得的细胞表达乳腺癌干细胞标记物CD44⁺CD24^-^/low的比例在90%以上，所获得的细胞可以满足后续实验的需要。通过对CD44⁺CD24^-^/low细胞亚群和non-CD44⁺CD24^-^/low细胞亚群进行相同的培养和观察比较后发现，CD44⁺CD24^-^/low细胞亚群具有更强的体外成球能力，提示CD44⁺CD24^-^/low细胞亚群具有很强的自我更新能力，与肿瘤干细胞的特点一致。

多药耐药是导致肿瘤治疗失败的主要原因之一，临床上多次化疗后未被杀灭的肿瘤细胞，通常称之为“耐药”细胞，其耐药机制为细胞中的某些物质可以将进入细胞内的化疗药物选择性地向细胞外转运，从而使细胞得以存活^[31]。乳腺癌患者围手术期的化疗是控制复发转移的主要手段，乳腺癌复发被认为是由于非分裂的乳腺癌干细胞具有抗药性。因此，分析耐药基因表达与临床病理和预后的相关性均具有重要的临床意义^[32]。近年来关于耐药相关基因研究最多的是多药耐药基因1(MDR1)及其编码的P-糖蛋白(P-gp)^[33-36]。P-gp蛋白和由MDR1基因介导的一种蛋白，可以将药物泵出细胞，促进细胞内药物浓度的下降，有效保护肿瘤细胞，避免其受到各种化疗药物的杀伤^[37-39]。P-gp蛋白和MDR基因是研究肿瘤耐药性的重要检测指标^[40]。经流式细胞仪检测和荧光强度分析，CD44⁺CD24^-^/low细胞亚群的细胞膜P-gp荧光强度显著高于MFC-7/ADR细胞株。PCR检测CD44⁺CD24^-^/low细胞亚群的MDR mRNA表达水平显著高于MFC-7/ADR细胞株。

综上所述，以CD44⁺CD2^-^/low为标志物可以对乳腺癌干细胞进行分选，分选得到的CD44⁺CD24^-^/low乳腺癌干细胞具有很强的体外成球能力，并明显上调P-gp蛋白和MDR mRNA表达水平，可能是导致多药耐药的原因之一。