胃癌干细胞在肿瘤侵袭转移及对血管形成的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.32.004

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (32): 4738-4744.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.32.004

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胃癌干细胞在肿瘤侵袭转移及对血管形成的影响

张丽贤¹，张宁²，袁双珍¹，陈玉梅¹，苏新爱¹，孙建顺¹，王丽华¹，林美³

1衡水市哈励逊国际和平医院消化内科，河北省衡水市 053000
2衡水市第四人民医院骨科，河北省衡水市 053000
3河北医科大学附属第一医院消化内科，河北省石家庄市 066004

修回日期:2016-06-12 出版日期:2016-08-05 发布日期:2016-08-05
通讯作者: 林美，硕士，副主任医师，河北医科大学附属第一医院消化内科，河北省石家庄市 066004
作者简介:张丽贤，1980年生，女，河北省石家庄市人，硕士。
基金资助:
衡水市科技局立项2012年衡水市科学技术研究与发展计划项目(12012A)

Gastric cancer stem cells in tumor invasion and metastasis and its influence on angiogenesis ability

Zhang Li-xian¹, Zhang Ning², Yuan Shuang-zhen¹, Chen Yu-mei¹, Su Xin-ai¹, Sun Jian-shun¹, Wang Li-hua¹, Lin Mei³

1Department of Gastroenterology, Harrison International Peace Hospital, Hengshui 053000, Hebei Province, China
2Department of Orthopedics, Fourth People’s Hospital of Hengshui, Hengshui 053000, Hebei Province, China
3Department of Gastroenterology, First Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 066004, Hebei Province, China

Revised:2016-06-12 Online:2016-08-05 Published:2016-08-05
Contact: Lin Mei, Master, Associate chief physician, Department of Gastroenterology, First Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 066004, Hebei Province, China
About author:Zhang Li-xian, Master, Department of Gastroenterology, Harrison International Peace Hospital, Hengshui 053000, Hebei Province, China
Supported by:
the Scientific Research and Development Plan Project of Hengshui City, China, in 2012, No. 12012A

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
胃癌干细胞：胃癌的发生与干细胞的突变有关。基因突变可使胃干细胞转变成胃癌干细胞，进而发展成胃癌。胃干细胞可能是基因突变和积累的重要细胞，可能在胃癌发生的早期阶段发挥重要作用。
胃癌干细胞在肿瘤形成及转移中的意义：炎症环境可为肿瘤干细胞和基质细胞提供持续的生长信号，不同程度上影响肿瘤的形成，并在肿瘤转移的整个过程中发挥重要作用。炎症环境促进基质细胞分泌生长因子、趋化因子和基质改变因子，参与血管形成及组织纤维化，成为肿瘤转移环境中的关键因素，可诱导肿瘤细胞向周围器官的远处转移。

摘要
背景：胃癌干细胞在新辅助化疗、常规治疗中发挥重要作用，与患者治疗后复发关系密切，但是该结论尚未得到证实。
目的：观察胃癌干细胞在肿瘤侵袭转移中的作用及对血管形成能力的影响。
方法：建立胃癌模型裸鼠，分离培养胃癌干细胞。将采集的胃癌干细胞分别进行细胞划痕实验、成环实验、细胞抑制率实验、细胞转移性实验及成瘤实验。
结果与结论：①细胞形态：胃癌干细胞培养7 d后贴壁生长，贴壁细胞缺乏规律性，多为蝌蚪形；②划痕实验：划痕后0，24 h细胞划痕宽度差异有显著性意义(P < 0.05)；③成环实验：倒置显微镜观察显示，胃癌干细胞能形成环状；④细胞抑制率实验：奥沙利铂干预胃癌干细胞的半抑制浓度显著低于5-氟尿嘧啶(P < 0.05)；⑤胃癌肿瘤干细胞转移性实验：胃癌干细胞穿过基底膜细胞数显著高于细胞转移前(P < 0.05)；⑥成瘤实验：胃癌干细胞植入后胃癌组织质量显著重于普通胃癌裸鼠(P < 0.05)。结果说明：胃癌干细胞在肿瘤侵袭、转移中发挥重要的作用，具备较强的血管形成能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-7990-6806(张丽贤)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 胃癌干细胞, 侵袭转移, 血管形成, 划痕实验, 成环实验, 细胞抑制率实验, 细胞抑制率实验, 细胞活性, 耐药机制

Abstract:

BACKGROUND: Gastric cancer stem cells involved in the neoadjuvant chemotherapy and conventional treatment are closely associated with relapse of gastric cancer. However, this conclusion has not yet been confirmed.
OBJECTIVE: To investigate the effects of gastric cancer stem cells in tumor invasion and metastasis and its effect on angiogenesis ability.
METHODS: We prepared nude mouse models of gastric cancer to isolate and culture gastric cancer stem cells. Harvested gastric cancer stem cells were detected in cell scratch test, ring test, inhibition rate test, cell migration test and tumorigenicity test.
RESULTS AND CONCLUSION: After 7 days of culture, the cells exhibited adherent growth but a lack of regularity that most cells were in a tadpole shape. In the cell scratch test, the scratch width was significantly different at 0 and 24 hours (P < 0.05). Under an inverted microscope, the cells were found to form a ring in the ring test. The 50% inhibiting concentration of gastric cancer stem cells induced by oxaliplatin was significantly lower than that induced by 5-fluorouracil (P < 0.05). The number of cells passing through the basilar membrane was significantly increased after cell migration (P < 0.05). After implantation of gastric cancer stem cells, the gastric tissue quality was significantly higher than that in normal nude mice of gastric cancer (P < 0.05). These findings indicate that gastric cancer stem cells responsible for tumor invasion and migration have stronger angiogenesis ability.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Tissue Engineering, Stomach Neoplasms

中图分类号:

R394.2

张丽贤，张宁，袁双珍，陈玉梅，苏新爱，孙建顺，王丽华，林美. 胃癌干细胞在肿瘤侵袭转移及对血管形成的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(32): 4738-4744.

Zhang Li-xian, Zhang Ning, Yuan Shuang-zhen, Chen Yu-mei, Su Xin-ai, Sun Jian-shun, Wang Li-hua, Lin Mei. Gastric cancer stem cells in tumor invasion and metastasis and its influence on angiogenesis ability[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(32): 4738-4744.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 裸鼠30只全部进入结果分析数量，无脱落。

2.2 胃癌干细胞形态观察 胃癌干细胞分离后进行培养，细胞悬浮生长，培养7 d后贴壁生长，悬浮生长细胞相对较少，多为圆形、椭圆形；贴壁生长细胞相对较多，且缺乏规律性，细胞多为蝌蚪形，见图2。

2.3 细胞划痕实验结果 胃癌干细胞在划痕后0，24 h采用显微镜观察划痕的宽度，结果显示：植入胃癌干细胞前划痕宽度为(0.750±0.023) mm，24 h后划痕宽度为(0.310±0.016) mm，不同时间段划痕宽度差异有显著性意义(P < 0.05)，倒置显微镜下可见胃癌干细胞位置发生率了明显的变化，见图3。

2.4 胃癌干细胞成环实验结果 调整胃癌干细胞浓度为1×10⁴个接种在96孔板中，培养24 h后观察成环数量，结果显示：胃癌干细胞成环数量为(7.20±1.47)个，通过倒置显微镜观察成环形态，胃癌干细胞注射后能形成完整的环，见图4。

2.5 细胞抑制率实验结果 采用MTS方法检测奥沙利铂以及5-氟尿嘧啶对胃癌干细胞细胞活性的影响。结果显示：奥沙利铂为胃癌干细胞的半抑制浓度为(0.67±0.17) mg/L，而5-氟尿嘧啶的胃癌干细胞半抑制浓度为(2.23±0.56) mg/L，两者相比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.6 胃癌肿瘤干细胞转移性实验结果 结晶紫染色结果显示，胃癌肿瘤干细胞穿过基底膜细胞数为(172.60±12.28)个，细胞转移前为(85.20±6.57)个，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

2.7 胃癌肿瘤干细胞成瘤实验结果 将1×10⁶个细胞接种在裸鼠背部，在同等条件下喂养4周后麻醉处死裸鼠，测量胃癌组织质量发现，胃癌干细胞植入后胃癌组织质量为(0.624±0.036) g，普通胃癌裸鼠为(0.165± 0.011) g，两者差异有显著性意义(P < 0.05)，胃癌转移瘤组织变化见图6。

参考文献

[1] Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro- oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet. 2010;376(9742): 687-697.
[2] 张德龙,王伟,张力,等.Wnt/β-catenin 信号途径促进肌源性干细胞向神经细胞分化[J].解放军医学院学报,2014, 3(54):383-387.
[3] Xue Z, Yan H, Li J, et al. Identification of cancer stem cells in vincristine preconditioned SGC7901 gastric cancer cell line. J Cell Biochem. 2012;113(1): 302-312.
[4] Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 2007;131(5):861-872.
[5] Xi HQ, Cai AZ, Wu XS, et al. Leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 5 is associated with invasion,metastasis,and could be a potential therapeutic target in human gastric cance. Br J Cancer. 2014;110(8):2011-2020.
[6] 赵何伟,王太洪,郑苏文,等.CD90蛋白的研究进展[J].中国普外基础与临床杂志,2012,19(9):1015-1019.
[7] Varon C, Dubus P, Mazurier F, et al. Helicobacter pylori infection recruits bone marrow-derived cells that participate in gastric preneoplasia in mice. Gastroenterology. 2012;142(2):281-291.
[8] 谢建伟,黄昌明,郑朝辉,等.肿瘤干细胞表面标记物CD44在胃癌中的表达及其意义[J].中华胃肠外科杂志,2013, 16(11):1107-1112.
[9] Katsuno Y, Ehata S, Yashiro M, et al. Coordinated expression of REG4 and aldehyde dehydrogenase 1 regulating tumourigenic capacity of diffuse-type gastric carcinoma-initiating cells is inhibited by TGF-beta. J Pathol. 2012;228(3):391-404.
[10] 关心,陆智祥,杨同华.肿瘤干细胞的生物学特性及其研究进展[J].生命科学,2014,26(2):194-200.
[11] Yoo YA, Kang MH, Lee HJ, et al. Sonic hedgehog pathway promotes metastasis and lymphangiogenesis via activation of Akt, EMT, and MMP-9 pathway in gastric cancer. Cancer Res. 2011; 71(22):7061-7070.
[12] 林照亮,吴炎,戴少敏,等.肿瘤干细胞及其 Wnt信号通路在胃癌患者中的表达[J].黑龙江医学,2013,37(6): 408-410.
[13] Pacheco-Pinedo EC, Durham AC, Stewart KM, et al. Wnt/beta-catenin signaling accelerates mouse lung tumorigenesis by imposing an embryonic distal progenitor phenotype on lung epithelium. J Clin Invest. 2011;121(5):1935-1945.
[14] Croker AK, Allan AI. Inhibition of aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity reduces chemotherapy and radiation resistance of stem-like ALDHhiCD44? human breast cancer cells. Breast Cencar Res Treat. 2012;133(1):175-187.
[15] 赵丽琴,郭伟剑,张晓伟,等.CBX7 在胃癌干细胞样细胞中的表达及其功能研究[J].中国癌症杂志,2013,23(2): 114-119.
[16] 郭乐乐,欧阳晓晖,苏秀兰.干细胞与胃癌关系的研究进展[J/CD].中华临床医师杂志:电子版,2012,6(20):6461- 6463.
[17] 乐雄,杨德同,张洪海.胃癌干细胞对氟尿嘧啶敏感性及化疗药物耐受细胞的生物学机制[J].中国组织工程研究, 2015,19(19):3022-3026.
[18] 周志华,张建东,徐桂芳,等.基于克隆形态分选胃癌干细胞及其对氟尿嘧啶敏感性的检测[J].中华胃肠外科杂志, 2013,16(4):376-380.
[19] Lecluse LL, Spuls PI. Photodynamic therapy versus topical imiquimod versus topical fluorouracil for treatment of superficial basal-cell carcinoma: a single blind, non-inferiority, randomised controlled trial: a critical appraisal. Br J Dermatol. 2015;172(1):8-10.
[20] 朱雯静,杨玥,郝溥辰,等.5-氟尿嘧啶作用人肝癌细胞系SMMC-7721后残存细胞中肿瘤干细胞比例增加[J].胃肠病学和肝病学杂志,2012,21(3):224-228.
[21] 吴婷,李锦毅,陆士新,等.人胃癌侧群细胞的分离鉴定和生物学特性分析[J].中华肿瘤杂志,2012,34(4):264-268.
[22] 王守练,俞继卫,蔡成,等.RNA干扰抑制KATO-Ⅲ CD133阳性胃癌细胞CD133基因表达及对其生物学特性的影响[J].中华胃肠外科杂志,2013,16(9):889-894.
[23] Yang L, Han S, Sun Y. An IL6-STAT3 loop mediates resistance to PI3K inhibitors by inducing epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell expansion in human breast cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 2014;453(3):582-587.
[24] Waki M, Ide Y, Ishizaki I, et al. Single-cell time-of-flight secondary ion mass spectrometry reveals that human breast cancer stem cells have significantly lower content of palmitoleic acid compared to their counterpart non-stem cancer cells. Biochimie. 2014;107 Pt A:73-77.
[25] 姜伟,李锦毅,吴婷,等.胃癌侧群细胞的耐药性及致瘤性的初步研究[J].临床肿瘤学杂志,2012,17(8):673-677.
[26] 卓志红,张乐鸣,牧启田,等.二十二碳六烯酸联合5-氟尿嘧啶对胃癌细胞生长及bcl-2、bcl 2l12和bax表达的影响[J].中华普通外科杂志,2009,24(1):66-70.
[27] Guth AM, Deogracias M, Dow SW. Comparison of cancer stem cell antigen expression by tumor cell lines and by tumor biopsies from dogs with melanoma and osteosarcoma. Vet Immunol Immunopathol. 2014;161 (3-4): 132-140.
[28] 陈军,崔有宏,郝迎学,等.5-氟尿嘧啶及长春新碱对胃癌细胞SGC-7901干细胞相关特性的影响[J].第三军医大学学报,2013,35(12):1247-1251.
[29] 王欣荣,刘登湘,刘丽华,等.5-FU对小鼠乳腺癌4T1细胞株中肿瘤干细胞样细胞的富集作用[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2012,19(5):478-485.
[30] 杨玥,李德龙,朱雯静,等.5-氟尿嘧啶对肝癌细胞系BEL-7402中肿瘤干细胞的富集作用[J].中华肝脏病杂志, 2011,19(9):686-691.
[31] Kizilbash SH, Ward KC, Liang JJ, et al. Survival outcomes in patients with early stage, resected pancreatic cancer-a comparison of gemcitabine-and 5-fluorouracil-based chemotherapy and chemoradiation regimens. Int J Clin Pract. 2014; 68(5):578-589.
[32] Li SY, Sun R, Wang HX, et al. Combination therapy with epigenetic-targeted and chemotherapeutic drugs delivered by nanoparticles to enhance the chemotherapy response and overcome resistance by breast cancer stem cells. J Control Release. 2015; 205:7-14.
[33] 燕丽,史立纲,徐正顺,等.5-氟尿嘧啶对乳腺癌MCF7细胞中干细胞相关基因Oct4、Bmi-1表达的影响[J].中国组织工程研究,2012,16(10):1822-1826.
[34] 翟荣林,张小明,王继亮,等.O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶在结肠癌干细胞中的表达及其与结肠癌5-氟尿嘧啶获得性耐药的关系[J].中华实验外科杂志,2014,31(2): 248-250.
[35] 李德龙,朱雯静,韩旭,等.肝癌干细胞逃避5-氟尿嘧啶单药杀伤可能是造成化疗失败的重要原因[J].实用肝脏病杂志, 2012,15(2):126-129.
[36] 吴松洁,贾晓渊,钱其军,等.人胃癌细胞系BGC-823中SP细胞的耐药性研究[J].浙江理工大学学报,2008,25(5): 573-577.
[37] Miyoshi N, Ishii H, Nagai K, et al. Defined factors induce reprogramming of gastrointestinal cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(1):40-45.
[38] Goel S, Duda DG, Xu L, et al. Normalization of the vasculature for treatment of cancer and other diseases. Physiol Rev. 2011;91(3):1071-1121.
[39] Soda Y, Marumoto T, Friedmann-Morvinski D, et al. Transdifferentiation of glioblastoma cells into vascular endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011; 108(11):4274-4280.
[40] 蒋佩佩,胡畅远,武文一,等.microRNA-212在胃癌中的表达及临床意义[J].肿瘤学杂志,2012,18(4):246-249.
[41] Abdelfatah E, Kerner Z, Nanda N, et al. Epigenetic therapy in gastrointestinal cancer: the right combination. Ther Adv Gastroenterol. 2016;9(4): 560-579.
[42] Lv Y, Song L, Chang L, et al. Inhibitory effects of bevacizumab monoclonal antibodies in combination with chemotherapy in different time sequences on a human gastric carcinoma cell line. Ir J Med Sci. 2016.
[43] Khan SA, Khan AM, Karim S, et al. Panacea seed "Nigella": a review focusing on regenerative effects for gastric ailments. Saudi J Biol Sci. 2016;23(4):542-553.
[44] Ishido K, Higuchi K, Azuma M, et al. Aprepitant, granisetron, and dexamethasone versus palonosetron and dexamethasone for prophylaxis of cisplatin-induced nausea and vomiting in patients with upper gastrointestinal cancer: a randomized crossover phase II trial (KDOG 1002). Anticancer Drugs. 2016.
[45] Omura Y, Lu D, Jones MK, et al. Optimal Dose of Vitamin D3 400 I.U. for Average Adults has A Significant Anti-Cancer Effect, While Widely Used 2000 I.U. or Higher Promotes Cancer: Marked Reduction of Taurine Camp; 1α, 25(OH)2D3 Was Found In Various Cancer Tissues and Oral Intake of Optimal Dose of Taurine 175mg for Average Adults, Rather Than 500mg, Was Found to Be A New Potentially Safe and More Effective Method of Cancer Treatment. Acupunct Electrother Res. 2016;41(1): 39-60.
[46] Chen Y, Zheng H, Zhang J, et al. Protective effect and potential mechanisms of Wei-Chang-An pill on high-dose 5-fluorouracil-induced intestinal mucositis in mice. J Ethnopharmacol. 2016.
[47] Chen T, Xu XY, Zhou PH. Emerging molecular classifications and therapeutic implications for gastric cancer. Chin J Cancer. 2016;35(1):49.
[48] Bano N, Najam R, Qazi F, et al. Clinical Features of Oxaliplatin Induced Hypersensitivity Reactions and Therapeutic Approaches. Asian Pac J Cancer Prev. 2016;17(4):1637-1641.
[49] Tanaka S, Sanefuji K, Kabashima A, et al. A Case of Virchow's Lymph Node Recurrence of Gastric Cancer Who Had Underwent Gastrectomy, and Treated with S-1 Monotherapy Leading to Complete Response (CR). Gan To Kagaku Ryoho. 2016 Apr;43(4):455-457.
[50] Tsuruda Y, Ishigami S, Uenosono Y, et al. A Case of Recurred Gastric Cancer of the Anastomosis Completely Responding to Docetaxel, Cisplatin, and S-1 Triplet Therapy. Gan To Kagaku Ryoho. 2016; 43(4): 451-453.

引言

胃癌是世界范围内癌症相关性死亡的第二大原因，由于胃癌发病早期临床症状不显著，多数患者一旦确诊已经是中晚期，错过了最佳治疗时间^[1]。尽管临床上对于胃癌的诊断、治疗有较多先进的工具和治疗方法，但是5年生存率仍低于30%^[2-3]。中国有超过90%患者为进展期腺癌，仅有10%患者为早期胃癌。相关研究显示：胃癌的发展是一个复杂的多步骤过程，涉及基因及遗传学改变等^[4-5]。因此，临床上研究胃癌化疗耐药以及肿瘤细胞的逃避等能为靶向治疗提供新的思路^[6]。

肿瘤干细胞被成功分离、鉴定最早出现在血液系统疾病研究中。相关研究显示：多数实体肿瘤存在一类特殊的肿瘤干细胞，具备自我更新分化能力，且在结肠癌、乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤中均有表达^[7-8]。肿瘤干细胞具有较强的自我更新能力，能够修复受损的DNA，且在特定的条件下具备多向分化潜能^[9]。同时，部分肿瘤干细胞能够成瘤，促进肿瘤的复发与转移。研究显示：胃癌患者在新辅助化疗或常规治疗后，不会减少肿瘤干细胞数目，会进一步造成胃癌干细胞的富集，从而能促进胃癌的发生、发展和转移^[10-11]。

肿瘤的发生、发展是一个多因素作用的结果，在肿瘤形成早期，肿瘤细胞主要通过渗透的方式获得营养，从而维持自身生长。随着肿瘤不断变大，通过渗透获得的营养将难以无法满足肿瘤的需要，此时肿瘤则需要构建血管为自身生长源源不断的提供营养^[12-13]。肿瘤干细胞及其分化的血管内皮细胞对目前的常规化疗、分子靶向药物均并不敏感，最重要的是分子靶向治疗表面上减少了肿瘤总体的血供，但是却增加了肿瘤的浸润和转移，它是临床分子靶向治疗失败的主要原因之一。最新研究显示：肿瘤干细胞能够在一定的条件下直接分化为血管内皮细胞，促进肿瘤的转移、复发^[14-15]，但是该结论尚未得到证实。

文章以此探讨胃癌干细胞在肿瘤侵袭转移中的作用及对血管形成能力的影响。

材料方法

1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 于2014年12月至2016年1月在河北医科大学附属第一医院实验室完成。

1.3 材料

动物：清洁级3-6周龄裸鼠30只，体质量34-64 g，平均(50.14±3.32) g，雌雄随机，实验动物均由河北医科大学附属第一医院动物实验中心提供，饲养严格遵守相关标准进行饲养，合格证号：SCXK(冀)2007-0010。对裸鼠进行等条件喂养，对裸鼠的处理符合《关于善待实验动物的指导性意见》中相关规则^[16-17]。

1.4 实验方法

1.4.1 裸鼠胃癌模型的构建 裸鼠正常饮食1周，从第2周起每日自由饮食100 mg/L的N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍液体。同时，每只裸鼠给予1 mL乙醇，连续饮食2 d，禁食1 d。次日下午对裸鼠进行灌胃20 mL体积分数85%的脱氧胆酸钠溶液，每周采用钳子夹住裸鼠胃部，让裸鼠保持激怒状态，持续10 min，连续灌胃24周，建立裸鼠胃癌模型，入选裸鼠均符合胃癌临床诊断标准，且经过X射线、CT等证实确诊视为模型成功标准^[18-19]，见图1。

1.4.2 胃癌干细胞分离及鉴定 建模成功后处死裸鼠，取出胃部组织进行30 min离心，速度3 000 r/min。向获得的细胞中加入8 mL培养液，充分混合均匀，胃癌干细胞为悬浮生长细胞，培养于超低黏附培养瓶中，并放置在37 ℃培养箱中进行培养，每隔2 d换液1次，观察胃癌干细胞生长情况。待细胞生长融合80%时，进行传代培养^[20-21]。

1.4.3 胃癌干细胞在肿瘤侵袭转移及血管形成实验

细胞划痕实验：采用Marker笔在器皿中均匀划线，控制细胞数约为5×10⁵个，根据细胞生长情况进行调整，次日细胞生长满皿底。采用白色小枪头垂直于背后进行划痕，采用PBS进行3次冲洗，去除脱落细胞，并将其放入培养箱中，采用倒置显微镜观察不同时间段划痕情况并拍照^[22-23]。

成环实验：将黄、蓝EP枪头放入冰箱中备用，去除基质胶利用乙醇消毒后，将基质胶与无血清基质根据1∶3稀释。将基质胶均匀涂在96板孔中，每孔30 μL，轻轻拍打，并放入冰箱中备用。取对数生长细胞进行 5 min离心，速度500 r/min，调整细胞浓度为2×10⁸ L^-¹，将其放入基质胶中，培养8 h后观察成环情况^[24-25]。

细胞抑制率实验：取对数生长胃癌干细胞，调整细胞浓度为5×10⁸ L^-¹，并将其放入培养箱中进行6 h孵育，加入奥沙利铂以及5%的5-氟尿嘧啶，保持最终体积为200 μL，培养15 d后采用酶联免疫法检测490 nm波长下的吸光度值，计算出细胞抑制率^[26-27]。

胃癌肿瘤干细胞转移性实验：制备胃癌干细胞悬液前先让细胞撤血清饥饿12-24 h，进一步去除血清的影响，取24孔板，每孔中加入含体积分数20%血清的培养基消化细胞，终止消化后进行细胞计数，将2×10⁵细胞溶液200 μL到小室内，采用棉签将内室的细胞擦去，并将小室放在甲醇溶液下固定15 min，采用PBS洗3遍，将固定的细胞放入1 mL的结晶紫染色15 min，将24孔板放入37 ℃、体积分数5%CO₂温箱内，根据细胞迁移能力，计算胃癌干细胞转移前后的透膜细胞数。

裸鼠成瘤实验：选实验中选取裸鼠(同一批)的双侧分别注射1×10⁶实验中制备的胃癌干细胞与SGC7907普通细胞(北京Solarbio公司)，培养14 d后测量肿瘤体积，第4周给予断颈处死，取出肿瘤称质量。

1.5 主要观察指标 ①胃癌干细胞形态；②细胞划痕实验结果；③胃癌干细胞成环实验；④观察细胞抑制率实验；⑤观察胃癌肿瘤干细胞转移性实验结果；⑥观察胃癌肿瘤干细胞成瘤实验结果。

1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0软件进行数据处理，计量资料采用x(_)±s表示，组间数据差异的比较采用两样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

胃癌是一种发病率较高的恶性肿瘤。近年来，对于胃癌研究虽然取得了阶段性进展，但是对于胃癌发病机制尚不完全知晓。随着肿瘤与干细胞关系研究的不断深入，越来越多的人开始认识到肿瘤属于是一种干细胞疾病，从而为胃癌的治疗奠定的了基础^[28-29]。早在2001年，相关学者对胃癌干细胞进行研究^[30-31]，并提出了血液系统肿瘤及造血干细胞研究。目前，临床上对于胃癌干细胞分离、鉴定方法较多，且肿瘤表面标志物在患者治疗预后中得到应用^[32]。

相关研究显示，肿瘤干细胞与肿瘤血管的生成关系密切，且当前对于抗肿瘤血管生成的治疗达不到预期的治疗效果^[33-34]。实验中，胃癌干细胞分离后进行培养，细胞悬浮生长，培养7 d后贴壁生长，悬浮生长细胞相对较少，多为圆形、椭圆形；对贴壁生长细胞相对较多，且缺乏规律性，细胞多为蝌蚪形。对于肿瘤细胞而言，肿瘤血管生成对于肿瘤的生长、维持等关系密切，同样也是肿瘤发生重要的环节^[35-36]。

肿瘤干细胞属于是一类特殊的细胞，该细胞在肿瘤的发生、形成中发挥重要的作用，并且能够促进肿瘤血管的形成^[37]。实验中，胃癌干细胞在划痕后0，24 h采用显微镜观察划痕的宽度，结果显示：划痕后0，24 h细胞划痕宽度差异具有显著性意义，倒置显微镜下可见胃癌干细胞位置发生率了明显的变化。

肿瘤干细胞能够促进肿瘤血管的生成，其机制如下：①肿瘤干细胞能够过量表达几种促血管生长因子，如血管生成素等，能促进血管生长因子的形成。实验调整胃癌干细胞浓度为1×10⁴个接种在96孔板中，培养24 h观察成环数量，结果显示：胃癌干细胞成熟数量为(7.20±1.47)个，通过倒置显微镜观察成环形态，成环的细胞形态缺乏规律性，分布不集中。由此看出：肿瘤干细胞的存在能进一步促进肿瘤的移植和发展^[38]。②肿瘤干细胞能够在机体相关酶的作用下分化为多种细胞，如：肿瘤血管前体细胞、内皮细胞等，这些细胞均能间接或直接参与血管的生成，参与肿瘤微循环。实验中，胃癌肿瘤干细胞穿过基底膜细胞数为(172.60±12.28)个，显著高于细胞转移前(85.20±6.57)个。

目前，临床上对于胃癌更多的以化疗等方法治疗为主，药物能有效的抑制癌细胞的扩散及转移^[39-50]。实验中，采用MTS方法检测奥沙利铂以及5-氟尿嘧啶对胃癌干细胞细胞活性的影响。实验结果显示：奥沙利铂为胃癌干细胞的半抑制浓度显著低于5-氟尿嘧啶。由此看出：5-氟尿嘧啶能抑制胃癌的转移，临床治疗效果更佳，患者治疗时可以优先考虑5-氟尿嘧啶治疗。实验结果显示，胃癌干细胞具备较强的迁移性，是胃癌侵袭性生长、浸润和转移的基础，并且细胞化疗药物的耐药性、致瘤性均相对比较强，能够参与并促进肿瘤血管的形成，从而促进胃癌的生长和转移^[40-50]。

综上所述，胃癌干细胞分离培养相对简单，且在肿瘤侵袭、转移中发挥重要的作用，具备较强的血管形成能力，促进胃癌的发生、发展，该细胞的存在可能是胃癌复发、转移以及耐药的机制之一，具有较高的临床应用价值。

胃癌干细胞在肿瘤侵袭转移及对血管形成的影响

Gastric cancer stem cells in tumor invasion and metastasis and its influence on angiogenesis ability

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[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	刘志超, 张帆, 孙旗, 康晓乐, 袁巧妹, 柳根哲, 陈江. 不同静水压下人椎间盘髓核细胞的形态和活性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1172-1176.
[4]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[5]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[6]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[7]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[8]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[9]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[10]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[11]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[12]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[13]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[14]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[15]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.