姜黄素通过ATK/FoxM1信号通路调控胃癌干细胞增殖及凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.32.003

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
姜黄素：是从姜科或天南星科植物根茎中提取的一种二酮类化合物，为橙黄色结晶粉末，不溶于水，可溶于乙醇、碱、酸等溶液。研究证明，姜黄素具有抗炎、抗高血压、抗胆固醇、抗胆结石、抗风湿、抗氧化、抗凝、抗突变等生物学作用。姜黄素抗肿瘤作用也越来越受到人们的关注。
AKT：又称PKB，即蛋白激酶B，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可使多种蛋白及自身磷酸化，在调节细胞存活及多种功能中起着重要的作用。AKT也是PI3K/AKT信号通路中的关键分子，其活性异常能够导致正常细胞向恶性细胞的转化，其磷酸化功能能够使多种底物被活化，促进肿瘤细胞的生长、侵袭、转移，抑制肿瘤细胞的凋亡。

摘要
背景：姜黄素对多种肿瘤细胞及肿瘤干细胞有抑制作用，但其对胃癌干细胞的影响及作用机制尚未见报道。
目的：探索姜黄素对胃癌干细胞的影响及作用机制。
方法：利用肿瘤球形成实验和胃癌表面标记物(EpCAM及CD44)从胃癌SGC7901细胞系中分离胃癌干细胞；MTT实验检测姜黄素对胃癌干细胞增殖的影响；流式细胞仪检测姜黄素对胃癌干细胞凋亡的影响；Western blot检测胃癌干细胞中FoxM1、p-AKT及AKT的表达；给予PI3K/AKT信号通路阻断剂LY294002干预胃癌干细胞，研究AKT信号通路与FoxM1信号通路的调控关系。
结果与结论：①成功从胃癌SGC7901细胞系中分离出了EpCAM+/CD44+双阳性胃癌干细胞；②姜黄素可以抑制胃癌干细胞的增殖，促进其凋亡，抑制干细胞中FoxM1及p-AKT的表达；③PI3K/AKT信号通路阻断剂LY294002能够抑制胃癌细胞中p-AKT及FoxM1的表达；④结果提示，姜黄素可以通过阻断ATK/FoxM1信号通路抑制胃癌干细胞增殖并促进其凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-3466-3833(贺东黎)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 姜黄素, ATK/FoxM1信号通路, p-AKT, FoxM1, 胃癌SGC7901细胞, ；胃癌, 肿瘤干细胞, 增殖, 凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Curcumin has crucial inhibitory effects on various cancer cells and cancer stem cells. However, its effect on gastric cancer stem cells and the underlying mechanism of this effect are unclear.
OBJECTIVE: To explore the effect of curcumin on gastric cancer stem cells and the underlying mechanism.
METHODS: Tumor sphere-forming assay and gastric cancer stem cell markers (EpCAM and CD44) were used to separate gastric cancer stem cells from gastric cancer SGC7901 cell lines. Effects of curcumin on the proliferation and apoptosis of gastric cancer stem cells were determined by MTT and flow cytometry analysis, respectively. Western blot analysis was used to detect the expression levels of FoxM1, p-AKT, and AKT. LY294002, an inhibitor of the PI3K/AKT pathway, was used to determine the regulatory relationship between AKT and FoxM1 signaling pathways.
RESULTS AND CONCLUSION: The EpCAM+/CD44+ gastric cancer stem cells were successfully isolated from SGC7901 cells. MTT assay showed that curcumin inhibited the proliferation of gastric cancer stem cells, while flow cytometry analysis showed that curcumin induced apoptosis in gastric cancer stem cells. In addition, the expression levels of p-AKT and FoxM1 were decreased by curcumin treatment. After being treated by LY294002, the expression levels of p-AKT and FoxM1 were down-regulated markedly. In conclusion, curcumin can inhibit cell proliferation and induce apoptosis in gastric cancer stem cells via the ATK/FoxM1 signaling pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Curcumin, Neoplastic Stem Cells, Stomach Neoplasms, Cell Proliferation, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

贺东黎. 姜黄素通过ATK/FoxM1信号通路调控胃癌干细胞增殖及凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(32): 4731-4737.

He Dong-li. Curcumin effect on proliferation and apoptosis of gastric cancer stem cells via ATK/FoxM1 signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(32): 4731-4737.

图/表（结果） 2

2.1 胃癌SGC7901干细胞富集结果 流式细胞术检测结果显示(图1A)，在胃癌干细胞富集培养前SGC7901细胞中表达EpCAM⁺/CD44⁺双阳性细胞的比例为0.9%，富集培养后双阳性细胞的比例为85%。图1B展示了分离到的胃癌干细胞球。

2.2 姜黄素对胃癌干细胞增殖的影响 用不同浓度姜黄素(5，10，20 μmol/L)处理胃癌SGC7901干细胞24，48，72 h。MTT实验结果显示，随着药物浓度的增大，其对细胞的抑制作用增强，且随着时间的延长，药物对细胞的抑制作用也呈上升趋势，见图2。可以推测，姜黄素对胃癌干细胞增殖的抑制具有剂量和时间依赖性。

2.3 姜黄素对胃癌干细胞凋亡的影响 使用15 μmol/L姜黄素处理胃癌干细胞48 h后收集细胞，流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。结果显示，与对照组相比，15 μmol/L姜黄素组胃癌干细胞凋亡数明显增多，差异有显著性意义(图3)。

2.4 姜黄素对胃癌干细胞中FoxM1、p-AKT及AKT蛋白表达的影响 胃癌干细胞经15 μmol/L姜黄素处理48 h后，Western blot检测细胞内FoxM1、p-AKT及AKT的蛋白表达情况。结果显示，与对照组相比，姜黄素处理组中p-AKT及FoxM1的蛋白表达水平明显降低(图4)。

2.5 LY294002对胃癌干细胞增殖和凋亡的影响 使用AKT信号通路阻断剂LY294002处理胃癌干细胞24 h后，MTT实验检测细胞的增殖和凋亡情况。结果显示，阻断剂处理后，细胞的生存率明显低于对照组(图5A)。细胞凋亡检测结果显示，与对照组相比，阻断剂明显诱导了胃癌干细胞的凋亡(图5B)。2.6 LY294002对FoxM1、p-AKT及AKT蛋白表达的影响 Western blot检测结果显示使用阻断剂处理胃癌干细胞后，与对照组相比，FoxM1及p-AKT的蛋白表达水平明显降低(图6)。可以推测，AKT信号通路的失活降低了FoxM1的蛋白表达水平。

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引言

胃癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，在中国是第二大常见肿瘤^[1]。以化学药物为主的晚期治疗效果较差，5年生存率极低，不到15%，并常伴随着复发、转移及死亡^[2]。因此提高患者生存率，寻找新的治疗手段是治疗胃癌亟待解决的问题^[3]。

Hambruger等^[4]首次提出了肿瘤干细胞，并对其特性进行了一系列的研究，发现肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的一群数量极少，能够自我更新、无限增殖、多向分化的细胞。目前，越来越多的研究证明了多种肿瘤中存在肿瘤干细胞，如胃癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等^[5-6]。胃癌干细胞被认为是胃癌细胞抵抗化疗、肿瘤复发和转移的根源，因此对胃癌干细胞的杀伤作用才是治疗胃癌，预防复发和转移的关键^[7]。

姜黄素是从姜科或天南星科植物根茎中提取的一种二酮类化合物，为橙黄色结晶粉末，不溶于水，可溶于乙醇、碱、酸等溶液^[8]。研究证明，姜黄素具有抗炎、抗高血压、抗胆固醇、抗胆结石、抗风湿、抗氧化、抗凝、抗突变等生物学作用^[9]。自1985年Kuttan等^[10]首次提出姜黄素具有抗肿瘤作用，Limtrakul等^[11]在皮肤癌的研究中发现1%含量的姜黄素可以明显抑制小鼠体内肿瘤的数量和体积，进一步验证了姜黄素抗肿瘤作用及安全性。最近的研究报道，姜黄素对多种肿瘤干细胞也有抑制作用^[12]。姜黄素及姜黄素类似物通过对结直肠癌干细胞的抑制降低了肿瘤的复发，抑制了肿瘤的生长^[13]。姜黄素通过调控E-钙黏蛋白的表达及E-钙黏蛋白/β-catenin复合物的形成抑制了乳腺癌干细胞的转移及上皮间质转化^[14]。但是，姜黄素对胃癌干细胞的作用目前还没有报道。

AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可使多种蛋白及自身磷酸化，在调节细胞存活及多种功能中起着重要的作用^[15]。AKT也是PI3K/AKT信号通路中的关键分子，其活性异常能够导致正常细胞向恶性细胞的转化，其磷酸化功能能够使多种底物被活化，促进肿瘤细胞的生长、侵袭、转移，抑制肿瘤细胞的凋亡^[16]。FoxM1属于Forkhead转录因子家族成员，参与了多种肿瘤生长的调控，还可以抑制卵巢癌干细胞、乳腺癌干细胞、胶质瘤干细胞等多种类型肿瘤干细胞^[17-19]。Fox信号通路和AKT信号通路对多种肿瘤的发生和发展有着重要的影响，对肿瘤的抑制和治疗也起着重要的作用^[20-21]。有研究报道，染料木黄酮可以通过降低Notch1的表达及抑制FoxM1/AKT信号通路的活性而抑制前列腺癌细胞的增殖并诱导凋亡^[22]。

实验首先使用姜黄素处理胃癌SGC7901干细胞，检测姜黄素对胃癌干细胞增殖和凋亡的影响。为了阐明姜黄素调控胃癌干细胞增殖和凋亡的机制，使用PI3K/AKT信号通路阻断剂LY294002干预胃癌干细胞，观察胃癌干细胞内FoxM1、p-AKT及AKT的表达情况。

材料方法

1.1 设计 细胞分子生物学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2013年11月至2015年1月在南阳市中心医院病理实验室完成。

1.3 材料 胃癌细胞SGC7901购自中科院上海细胞库。姜黄素购自Sigma公司，溶于二甲基亚砜中。

1.4 实验方法

1.4.1 胃癌SGC7901细胞培养 使用含体积分数为10%小牛血清的RPMI1640培养基培养胃癌SGC7901细胞，置于相对湿度95%，温度37 ℃、体积分数为5%CO₂的恒温培养箱中，每2 d或3 d更换新鲜培养液。待细胞生长至对数生长期，使用0.25% Trypsin-EDTA对细胞消化2 min，清洗离心后，用培养基重悬细胞，以1︰3的比例进行传代。

1.4.2 胃癌SGC7901干细胞的培养 将SGC7901细胞用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，用PBS清洗2次，再用无血清DMEM培养基清洗1次，以每孔约2 000个细胞接种于96孔板中，加入无血清DMEM/F12培养基(含有20 μg/L表皮细胞生长因子，10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子，2% B27添加剂，1% N2添加剂)培养3-5 d，观察细胞成球情况，每3 d向培养板内添加新鲜的干细胞培养基，维持细胞生长，约15 d后进行细胞传代，取出干细胞球，吹打成单细胞悬液，以每孔2 000个细胞接种于低黏附板继续培养。

1.4.3 流式细胞仪检测胃癌干细胞比例 将待测细胞用胰蛋白酶消化，离心，PBS清洗，再与EpCAM和CD44抗体各20 μL于冰上孵育30 min，孵育后的细胞再用PBS清洗2次，离心收集细胞上流式细胞仪检测。

1.4.4 MTT法检测细胞增殖 取培养中的胃癌SGC7901干细胞，制成单细胞悬液，接种于新鲜干细胞培养液中，调整细胞浓度为5×10⁸ L^-¹接种于96孔板中，每孔100 μL，继续在37 ℃、体积分数为5% CO₂的恒温培养箱中培养约24 h，观察细胞贴壁后，加入终浓度为0，5，10，20 μmol/L的姜黄素溶液，每一浓度梯度设置5个复孔，对照组加入等体积的溶剂二甲基亚砜，继续培养24，48，72 h。药物处理时间结束后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃避光孵育4 h，再加入100 μL二甲基亚砜溶液终止反应，室温轻轻振荡10 min使沉淀充分溶解，用酶标仪检测570 nm波长处的吸光度值。

1.4.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 取培养中的胃癌SGC7901干细胞，制成单细胞悬液，接种于新鲜干细胞培养液中，调整细胞浓度为2×10⁸ L^-¹接种于超低黏附6孔板中，每孔1 mL，每孔加入1 mL姜黄素溶液使终浓度为15 μmol/L，设置5个复孔。对照组加入等体积的溶剂二甲基亚砜。药物干预48 h后，用PBS清洗细胞2次，各孔中加入Binding Buffer重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC及5 μL Propidium Iodide混匀，室温避光孵育15 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.4.6 Western blot检测蛋白表达 收集处理后的胃癌SGC7901干细胞，PBS清洗2次，用RIPA裂解液提取细胞中的总蛋白，并用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白样品的浓度。各组蛋白样品加入上样缓冲液煮沸 5 min后，取每个样品50 μg进行10%的SDS-PAGE电泳，用硝酸纤维素膜转印，加入一抗孵育过夜，β-actin为内参，辣根过氧化物酶标记的二抗室温反应1 h，显色后，曝光。

1.4.7 AKT信号通路的抑制 将培养中的胃癌SGC 7901干细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度为2×10⁸L^-1，培养24 h，待细胞贴壁后，将PI3K/AKT信号通路阻断剂LY294002加入细胞中，使终浓度为25 μmol/L，对照组加入等体积的二甲基亚砜，继续培养24 h，收集细胞，采用上述相同方法检测胃癌SGC7901干细胞增殖、凋亡以及相关蛋白的表达。

1.5 主要观察指标 ①姜黄素对胃癌SGC7901干细胞增殖和凋亡的影响；②姜黄素处理后胃癌SGC7901干细胞中FoxM1、p-AKT及AKT蛋白的表达；③抑制AKT信号通路对胃癌SGC7901干细胞增殖、凋亡及FoxM1、p-AKT及AKT蛋白表达的影响。

1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0软件对数据进行统计学分析。计量数据以x(_)±s表示，组间比较采用Student’s t检验或单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

肿瘤干细胞是一群能够启动癌症发生，具有自我更新能力的细胞，肿瘤干细胞学说的提出给肿瘤的治疗带来了新的挑战和机遇^[5]。目前，肿瘤的治疗主要是针对组织中大多数细胞，而非肿瘤干细胞，干细胞在肿瘤组织中的含量较少，却起着非常重要的作用^[23-24]。根据肿瘤干细胞理论，选择性的杀伤肿瘤干细胞可以克服肿瘤抗药性并防止肿瘤的复发与转移。

目前对肿瘤干细胞的分离主要有3种方式：利用干细胞表面标记物分离、利用细胞能否排出Hoechst染料的特性分离以及利用干细胞成球的特性分离^[25]。Takaishi等^[26]利用CD44为筛选标记，从6种胃癌细胞系(AGS、NCI-N87、MKN-28、MKN-45、MKN-74、KATO-III)发现NCI-N87、MKN-74、MKN-45这3个细胞系中含有CD44阳性细胞，这些阳性细胞在含表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基中可以形成球形细胞克隆，表现出自我更新和分化潜能的干细胞特性，CD44阳性胃癌干细胞还能够表现放疗和化疗抗性，再把这些CD44阳性细胞皮下接种到NOD/SCID小鼠体内，几个月后小鼠的成瘤能力明显强于普通胃癌细胞接种的小鼠。Xue等^[27]利用长春新碱化疗诱导，从胃癌SGC7901细胞系中得到干细胞样细胞，这些细胞具有间质细胞的特性，提高了间质细胞标志Snail、Twist、Vimentin的表达，下调了上皮细胞标记E-钙黏蛋白的表达，细胞内CD44、CD90及CXCR4 mRNA表达明显升高，还能够提高其在NOD/SCID小鼠体内的成瘤能力。实验应用肿瘤球培养的方法从胃癌SGC7901细胞系中成功分离出了胃癌干细胞，肿瘤球培养方法在获得肿瘤干细胞的同时还能检测所分离细胞的肿瘤干细胞特性。

姜黄素作为一种肿瘤抑制剂，已经在多种肿瘤细胞、肿瘤干细胞及临床实体瘤的研究中展示了其抗肿瘤活性^[28-29]。Cai等^[30]将不同浓度姜黄素作用于胃癌细胞系，发现姜黄素可以下调PAK1的活性及cyclinD1的表达，阻断胃癌细胞周期从G₁期到S期的转换，最终抑制胃癌细胞的增殖和入侵。姜黄素还可以通过抑制胃癌SGC7901中NF-κB及抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL的表达而增加该细胞对化疗药物的敏感性^[31]。姜黄素还可以抑制肿瘤干细胞的自我更新能力，抑制细胞生长，抑制干细胞分化而最终降低肿瘤干细胞在癌细胞中的数量^[32]。目前姜黄素对胃癌SGC7901干细胞的影响还未知。实验使用不同浓度姜黄素处理胃癌干细胞24，48，72 h后，MTT法检测结果显示姜黄素可以剂量及时间依赖性的抑制胃癌干细胞的增殖。另外流式细胞仪检测结果显示，姜黄素可以显著诱导胃癌干细胞的凋亡。

姜黄素在抑制肿瘤干细胞的过程中，涉及到多种信号通路，例如Wnt、Hedgehog、Notch、STAT等^[33]。研究表明，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信号广泛参与增殖、凋亡、分化等多种细胞功能的调节过程，其与下游蛋白激酶B(PKB或AKT)所组成的信号通路在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要的作用^[15^，^33]。FoxM1在多种肿瘤中存在异常高表达，特异性的敲除或抑制FoxM1在卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌等细胞系中的表达可以导致多种细胞周期相关蛋白的表达下调，同时导致癌细胞增殖抑制及细胞凋亡^[34-36]。为了验证姜黄素对胃癌干细胞影响的作用机制，探索了AKT/FoxM1信号通路在胃癌SGC7901干细胞中的表达情况。姜黄素处理后的胃癌干细胞中，p-AKT和FoxM1的蛋白表达水平明显降低。作者推测姜黄素可能是通过p-AKT/FoxM1信号通路抑制胃癌干细胞。为了进一步探索这个信号通路的作用机制，将PI3K/AKT信号通路阻断剂LY294002加入胃癌干细胞中，观察AKT信号通路被阻断后FoxM1的表达情况。结果显示，AKT信号通路的阻断显著抑制了FoxM1的表达，这说明在胃癌干细胞中，AKT信号通路可以正向调控FoxM1的表达。

综上所述，实验利用肿瘤球形成实验和胃癌表面标记物(EpCAM和CD44)从胃癌SGC7901细胞中分离出了胃癌干细胞。姜黄素处理后胃癌干细胞增殖能力降低、凋亡率增加，并降低了胃癌干细胞中p-AKT及FoxM1的表达。使用PI3K/AKT信号通路阻断剂LY294002处理胃癌干细胞，结果发现阻断剂抑制AKT信号通路后，细胞内FoxM1表达水平明显降低，说明在胃癌干细胞内，AKT信号通路可以正向调控FoxM1的表达。总之，实验证明了姜黄素通过抑制p-AKT/FoxM1信号通路来抑制胃癌干细胞的增殖及诱导细胞凋亡，这为胃癌干细胞的研究及胃癌的治疗提供了新的思路。