小儿骨髓间质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.32.005

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
骨髓间质干细胞诱导分化：在适当的诱导条件下，骨髓间质干细胞可分化为间充质以外细胞，该类细胞的定向性、谱系限定性及细胞分化终点从内在的基因组调节机制上来讲是多方向的，环境中的信息可诱导这类细胞表现出超越其经典分化方向的多方向分化潜能性。
微管蛋白：是球形分子，有两种类型：α微管蛋白(α-tubulin)和β微管蛋白(β-tubulin)，这两种微管蛋白具有相似的三维结构，能够紧密地结合成二聚体，作为微管组装的亚基。β微管蛋白Ⅲ是微管蛋白tubulin家族的一种微管成分，是原始神经上皮中重要的神经元标志物。

摘要
背景：以往相关报道大多为成人或者动物骨髓间质干细胞，关于儿童骨髓间质干细胞体外培养及定向分化的研究相对较少。
目的：探讨儿童骨髓间质干细胞诱导分化为神经干细胞及神经元细胞的能力。
方法：取传12代儿童骨髓间质干细胞，加入预诱导液(含体积分数为10%胎牛血清及1 mmol/L β-巯基乙醇的DMEM培养液)、诱导液(含2%二甲基亚砜及150 μmol/L丁基羟基茴香醚的DMEM培养液)进行定向诱导分化。诱导后30 min，7 d，免疫细胞化学检测神经干细胞特异性抗原nestin、神经丝蛋白β-tublin Ⅲ的表达，诱导后0，5.5，6 d，RT-PCR检测nestin mRNA 的表达。
结果与结论：①经二甲基亚砜、丁基羟基茴香醚联合诱导之后，细胞胞体逐渐收缩为锥形和多角形、类圆形，胞体伸出突起并逐渐延长为细丝状。联合诱导至第6天，相邻细胞突起发生交互，形成网状；②诱导30 min后，nestin抗原表达呈阳性，诱导7 d后，β-tublinⅢ表达呈阳性；③诱导开始时(0 h)未出现nestin mRNA表达，诱导5.5 h时nestin mRNA表达呈阳性，诱导6 d时不再表达；④结果表明，小儿骨髓间质干细胞经二甲基亚砜、丁基羟基茴香醚体外联合诱导可分化为神经干细胞与神经元细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-4014-1855(李英)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 儿童, 骨髓间质干细胞, 体外培养, 细胞诱导, 细胞分化, 神经干细胞

Abstract:

BACKGROUND: In the past, the culture and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro were mostly reported in the adult or animal rather than in children.
OBJECTIVE: To explore the ability of bone marrow mesenchymal stem cells from children differentiating into neural stem cells and nerve cells.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells from children were isolated and cultured, and passage 12 cells were cultured in the pre-induction medium (DMEM culture medium containing 10% fetal bovine serum and 1 mmol/L β-mercapto ethanol) and induction medium (DMEM containing 2% dimethyl sulfoxide and 150 μmol/L butylated hydroxyanisole). Expression of nestin and β-tublin III was detected using immunocytochemistry method at 30 minutes and 7 days after induction, while RT-PCR was used to detect nestin mRNA expression at 0, 5.5, 6 days after induction.
RESULTS AND CONCLUSION: After combined induction, the cells shrank from round shape to tapered, polygonal or oval shape, and cell processes extended gradually and became filament-like shape. Interconnected cells formed a network at 6 days after combined induction. The expression of nestin antigen was positive at 30 minutes after induction, while the expression of β-tublin was positive at 7 days. RT-PCR findings showed that positive expression of nestin mRNA was detected at 5.5 hours of induction, and then disappeared at 6 days. These findings show that the combined use of dimethyl sulfoxide and butylated hydroxyanisole can induce bone marrow mesenchymal stem cells from children to differentiate into neural stem cells and nerve cells in vitro.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Child, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Cell Differentiation, Neural Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李英，高杰，商亚敏，汪奇伟，王海磊. 小儿骨髓间质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(32): 4745-4750.

Li Ying, Gao Jie, Shang Ya-min, Wang Qi-wei, Wang Hai-lei. Neuron-like differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells from children in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(32): 4745-4750.

图/表（结果） 1

参考文献

[1] 庄琴,朱彦,陆益龙,等.成人骨髓间质干细胞向神经干细胞的诱导分化[J].江苏大学学报:医学版,2011,21(2): 93-96.
[2] 彭志强,黄天华,郭杵强,等.补肾益脑胶囊将大鼠骨髓间质干细胞诱导为神经细胞的研究[J].中医临床研究,2014, 4(12):34-36.
[3] Lange C, Schroeder J, Stute N, et al. High-potential human mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 2005; 14(1):70-80.
[4] Lee H, Kang JE, Lee JK, et al. Bone-marrow-derived mesenchymal stem cells promote proliferation and neuronal differentiation of Niemann-Pick type C mouse neural stem cells by upregulation and secretion of CCL2. Hum Gene Ther. 2013;24(7): 655-669.
[5] Chong PP, Selvaratnam L, Abbas AA, et al. Human peripheral blood derived mesenchymal stem cells demonstrate similar characteristics and chondrogenic differentiation potential to bone marrow derived mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 2012;30(4): 634-642.
[6] Karaöz E, Demircan PC, Sa?lam O, et al. Human dental pulp stem cells demonstrate better neural and epithelial stem cell properties than bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Histochem Cell Biol. 2011;136(4):455-473.
[7] 叶伟标,邓宇斌,叶美红,等.慢病毒载体介导HIF-1α基因修饰骨髓间质干细胞促进脑缺血大鼠的神经功能恢复[J].中国病理生理杂志,2010,26(2):256-261.
[8] Heo JS, Choi SM, Kim HO, et al. Neural transdifferentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells on hydrophobic polymer- modified surface and therapeutic effects in an animal model of ischemic stroke. Neuroscience. 2013;238: 305-318.
[9] Tang Y, Cui YC, Wang XJ, et al. Neural progenitor cells derived from adult bone marrow mesenchymal stem cells promote neuronal regeneration. Life Sci. 2012; 91(19-20):951-958.
[10] Liu C, Sun J. Potential application of hydrolyzed fish collagen for inducing the multidirectional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Biomacromolecules. 2014;15(1):436-443.
[11] Habisch HJ, Liebau S, Lenk T, et al. Neuroectodermally converted human mesenchymal stromal cells provide cytoprotective effects on neural stem cells and inhibit their glial differentiation. Cytotherapy. 2010;12(4):491-504.
[12] 刘振华,王世军.帕金森病模型大鼠损毁侧纹状体内移植神经干细胞的增殖与分化[J].中国组织工程研究,2015, 19(36):5843-5847.
[13] Wislet-Gendebien S, Laudet E, Neirinckx V, et al. Mesenchymal stem cells and neural crest stem cells from adult bone marrow: characterization of their surprising similarities and differences. Cell Mol Life Sci. 2012;69(15):2593-2608.
[14] Kim SJ, Lee JK, Kim JW, et al. Surface modification of polydimethylsiloxane (PDMS) induced proliferation and neural-like cells differentiation of umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells. J Mater Sci Mater Med. 2008;19(8):2953-2962.
[15] Park JE, Seo YK, Yoon HH, et al. Electromagnetic fields induce neural differentiation of human bone marrow derived mesenchymal stem cells via ROS mediated EGFR activation. Neurochem Int. 2013;62(4): 418-424.
[16] 邵景范,黎润光,魏明发,等.牵张应力对儿童骨髓间充质干细胞体外增殖与向成骨分化的影响[J].中华小儿外科杂志, 2007,28(6):305-309.
[17] 杨帆.不同年龄组食蟹猴骨髓间质干细胞增殖分化特性研究[D].广州:中山大学,2008.
[18] Wexler SA, Donaldson C, Denning-Kendall P, et al. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal 'stem' cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. Br J Haematol. 2003; 121(2):368-374.
[19] 朱灏,许建中,周强,等.人骨髓间充质干细胞体外增殖及成骨分化的增龄变化[J].第三军医大学学报,2005,27(1): 59-62.
[20] 姚璎珈,孔亮,教亚男,等.蛇床子素通过Wnt/β-catenin信号通路促进转染APP基因的神经干细胞分化为更多神经元且减少神经元凋亡[J].中国药理学通报,2015,31(11): 1516-1523.
[21] 师红,季泽娟,刘福云,等.丁羟茴醚诱导幼儿骨髓间质干细胞分化为神经细胞[J].河南医学研究,2010,19(3): 287-290.
[22] 吴中华.脑外源性神经因子基因修饰神经干细胞对脑卒中的神经保护机制[J].中国组织工程研究,2015, 19(45): 7331-7336.
[23] Cho H, Seo YK, Yoon HH, et al. Neural stimulation on human bone marrow-derived mesenchymal stem cells by extremely low frequency electromagnetic fields. Biotechnol Prog. 2012;28(5):1329-1335.
[24] Heng BC, Saxena P, Fussenegger M. Heterogeneity of baseline neural marker expression by undifferentiated mesenchymal stem cells may be correlated to donor age. J Biotechnol. 2014;174:29-33.
[25] Ayd?n A, Duruksu G, Erman G, et al. Neurogenic differentiation capacity of subacromial bursal tissue- derived stem cells. J Orthop Res. 2014;32(1):151-158.
[26] 周君梅,张胜利,陈方,等.利用人胚胎干细胞和人羊水干细胞的神经分化模型建立体外神经毒性测试的实验研究[J].临床儿科杂志,2011,29(2):101-105.
[27] Mohanty ST, Cairney CJ, Chantry AD, et al. A small molecule modulator of prion protein increases human mesenchymal stem cell lifespan, ex vivo expansion, and engraftment to bone marrow in NOD/SCID mice. Stem Cells. 2012;30(6):1134-1143.
[28] Han F, Wang CY, Yang L, et al. Contribution of murine bone marrow mesenchymal stem cells to pancreas regeneration after partial pancreatectomy in mice. Cell Biol Int. 2012;36(9):823-831.
[29] Wang N, Xu Y, Qin T, et al. Myocardin-related transcription factor-A is a key regulator in retinoic acid-induced neural-like differentiation of adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Gene. 2013; 523(2):178-186.
[30] 陈树鑫.不同年龄人群脂肪干细胞体外成脂、成骨诱导分化能力的比较[D].广州:中山大学,2009.
[31] 李恩琴.儿童急性早幼粒细胞白血病的临床及相关诱导性多能干细胞研究[D].武汉:华中科技大学,2012.
[32] Tao YX, Xu HW, Zheng QY, et al. Noggin induces human bone marrow-derived mesenchymal stem cells to differentiate into neural and photoreceptor cells. Indian J Exp Biol. 2010;48(5):444-452.
[33] Yan ZJ, Hu YQ, Zhang HT, et al. Comparison of the neural differentiation potential of human mesenchymal stem cells from amniotic fluid and adult bone marrow. Cell Mol Neurobiol. 2013;33(4):465-475.
[34] 李恩琴,金润铭.儿童白血病诱导性多能干细胞的建立与诱导造血分化[C].上海:中华医学会第十二次全国血液学学术会议论文集,2012:13.
[35] 杜喆,张伟国,陶凯,等.β-微管蛋白-Ⅲ在脊髓神经干细胞向神经元定向分化早期的动态变化研究[J].中华临床医师杂志:电子版,2009,3(10):1690-1698.
[36] 殷海斌,田新,杨春会,等.间充质干细胞的生物学特性及临床应用[J].中国组织工程研究,2014,18(14):2282-2289.
[37] Datta I, Mishra S, Mohanty L, et al. Neuronal plasticity of human Wharton's jelly mesenchymal stromal cells to the dopaminergic cell type compared with human bone marrow mesenchymal stromal cells. Cytotherapy. 2011; 13(8):918-932.
[38] Harris VK, Yan QJ, Vyshkina T, et al. Clinical and pathological effects of intrathecal injection of mesenchymal stem cell-derived neural progenitors in an experimental model of multiple sclerosis. J Neurol Sci. 2012;313(1-2):167-177.
[39] 袁斯明,王修坤,陈荣亮,等.婴幼儿血管瘤来源的间充质干细胞的体外多向分化实验[J].中国美容整形外科杂志, 2012,23(3):144-146.
[40] 孙客,王国兵,祖莹,等.不同年龄儿童骨髓间充质干细胞自体血清体外培养及成骨分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(40):7425-7429.

引言

材料方法

1.1 设计 体外观察性实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年9至12月在河南大学淮河医院实验室完成。

1.3 材料 5例外伤手术儿童骨髓，男2例，女3例，年龄5-12岁，中位年龄8.1岁，均为河南大学淮河医院标本室提供，患儿家长均知情，并签署同意书。研究相关方案均提交河南大学淮河医院医学伦理部门审核，符合相关伦理学要求。

1.4 实验方法

1.4.1 人骨髓间质干细胞分离培养^[5] 取5 mL骨髓标本与肝素进行混合，添加等量PBS混匀，加入等量Percoll分离液，离心30 min，收集中间单个核细胞层，再次离心后去掉上清液，添加含胎牛血清的低糖DMEM培养液接种在培养皿中，置于37 ℃二氧化碳培养箱中进行培养，每日置于倒置显微镜下观察细胞生长情况，待细胞融合达到80%以上进行传代培养。

1.4.2 人骨髓间质干细胞表面标记物测定^[6] 取生长状态良好的第3代人骨髓间质干细胞，待细胞接近80%融合时，加入胰蛋白酶消化，获得单细胞悬液。取1×10⁶细胞利用流式细胞仪检测细胞表型。

1.4.3 人骨髓间质干细胞生长曲线 取第5代人骨髓间质干细胞接种于24孔板中，每孔1 mL，每3 d换液1次，每天取3孔进行细胞计数，连续观察8 d，以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，描绘细胞生长曲线。

1.4.4 联合诱导分化^[7] 将传12代的人骨髓间质干细胞接种于含体积分数为10%胎牛血清、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM培养液，培养24 h，吸出培养液，加入预诱导液(含体积分数为20%胎牛血清及1 mmol/L β-巯基乙醇的DMEM培养液)，培养24 h，吸出预诱导液，最后加入诱导液(含2%二甲基亚砜及 150 μmol/L丁基羟基茴香醚的DMEM培养液)，在倒置相差显微镜下观察细胞形态。

1.4.5 免疫细胞化学检测 联合诱导后30 min，7 d，取生长有细胞的盖玻片，用40 g/L多聚甲醛固定，进行nestin、β-tublinⅢ免疫组化检测，严格按照试剂盒说明书进行操作，一抗4 ℃湿盒过夜，添加二抗及三抗室温条件下各孵育1 h后，DAB显色，中性树胶封固。

1.4.6 RT-PCR检测nestin mRNA表达^[8] 取诱导后0，5.5，6 d的细胞，提取总mRNA进行反转录及PCR扩增，nestin的上下游引物分别为CTC TGA CCT GTC AGA AGA AT和GAC GCT GAC ACT TAC AGA AT，其产物大小为245 bp，1.5%琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像系统对检测结果进行记录。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间质干细胞的形态；②诱导后神经丝蛋白β-tublinⅢ和神经干细胞特异性抗原nestin的表达；③nestin mRNA的表达。

讨论

脑卒中、脑创伤等神经系统疾病导致脑组织损伤及变性，具有高发病率、高患病率、高致残率的特点^[9]。如何促进脑组织的修复和功能重建，一直是神经再生医学关注的重点。随着干细胞理论和技术的不断发展，临床开始积极利用不同类型干细胞进行修复治疗^[10]。

干细胞具有很强的分化潜能，脑损伤后，新生神经干细胞的存活能力和形成成熟神经细胞的能力都非常有限，且神经干细胞移植到脑内，其迁移、分化和整合到正常的神经元网络中也十分困难^[11-14]。间质干细胞属于来源于中胚层的早期细胞，在一定条件下，可分化为多种中胚层和神经外胚层来源的细胞^[15]。间质干细胞的来源十分广泛，包括骨髓、脂肪组织和脐血等，其中骨髓来源间质干细胞具有取材方便等优点，临床应用较多，可被广泛应用于对各种神经系统疾病的修复治疗。

不同年龄骨髓间质干细胞体外增殖、分化特点有很大差异^[16]。随着年龄的不断增长，骨髓间质干细胞的增殖分化能力会不断下降^[17-18]。朱灏等^[19]利用密度梯度离心法分离不同年龄的人骨髓间充质干细胞，并通过检测细胞增殖活性和细胞周期等，发现与高龄人骨髓间充质干细胞比较，低龄人骨髓间充质干细胞在体外环境下的生长速度更快、增殖期比例更大，且成骨分化能力也相对较高。

神经干细胞广泛存在于成年或胚胎哺乳动物大脑内，可以在一定条件下分化为不同类型的细胞，包括少突胶质细胞和星形胶质细胞以及神经元细胞等^[20-23]。以往的骨髓间质干细胞培养分化相关报道大多为成人或者动物骨髓间质干细胞，关于儿童骨髓间质干细胞体外培养及定向分化等研究相对较少^[24-27]。骨髓间质干细胞在适当的诱导条件作用下(包括诱导剂和环境等因素)可分化为间充质以外细胞，尤其是神经细胞，该类细胞的定向性、谱系限定性及细胞分化终点从内在的基因组调节机制上来讲是多方向的，环境中的信息可诱导这类细胞表现出超越其经典分化方向的多方向分化潜能性。体外诱导骨髓间质干细胞分化的试剂有维甲酸、生长因子、抗氧化剂、脱甲基试剂、可增加细胞内cAMP的神经诱导剂及头蛋白。此次研究选择体外培养小儿骨髓间质干细胞，并利用二甲基亚砜及丁基羟基茴香醚进行联合诱导。实验以神经巢蛋白(Nestin)和β-微管蛋白(β-tubulin)为标志物，其中Nestin主要存在于神经上皮干细胞中，是一种特殊的中间丝蛋白，具有一定的特异性，可作为神经干细胞的标志性蛋白之一^[28-29]。β-微管蛋白(β-tubulin)是一种重要的细胞骨架蛋白，会对细胞的分化产生十分重要的影响^[30-34]。神经细胞中的微管蛋白，卷成一个个“微管”，形成细胞骨架，加入神经细胞迁移活动。以往有学者报道，β-微管蛋白会参与打破脊髓神经干细胞的定向分化过程，对细胞向神经元分化的过程产生影响^[35]。β-微管蛋白Ⅲ是微管蛋白tubulin家族的一种微管成分，是原始神经上皮中重要的神经元标志物^[36-40]。实验结果显示，联合诱导30 min后，nestin抗原表达呈阳性，联合诱导7 d后，β-tublinⅢ表达呈阳性。RT-PCR检测联合诱导开始时(0 h)未出现nestin mRNA表达，诱导5.5 h时nestin mRNA表达呈阳性，诱导6 d时不再表达，整个变化过程与神经细胞的发育成熟过程基本一致。

综上所述，在一定的体外条件下对小儿骨髓间质干细胞进行二甲基亚砜及丁基羟基茴香醚联合定向诱导，可促使其分化为神经干细胞以及神经元细胞，为儿科神经缺损疾病的治疗提供一定的参考。