间充质干细胞条件培养液对正常成纤维细胞及瘢痕成纤维细胞转化生长因子β产生和信号通路的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.29.013

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (29): 4349-4354.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.29.013

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间充质干细胞条件培养液对正常成纤维细胞及瘢痕成纤维细胞转化生长因子β产生和信号通路的影响

武艳1，袁晓环1，杨岚2，赵孝金1，李厚忠3，王莹4，金红5

牡丹江医学院，1医药研究中心，3病理学教研室，4解剖学教研室，黑龙江省牡丹江市 157011；牡丹江医学院红旗医院，2眼科，5检验科，黑龙江省牡丹江市 157011

收稿日期:2016-04-29 出版日期:2016-07-08 发布日期:2016-07-08
通讯作者: 金红，博士，副教授，牡丹江医学院红旗医院检验科，黑龙江省牡丹江市 157011
作者简介:武艳，女，1982年生，黑龙江省牡丹江市人，汉族，博士，讲师，主要从事组织损伤与修复方面的研究。
基金资助:
黑龙江省普通本科高等学校青年创新人才培养计划(UNPYSCT-2015109)

Effects of mesenchymal stem cells conditioned media on the transforming growth factor-beta signaling pathway in normal and hypertrophic scar fibroblasts

Wu Yan1, Yuan Xiao-huan1, Yang Lan2, Zhao Xiao-jin1, Li Hou-zhong3, Wang Ying4, Jin Hong5

1Medical Research Center, 3Department of Pathology, 4Department of Anatomy, Mudanjiang Medical College, Mudanjiang 157011, Heilongjiang Province, China; 2Department of Ophthalmology, 5Clinical Laboratory, Hongqi Hospital, Mudanjiang Medical College, Mudanjiang 157011, Heilongjiang Province, China

Received:2016-04-29 Online:2016-07-08 Published:2016-07-08
Contact: Jin Hong, M.D., Associate professor, Clinical Laboratory, Hongqi Hospital, Mudanjiang Medical College, Mudanjiang 157011, Heilongjiang Province, China
About author:Wu Yan, M.D., Lecturer, Medical Research Center, Mudanjiang Medical College, Mudanjiang 157011, Heilongjiang Province, China
Supported by:
Cultivation Program of Youth Innovative Talents in Heilongjiang Province Common University Undergraduate, No. UNPYSCT-2015109

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
转化生长因子β：是导致组织纤维化的重要因子，它可诱导细胞外基质堆积和胶原沉积，其主要机制：①转化生长因子β作用于胶原的转录和翻译过程，能诱导前胶原mRNA形成，从而促进胶原蛋白的沉积；②转化生长因子β可减少蛋白水解酶，并抑制其活性；③转化生长因子β促使成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化；④转化生长因子β也能促进成纤维细胞自身合成转化生长因子β。
间充质干细胞治疗皮肤创伤：间充质干细胞对于皮肤在创伤愈合过程中发挥其治疗作用，主要通过转分化为皮肤细胞、分泌生物活性因子、发挥免疫调节以及促进上皮和血管生成等，近年来研究人员对于间充质干细胞的作用机制逐渐转向其旁分泌作用。

摘要
背景：已有文献报道，间充质干细胞可通过分泌大量生物活性因子有效减轻损伤的心脏、肺脏、肾脏等器官纤维化的发生。
目的：观察骨髓间充质干细胞条件培养液对正常成纤维细胞和瘢痕成纤维细胞的影响及作用机制。
方法：制备骨髓间充质干细胞条件培养液，将其作用于正常成纤维细胞和增生性瘢痕成纤维细胞，采用ELISA检测转化生长因子β的分泌水平，RT-PCR检测TGF-β/Smad信号通路相关基因Smad7的表达，比色法检测各组细胞上清液中羟脯氨酸的含量。
结果与结论：①骨髓间充质干细胞条件培养液对增生性瘢痕成纤维细胞转化生长因子β的分泌、胶原的合成有显著抑制作用(P < 0.01)，并且明显增强Smad7基因的表达(P < 0.01)；②骨髓间充质干细胞条件培养液对正常成纤维细胞的影响较小；③结果表明，骨髓间充质干细胞条件培养液对增生性瘢痕成纤维细胞具有显著抑制作用，为干细胞防治皮肤瘢痕提供基础理论支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-9094-4184(金红)

关键词: 组织构建, 组织工程, 干细胞, 间质干细胞, 瘢痕, 成纤维细胞, 胶原, 细胞增殖, 羟脯氨酸

Abstract:

BACKGROUND: Numerous studies have shown that mesenchymal stem cells (MSCs) can effectively attenuate the fibrosis of damaged heart, lung and kidney by secreting various bioactive factors.
OBJECTIVE: To evaluate the anti-fibrotic therapeutic potential of bone marrow MSCs conditioned media in vitro.
METHODS: Normal fibroblasts and hypertrophic scar fibroblasts were treated with bone marrow MSCs conditioned media, then transforming growth factor-β and collagen production were analyzed by ELISA, and mRNA expression level of Smad7 and hydroxyproline content were detected by RT-PCR and colorimetry, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow MSCs conditioned media significantly inhibited the production of both transforming growth factor-β and collagen in hypertrophic scar fibroblasts (P < 0. 01), and up-regulated the mRNA expression level of Smad7 (P < 0. 01), a major inhibitory regulator in the SMAD family. However, the normal fibroblasts were scarcely influenced by bone marrow MSCs conditioned media. These findings indicate that bone marrow MSCs conditioned media is considered a promising candidate for the treatment of hypertrophic scars, which may provide new theoretical supports to reduce cutaneous scarring.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Mesenchymal Stem Cells, Cicatrix, Fibroblasts, Collagen, Cell Proliferation

中图分类号:

R318

武艳，袁晓环，杨岚，赵孝金，李厚忠，王莹，金红. 间充质干细胞条件培养液对正常成纤维细胞及瘢痕成纤维细胞转化生长因子β产生和信号通路的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(29): 4349-4354.

Wu Yan, Yuan Xiao-huan, Yang Lan, Zhao Xiao-jin, Li Hou-zhong, Wang Ying, Jin Hong. Effects of mesenchymal stem cells conditioned media on the transforming growth factor-beta signaling pathway in normal and hypertrophic scar fibroblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(29): 4349-4354.

图/表（结果） 1

2.1 骨髓间充质干细胞条件培养液对两种成纤维细胞形态学的影响将骨髓间充质干细胞条件培养液作为刺激因子孵育正常成纤维细胞和增生性瘢痕成纤维细胞，对照A组的正常成纤维细胞伸展良好，呈放射状，加入骨髓间充质干细胞条件培养液后，正常成纤维细胞组的细胞形态变化不明显。对照B组的增生性瘢痕成纤维细胞呈典型长梭形，并且胞体较大，胞浆丰富，呈放

射状或漩涡状生长，而增生性瘢痕成纤维细胞组与对照B组相比较，细胞数目明显减少，突起变短，排列显混乱，折光性较弱，见图1。

2.2 骨髓间充质干细胞条件培养液对两种成纤维细胞分泌转化生长因子β的影响对照A组和正常成纤维细胞组相比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，骨髓间充质干细胞条件培养液不影响正常成纤维细胞分泌转化生长因子β；而对照B组和增生性瘢痕成纤维细胞组相比较，骨髓间充质干细胞条件培养液可以明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞中转化生长因子β的产生，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图2。

2.3 骨髓间充质干细胞条件培养液对两种成纤维细胞TGF-β/Smad信号通路中Smad7表达的影响在分组后继续培养24 h，通过RT-PCR法检测各组细胞TGF-β/Smad信号通路中Smad7的表达，结果发现，对照A组与对照B组Smad7的表达几乎是相同的，而正常成纤维细胞中加入骨髓间充质干细胞条件培养液后Smad7的表达变化不显著，但骨髓间充质干细胞条件培养液却可以明显促进增生性瘢痕成纤维细胞TGF-β/Smad信号通路中Smad7的表达，见图3。

2.4 骨髓间充质干细胞条件培养液对两种成纤维细胞胶原合成的影响增生性瘢痕成纤维细胞组细胞胶原合成明显低于对照B组，而骨髓间充质干细胞条件培养液对于正常成纤维细胞胶原合成作用不明显，见图4。

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引言

皮肤瘢痕的形成是创伤修复过程中的必然产物，是创伤或病理性损伤比较常见但不理想的组织修复结果^[1]。当皮肤真皮层受到较严重损伤时，愈合过程中一般均会伴有瘢痕形成，包括生理性和病理性两种类型，可以说适度的瘢痕形成是一种生理性和自卫性表现，但过度修复增生则属病理性改变。尽管目前医学发展十分迅速，但由于病理性皮肤瘢痕形成机制非常复杂^[2-3]，其发生机制至今还未明确，因此对于病理性瘢痕治疗尚没有一种理想的方法。

随着对干细胞认识的深入及相关技术的发展和应用，越来越多的人会意识到其潜在的应用价值，也为解决这一临床难题带来了希望。间充质干细胞是干细胞家族中重要的成员之一，具有来源广泛、取材方便、增殖能力强以及低免疫原性等优势^[4]。目前已有相关研究证实，间充质干细胞可通过多种调节机制包括免疫调节、分泌生物活性因子、转分化为皮肤细胞以及促进上皮和血管生成等在创伤愈合过程中发挥其治疗作用^[5-7]。大多研究学者认为，间充质干细胞在此过程中主要是通过分泌各种生物活性因子而发挥作用，并且在作者的前期工作中发现间充质干细胞具有抑制小鼠皮肤瘢痕形成的作用^[8]，但其作用机制研究不多。皮肤瘢痕形成的最主要原因是成纤维细胞的过度增殖，间充质干细胞分泌的生物活性因子是否可以抑制瘢痕成纤维细胞增殖，从而对皮肤瘢痕发挥修复作用至今尚无明确的研究报道。为此，实验拟将骨髓间充质干细胞条件培养液作用于正常成纤维细胞和增生性瘢痕成纤维细胞，检测其转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)的分泌、胶原合成及TGF-β/Smad信号通路中Smad7的变化，为治疗皮肤瘢痕提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

设计体外细胞学观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015年3至11月在牡丹江医学院医药研究中心完成。

1.3 材料牡丹江医学院红旗医院6例同期住院患者手术切除的增生性瘢痕组织(未接受任何药物治疗)，其中男3例，女3例，年龄18-53岁，经病理组织学检查确诊。6例同期外科手术患者的正常皮肤，其中男3例，女3例，年龄18-53岁。非血液系统疾病成人患者行髂骨骨髓穿刺检查抽取骨髓。取材均得到患者的知情同意，并经医院伦理委员会批准。

骨髓间充质干细胞条件培养液干预成纤维细胞实验所用主要试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
DMEM、青链霉素混合液、胎牛血清、胰蛋白酶	美国Gibco公司
Trizol、反转录试剂盒	美国Invitrogen公司
TGF-β ELISA试剂盒	上海常斤生物科技有限公司
CO₂恒温培养箱、倒置相差显微镜	日本Olympus公司
PCR仪	德国Eppendorf公司
酶标仪	美国Bio-Rad公司
分光光度计	美国Beckman公司

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养

成纤维细胞培养^[3]：取两种皮肤组织，去掉表皮，切成1 mm³左右的小块，置于培养皿，待组织贴壁后，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM完全培养液(100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)，置37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养，每2 d或3 d更换培养液1次，细胞达80%-90%融合后传代。实验所用细胞为第3-5代细胞。

骨髓间充质干细胞培养^[4]：无菌条件下穿刺人髂后上嵴，抽取骨髓3 mL，制成单细胞悬液，接种于DMEM培养液中(含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素)，置37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养，24 h后换液，弃去悬浮细胞，此后每2 d或3 d换液1次，细胞达80%-90%融合后传代，实验所用细胞为第3-5代细胞。

1.4.2 骨髓间充质干细胞条件培养液的收集选取对数生长期骨髓间充质干细胞，接种于12孔板(1×10⁵/孔)，加入1 mL无血清DMEM培养液培养48 h收集上清， 0.22 μm滤膜过滤，即得到骨髓间充质干细胞条件培养液，-20 ℃保存。

1.4.3 实验分组将瘢痕成纤维细胞和正常成纤维细胞接种于6孔板，每孔1 mL(1×10⁸ L^-1)，无血清培养24 h后，并进行分组，每组6孔。①对照A组：无血清培养的正常成纤维细胞；②对照B组：无血清培养的增生性瘢痕成纤维细胞；③正常成纤维细胞组：加入骨髓间充质干细胞条件培养液培养的正常成纤维细胞；④增生性瘢痕成纤维细胞组：加入骨髓间充质干细胞条件培养液培养的增生性瘢痕成纤维细胞。各组继续培养24 h，于倒置显微镜下观察、照相。

1.4.4 ELISA检测两种成纤维细胞分泌的转化生长因子β水平按照说明书进行检测。在波长450 nm的酶标仪上读取各孔吸光度值；以吸光度值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图；根据样品的吸光度值查找对应的浓度范围，敏感度为1.0 ng/L。

1.4.5 RT-PCR检测两种成纤维细胞中Smad7表达引物序列如下：Smad7：正义5’-AGC ACA CCA GCT CGG GGT TGA T -3’，反义5’-AAC GAT CTG CGC TCG TCC GGC G-3’；β-actin：正义5’-CAC CAA CTG GGA CGA CA-3’，反义5’-GTA CTT GCG CTC AGG AGG-3’。PCR检测体系：上、下游引物各0.5 μL(25 μmol/L)、dNTP 1.0 μL(10 mmol/L)、Taq酶0.5 μL(2 U/μL)、基因组DNA溶液1 μL、10×Buffer(含MgCl₂)2.5 μL，共计25 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃ 50 s、50 ℃ 50 s、72 ℃ 60 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min，计算各组Smad7相对表达量。

1.4.6 胶原合成检测将细胞接种于96孔板，细胞浓度为1×10⁸ L^-1，每孔0.2 mL，置于37 ℃，体积分数为5% CO₂孵箱中培养12 h，更换无血清培养基，培养24 h。按分组进行干预，每组5个复孔，继续培养24 h，每孔取上清液50 μL，100 ℃烤干，加入4 mol/L NaOH，120 ℃、10 min，再加入氯铵T、高氯酸溶液，于65-70 ℃显色约15 min，用Beckman DU-600分光光度计比色，检测吸光度值，波长为550 nm。

1.5 主要观察指标 ①各组成纤维细胞的形态；②条件培养液干预下各组成纤维细胞转化生长因子β水平、Smad7相对表达量、胶原合成情况。

1.6 统计学分析采用GraphPad Prism5软件进行统计学分析。实验计量资料以x(_)±s表示，组间均数差异比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

目前的研究发现，细胞因子在皮肤创伤修复以及瘢痕形成中起着重要作用，多种细胞因子都参与其创伤愈合，其中转化生长因子β研究较多，是目前己知的与创伤愈合、瘢痕形成关系最为密切、最具代表性的细胞因子^[9-10]。它在皮肤损伤修复过程中通过特定的细胞信号转导途径，调节相应靶基因的表达，进而发挥多样化的生物学效应，促进损伤修复或导致病理性瘢痕的形成。转化生长因子β过表达使得皮肤创伤愈合过程中修复过度形成瘢痕，病理上表现为成纤维细胞的过度生长以及包括胶原在内的细胞外基质的过度沉积^[11-13]。鉴于转化生长因子β在皮肤纤维化发展中的重要作用，实验选用骨髓间充质干细胞条件培养液作用于成纤维细胞，检测其抗皮肤瘢痕增生的疗效并探索相关机制。

在作者之前的研究中发现骨髓间充质干细胞培养48 h后收集的上清液中的生长因子浓度较高^[14-15]，故此研究将培养48 h收集的骨髓间充质干细胞条件培养液作用于来源于正常皮肤和病理性瘢痕的成纤维细胞，结果显示，骨髓间充质干细胞条件培养液对正常成纤维细胞的增殖影响不大，但能显著抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖。骨髓间充质干细胞条件培养液对不同来源成纤维细胞的增殖影响不同，可能原因是不同细胞对于骨髓间充质干细胞条件培养液中所包含细胞因子的反应不同所造成的^[16-18]。

TGF-β/Smad信号通路在皮肤创伤修复中起到了重要的作用^[19-21]，此研究检测了骨髓间充质干细胞条件培养液对两种成纤维细胞转化生长因子β的生成以及TGF-β/Smad信号通路中Smad7表达的影响。结果显示，骨髓间充质干细胞条件培养液显著抑制了增生性瘢痕成纤维细胞转化生长因子β的生成，而对于正常来源的成纤维细胞则影响不大。需要注意的是，在各组中检测到的转化生长因子β水平不仅仅来源于成纤维细胞，有研究表明骨髓间充质干细胞也可以生成转化生长因子β，因此还有一部分来源于骨髓间充质干细胞条件培养液，但各组骨髓间充质干细胞条件培养液中的含量大致相同，故没有将各组来源于骨髓间充质干细胞条件培养液的转化生长因子β去除。Smad7是TGF-β/Smad信号通路中一个关键的抑制性蛋白，对转化生长因子β超家族成员信号传递起负调控作用。此研究发现，骨髓间充质干细胞条件培养液能够促进Smad7在转录水平的表达。近来研究发现，Smad7在瘢痕中低表达，与瘢痕的形成密切相关^[22-24]，Smad7的表达被提高，则可有效对转化生长因子β信号通路产生抑制作用。另外，转化生长因子β信号通路变化与胶原生成息息相关，转化生长因子β过表达可引起细胞外基质沉积包括胶原的合成^[25-26]。对羟脯氨酸的检测可在一定程度上揭示胶原的含量改变^[27]，实验结果显示羟脯氨酸的含量明显下降，证实了骨髓间充质干细胞条件培养液可显著抑制增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成。从研究结果看，转化生长因子β的变化使转化生长因子β信号通路改变包括Smad7，可能使得瘢痕来源的成纤维细胞增殖抑制，也使得胶原生成较少，从而可达到抑制瘢痕形成的目的。

综上所述，骨髓间充质干细胞条件培养液中的生物活性因子可以通过抑制转化生长因子β的生成、促进Smad7的表达，从而抑制瘢痕成纤维细胞的增殖及其胶原的产生，但对正常来源的成纤维细胞影响不大。因此利用骨髓间充质干细胞条件培养液改变细胞外基质的构成，促进创面愈合并且抑制瘢痕形成是可行的，有利于预防皮肤瘢痕形成。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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