诱导型多能干细胞体外向胰岛素分泌细胞分化及对血糖的调控

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.016

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (28): 4210-4217.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.016

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

诱导型多能干细胞体外向胰岛素分泌细胞分化及对血糖的调控

雷蕾，梁英子，苏映军，马显杰，崔鑫，郭树忠

解放军第四军医大学第一附属医院整形外科，陕西省西安市 710032

修回日期:2016-05-18 出版日期:2016-07-01 发布日期:2016-07-01
通讯作者: 苏映军，博士，副教授，解放军第四军医大学第一附属医院整形外科，陕西省西安市 710032 并列通讯作者：郭树忠，博士，教授，主任医师，解放军第四军医大学第一附属医院整形外科，陕西省西安市 710032
作者简介:雷蕾，女，1983年生，陕西省西安市人，汉族，2013年西北农林科技大学毕业，博士，研究实习员，主要从事胚胎干细胞和诱导型多能干细胞的培养及定向诱导分化研究。并列第一作者：梁英子，女，1988年生，陕西省咸阳市人，汉族，2013年中国科学院武汉病毒研究所毕业，硕士，研究实习员，主要从事胰岛移植研究。
基金资助:
西京医院转化医学研究项目(XJZT13z03)

Insulin-secreting cells from induced pluripotent stem cells regulate blood glucose levels in vitro

Lei Lei, Liang Ying-zi, Su Ying-jun, Ma Xian-jie, Cui Xin, Guo Shu-zhong

Department of Plastic Surgery, First Affiliated Hospital of the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China

Revised:2016-05-18 Online:2016-07-01 Published:2016-07-01
Contact: Su Ying-jun, M.D., Associate professor, Department of Plastic Surgery, First Affiliated Hospital of the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China; Guo Shu-zhong, M.D., Professor, Chief physician, Department of Plastic Surgery, First Affiliated Hospital of the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
About author:Lei Lei, M.D., Research assistant, Department of Plastic Surgery, First Affiliated Hospital of the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China Liang Ying-zi, Master, Research assistant, Department of Plastic Surgery, First Affiliated Hospital of the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China Lei Lei and Liang Ying-zi contributed equally to this work.
Supported by:
the Research Project of Translational Medicine in Xijing Hospital, No. XJZT13z03

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
诱导性多能干细胞：日本京都大学Yamanaka研究小组在2006年筛选出了4个多能性转录因子(Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc，OSKM)，将这些转录因子利用反转录病毒载体转染到小鼠成纤维细胞中，使成体细胞重编程为多能干细胞，并将其定义为诱导性多能干细胞。随后，Thomson实验室选用筛选出的另外4种因子(Oct4/Sox2/Nanog/Lin28，OSNL)建立了人类的诱导性多能干细胞。诱导性多能干细胞已经在体外被分化为原始生殖细胞、肝细胞等用于细胞治疗的种子细胞，并且通过与不同材料结合，培育出具有功能的心脏组织、软骨组织、血管网等。
胰岛β细胞：是胰岛细胞的一种，属内分泌细胞，约占胰岛细胞总数的70%，主要位于胰岛中央部，能分泌胰岛素，起调节血糖含量的作用。胰岛β细胞功能受损，胰岛素分泌绝对或相对不足，从而引发糖尿病。

摘要
背景：诱导小鼠多潜能性干细胞定向分化为胰岛素分泌细胞能有效改善糖尿病小鼠血糖水平。
目的：在体外将诱导型多能干细胞定向分化的胰岛样细胞团进行相关分子及蛋白水平检测，并观察其在体外和体内胰岛素分泌情况。
方法：将体外培养的小鼠诱导型多能干细胞采用联合诱导剂分3个阶段对其进行诱导分化，并对每个诱导阶段形成的内胚层细胞、胰岛前体细胞和成熟胰岛细胞进行形态学观察和PCR检测相关基因的表达水平。对成熟的胰岛样细胞团进行双硫腙染色，ELISA检测体外释放胰岛素功能。将获得的胰岛素分泌细胞移植到糖尿病小鼠肾包膜下，观察其血糖水平变化。
结果与结论：①体外成功获得的小鼠胰岛样细胞团，其结构呈球形，双硫腙染色呈铁红色，PCR检测到在mRNA水平上表达胰岛素基因；②ELISA检测到胰岛样细胞团在受到葡萄糖刺激时能够分泌胰岛素；③通过肾包膜方法将细胞团移植到1型糖尿病小鼠体内，对小鼠高血糖有明显的调控作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-4594-0237(雷蕾)

关键词: 干细胞, 分化, 多潜能干细胞, 定向诱导分化, 胰岛样细胞团, 1型糖尿病, 胰岛素, 内胚层细胞, 胰岛前体细胞, 成熟胰岛细胞, 肾包膜移植, 血糖水平

Abstract:

BACKGROUND: Mouse pluripotent stem cells are induced to differentiate into insulin-secreting cells that can effectively improve blood glucose levels in diabetic mice.
OBJECTIVE: To detect mRNA and protein levels of insulin-like cell clusters from induced pluripotent stem cells and to investigate the function of insulin-secreting cells in vitro and in vivo.
METHODS: Mouse induced pluripotent stem cells cultured in vitro were induced to differentiate into insulin-secreting cells using combined inducers through three stages. The morphology of endodermal cells, islet-derived progenitor cells and mature islet cells in each stage was observed and relative gene expression levels were detected by PCR. Mature insulin-like cell clusters underwent dithizone staining and functions of insulin released in vitro were observed by ELISA assay. Finally, the insulin-secreting cells were transplanted into the subrenal capsule of diabetic mice, and then blood glucose levels were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: The mature spherical insulin-like cell clusters were successfully obtained in vitro, which were in iron red by dithizone staining, and expression of insulin mRNA was determined by PCR. The insulin-like cell clusters could secrete insulin in response to various blood glucose levels by ELISA assay. In addition, after the cells clusters were transplanted into the subrenal capsule of mice with type 1 diabetes, the blood glucose levels were marbedly improved.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Pluripotent Stem Cells, Diabetes Mellitus, Type 1, Insulin-Secreting Cells, Cell Differentiation, Blood Glucose, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

雷蕾，梁英子，苏映军，马显杰，崔鑫，郭树忠. 诱导型多能干细胞体外向胰岛素分泌细胞分化及对血糖的调控[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(28): 4210-4217.

Lei Lei, Liang Ying-zi, Su Ying-jun, Ma Xian-jie, Cui Xin, Guo Shu-zhong . Insulin-secreting cells from induced pluripotent stem cells regulate blood glucose levels in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(28): 4210-4217.

图/表（结果） 2

2.1 诱导型多能干细胞的鉴定 具有多能性的诱导型多能干细胞贴壁后呈克隆样生长，碱性磷酸酶染色呈红紫色，而分化的细胞和饲养层细胞不能着色(图2)。结果表明实验中所使用的诱导型多能干细胞具有多能性。

2.2 定向诱导分化为胰岛分泌细胞的形态 诱导型多能干细胞在生长培养基中能够维持其多能性和自我更新的能力，在加入特定的生长因子后，诱导型多能干细胞启动向相应方向分化的过程。在第一阶段诱导分化后，呈集落样生长的细胞形态开始发生改变，细胞克隆的表面开始由光滑变得毛糙，紧凑的细胞间距变得疏松，多数细胞开始向周围分散(图3A)。随后，加入第二阶段诱导分化的培养基，未分化为内胚层的细胞脱落，分化为内胚层的细胞成簇，此阶段的细胞生长减缓(图3B)。最后，在分化为胰岛前体细胞中加入第三阶段的诱导分化培养基，使其进一步分化为成熟的胰岛细胞，细胞呈球形聚集，聚集的细胞排列紧密，细胞体积较小(图3C)。

2.3 诱导分化的胰岛素分泌细胞功能基因的检测结果分析 诱导后的细胞逐渐表达内胚层标志基因Sox 17和Fox2A的mRNA、胰岛前体细胞标志基因NeuroD1、NGN3和Sox9的mRNA以及成熟胰岛细胞标志基因Insulin、ISL、Glu2和GCG的mRNA(图4)。对诱导21 d的细胞团进行双硫腙染色，细胞团呈猩红色，表明诱导分化的胰岛样细胞团具有与正常胰岛相似的特性。

2.4 体外胰岛素分泌的检测结果 为了验证诱导型多能干细胞来源的胰岛素分泌细胞是否具有分泌胰岛素的功能。在体外分别用低浓度和高浓度的葡萄糖刺激诱导的胰岛素分泌细胞1 h，用ELISA法测定胰岛素分泌量(图5)。

2.5 糖尿病小鼠肾包膜移植诱导的胰岛素分泌细胞后随机血糖检测结果 根据随机血糖检测结果，糖尿病小鼠肾包膜下移植诱导的胰岛素分泌细胞，小鼠的高血糖症状得到明显改善，并且维持接近正常的血糖水平达3周。未进行移植的糖尿病小鼠血糖在整个实验期间一直维持在高血糖水平(图6)。
2.6 糖尿病小鼠肾包膜下移植物组织学观察 见图7。诱导的胰岛素分泌细胞移植3周后取材，对移植物样本进行胰岛素免疫荧光染色，镜下观察显示类似胰岛样细胞分布于肾包膜下，并表达绿色荧光(胰岛素)，表明诱导的胰岛素分泌细胞具有胰岛β细胞分泌胰岛素的功能(图7C)。另外对移植诱导后的胰岛素分泌细胞的糖尿病小鼠胰腺进行苏木精-伊红染色，观察显示糖尿病小鼠在移植实验期间并无胰岛细胞再生现象(图7B)，这表明移植组糖尿病小鼠血糖水平降低是由于诱导分化的胰岛素分泌细胞植入所致，而并非自身胰岛细胞的恢复。

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引言

糖尿病是一种由多因素引起的复杂的代谢性疾病，根据其发病机制不同可分为1型糖尿病和2型糖尿病。1型糖尿病是由自身免疫系统破坏机体胰腺组织β细胞引起的，虽然移植胰腺组织或胰岛细胞能有效降低血糖水平和改善糖尿病症状，但存在供者数量缺乏和移植后免疫排斥等问题^[1]。因此，在治疗1型糖尿病的临床需求中寻找一种功能、数量都与正常β细胞相匹配的替代细胞是亟待解决的问题^[2-3]。

近年来，干细胞治疗1型糖尿病成为了新的研究热点。间充质干细胞具有自我更新和分化为三胚层细胞的能力，不仅能分化为β细胞，还能改善β细胞生存微环境，修复受损胰腺，但是对于其跨胚层分化仍有争议，而且体外分离和扩增、细胞表面特异性标志以及诱导分化的调控机制和分化后的细胞在体内的功能维持时间还不确定。胰腺干细胞是胚胎发育中没有进行终末分化的细胞，能分化为各种胰腺细胞，成为糖尿病治疗的重要干细胞来源，但是它没有明确的表面标志，不宜采集纯化。现已从胰管中分离获得胰腺干细胞，但由于细胞数量少、取材困难，用于临床的难度较大。胚胎干细胞具有无限增殖能力和多向分化潜能等特点，研究者尝试将胚胎干细胞诱导为能分泌胰岛素的细胞，并且获得成功，这使胚胎干细胞成为潜在的胰岛替代细胞来源^[4-7]。然而目前胚胎干细胞在临床上的应用受到伦理道德限制，这使得诱导型多能干细胞(iPSCs)成为能无限提供分泌胰岛素细胞来源的种子细胞。最新研究表明诱导型多能干细胞不仅能够为患者生成特异性的细胞类型，而且为疾病治疗、药物筛选和再生性医学等创新开辟了新的途径^[8-9]。

到目前为止，有许多研究试图用阶梯式诱导的方法来模拟体内胰腺发育的过程，使多能性干细胞逐步经过内胚层细胞、胰岛前体细胞等阶段，最后发育为成熟胰岛β细胞^[10-12]。在此过程中，利用不同生长因子和小分子的组合进行逐步诱导而获得的胰岛素阳性细胞能够表现部分胰岛细胞的特性，能够释放胰岛素，表达特异的胰岛转录因子。然而，这些胰岛素阳性细胞大多表现出未成熟和低分化胰岛的特点^[13-14]，如共表达胰岛素和胰高血糖素、胰岛素在分化的细胞内含量较低以及体内调控糖尿病小鼠血糖的不稳定性等^[15-17]。因此，需要进一步优化诱导型多能干细胞定向诱导为胰岛分泌细胞的条件，提高诱导分化的效率，促进体外分泌胰岛素细胞的成熟。研究诱导型多能干细胞高效定向分化为能够分泌胰岛素细胞的方法，对于糖尿病的细胞移植治疗无疑具有巨大推动作用。

实验选择一种利用小分子抑制剂的高效诱导分化策略^[18]，将C57BL/6J小鼠胚胎成纤维细胞来源的诱导型多能干细胞作为向胰岛β细胞定向分化的种子细胞，逐步添加不同小分子抑制剂，将诱导型多能干细胞最终诱导分化为成熟的胰岛素分泌细胞。获得的胰岛素分泌细胞不仅在体外葡萄糖的刺激下能够分泌胰岛素，并且将该细胞移植于1型糖尿病小鼠肾包膜下，可成功缓解糖尿病小鼠的高血糖状态。由此获得的胰岛素分泌细胞为进一步研究诱导型多能干细胞定向分化以及糖尿病细胞治疗的临床应用研究奠定了基础。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年6月至2015年11月在西京医院整形外科实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级健康C57BL/6J小鼠30只，8-12周龄，体质量约20 g，购自解放军第四军医大学实验动物中心；SPF级健康CF1小鼠6只，其中雄性2只，雌性4只，6-8周龄，体质量约25 g，购自国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心。傍晚时将CF1小鼠以雌雄比例为2︰1进行合笼饲养，合笼后每日早晨定时将雌雄分开，对雌鼠的阴道口进行检栓，见栓的雌鼠单独饲养，并记录日期。

1.3.2 试剂和细胞 小鼠诱导型多能干细胞(miPSCs)购自中科院上海生命科学研究院生化细胞所。胎牛血清(Biochrom公司)；高糖DMEM培养基、RPMI 1640培养基、α-MEM培养基、B27、非必需氨基酸、Glutamax(Invitrogen公司)；0.25%胰蛋白酶、β-巯基乙醇(Sigma公司)；ActivinA(Peprotech公司)；Nucleosides和LIF(Millipore公司)；抑制剂CHIR99021、Dorsomorphin、Retinoic acid、SB431542、Forskolin、Dexamethasone、Alk5 inhibitor II(Merk公司)；DMEM低糖培养液(Hyclone公司)；胎牛血清(Invitrogen公司)；碱性磷酸酶染色试剂盒(碧云天公司)；RNA 提取试剂盒(Qiagen公司)；反转录试剂盒(Takara公司)；小鼠超敏胰岛素ELISA试剂盒(Mercodia公司)；血糖仪及试纸(强生公司)。

1.3.3 引物 实验过程中所需引物均自行设计，由上海生物工程股份有限公司合成。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养和饲养层准备 取孕12.5-13.5 d的CF1胎鼠，去除胎鼠头部、内脏、四肢及尾部，用显微剪将分离的躯干剪成< 1 mm³的碎块，0.25%胰蛋白酶消化5 min后利用移液管反复吹打，用小鼠胚胎成纤维细胞培养液(DMEM低糖培养液+体积分数为10%胎牛血清+4 mmol/L谷氨酰胺)终止消化，将细胞悬液转移至离心管中进行离心，离心后重悬细胞于小鼠胚胎成纤维细胞培养液中，待细胞长至80%-90%融合时进行传代或冻存。在第3代小鼠胚胎成纤维细胞培养基中加入丝裂霉素C(10 mg/L)，放入培养箱中孵育2.5 h，用PBS将丝裂霉素C处理过的小鼠胚胎成纤维细胞洗5遍，去除残留的丝裂霉素C，然后用0.25%胰酶消化并计数后接种到预先用0.1%明胶包被过的培养瓶内，用于小鼠诱导型多能干细胞的培养。

1.4.2 诱导型多能干细胞向胰岛细胞的定向诱导分化 将小鼠诱导型多能干细胞接种在处理过的饲养层上，并置于含有白血病抑制因子、非必需氨基酸、谷氨酰胺替代物Glutamax、核苷和体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基，37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱中进行培养，每天换液。将培养48 h的诱导型多能干细胞通过逐步诱导的方法进行定向诱导分化(图1)。①首先，将诱导型多能干细胞向内胚层细胞诱导分化：将细胞的生长培养液更换为含有体积分数为2%胎牛血清和100 μg/L激活素A的RPMI 1640培养液，培养72 h；②其次，将培养基替换为含有1% B27、2 μmol/L 视黄酸、10 μmol/L SB431542以及1 μmol/L Dorsomorphin的α-MEM，将内胚层细胞定向诱导分化为胰岛前体细胞，培养7 d；③最后，为了促进胰岛前体细胞定向诱导分化为分泌胰岛素的细胞，在细胞培养液中添加10 μmol/L 腺苷酸环化酶激活剂Forskolin、10 μmol/L 地塞米松和5 μmol/L ALK5小分子抑制剂。每三四天更换2/3的培养液，直至诱导分化第21天。

1.4.3 碱性磷酸酶染色 吸去细胞培养液，用PBS洗3次，随后用40 g/L多聚甲醛溶液固定细胞，室温15 min，吸取少量碱性磷酸酶染色液覆盖细胞，室温避光静置 15 min，吸出染色液，用PBS洗3遍后于显微镜下观察。

1.4.4 双硫腙染色液 称取10 mg双硫腙溶于10 mL 二甲基亚砜中，用时以D-Hank’s液(pH7.8)按1︰1 000比例稀释，0.22 μm过滤器过滤。在获得的诱导分化的胰岛样细胞团中加入稀释好的10 mL双硫腙染色液，混合后室温下染色10 min，倒置显微镜观察成熟的胰岛样细胞团呈猩红色。
1.4.5 RT-PCR检测相关基因表达 在小鼠诱导型多能干细胞诱导分化为成熟的胰岛β细胞过程中，分别收集内胚层细胞、胰岛前体细胞和成熟胰岛细胞，用Qiagen总RNA提取试剂盒提取细胞的总RNA，并用1 μg总RNA进行反转录，获得的cDNA用于内胚层标志基因(Sox 17和Fox2A)，胰岛前体细胞标志基因(NeuroD1、NGN3和Sox9)以及成熟胰岛细胞标志基因(Insulin、ISL、Glu2和GCG)的mRNA表达水平检测，引物序列见表1。

1.4.6 ELISA法检测胰岛素分泌量 取24孔板中诱导分化20 d培养的细胞，吸去培养液，加入KRBB缓冲液预培养1 h，用含低浓度和高浓度葡萄糖(2.5 mmol/L和 22.5 mmol/L)的KRBB缓冲液继续培养1 h，收集缓冲液-80 ℃保存。取出试剂盒及标本，使其平衡至室温。以酶结合物稀释液稀释酶结合物(1︰10)，以双蒸水稀释洗涤液(1︰20)，临用前15 min配好。取出板条，吸出10 μL标准品和标本加入相应的孔中。每孔加入100 μL酶结合物稀释液。封板胶纸封住反应孔，室温下在摇床上培养2 h，每孔加入350 μL洗涤液，洗板6次。每孔加入200 μL显色液，室温避光孵育15 min。每孔加入50 μL终止液，充分混匀。使用多功能酶标仪检测450 nm处吸光度值。

1.4.7 糖尿病模型的诱导 C57BL/6J小鼠禁食12 h后，用荧光笔在尾巴上标记编号，并分别称质量。避光称取双硫腙后，按1%浓度溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，0.22 μm过滤，冰上放置，按照200 mg/kg腹腔注射双硫腙溶液，48 h后每天测血糖，连续2 d血糖超过19.4 mmol/L认为造模成功。

1.4.8 实验分组实验共分为3组(n=10)，分别为正常对照组、糖尿病对照组、胰岛素分泌细胞移植组。

1.4.9 糖尿病小鼠肾包膜下移植诱导分化的胰岛素分泌细胞 造模成功后即刻，使用小动物气体麻醉机，氧气和异氟烷的混合气体对小鼠进行麻醉，4%异氟烷进行吸入诱导麻醉，在小鼠进入外科深麻醉期后，以2%的浓度维持麻醉。胰酶消化诱导分化的胰岛素分泌细胞，约5×10⁵个细胞重悬于150 μL 1640培养基中，用移液器将细胞悬液转移入蛋白上样管内(蛋白上样管尖端用封口膜封住)，于培养箱内静置，使细胞聚集在上样管尖端。将小鼠侧卧位，剪开皮肤肌肉后，挤出肾脏。在移植前，吸去蛋白上样管的上清部分，保留白色细胞聚集物。将含有细胞聚集物的上样管与200 μL移液器连接，去掉封口膜，在手术显微镜下将细胞注入肾包膜下，丝线逐层缝合肌肉，皮肤。移植后每天10点取小鼠尾静脉血测定随机血糖。
1.4.10 免疫荧光染色 移植3周后，将小鼠肾脏取出放在甲醛溶液中室温固定24 h，常规进行脱水、包埋、切片，切片厚度4 μm。将石蜡切片在40 ℃烤片机上放置1 h，室温下冷却，依次放入染色缸中脱蜡脱水：二甲苯20 min→二甲苯10 min→体积分数为100%乙醇10 min→体积分数为95%乙醇5 min→体积分数为85%乙醇5 min→体积分数为70%乙醇5 min→PBS 5 min。将柠檬酸抗原修复液于微波炉中煮沸，将片架放入液体后高火15 min，室温下自然冷却。PBS冲洗3×5 min后，将切片浸泡于体积分数为3%H₂O₂中室温静置10 min (去除内源性酶)。PBS冲洗3×5 min，擦干切片，用组画笔标记组织位置。用5%牛血清白蛋白在37 ℃进行封闭1 h。在组织上滴加一抗(豚鼠胰岛素多克隆抗体，Abcam 公司)，以1︰100稀释，并用PBS代替一抗做阴性对照，置于湿盒中4 ℃孵育过夜。室温复温30 min后，用PBS冲洗3×5 min，随后滴加以1︰200稀释的荧光标记二抗(山羊抗豚鼠 IgG，Alexa Fluor 488)，37 ℃避光室温孵育1 h。最后用PBS冲洗3× 5 min加入20 μL DAPI染色液覆盖样品，避光孵育5 min，滴加抗荧光猝灭剂，封固，正置荧光显微镜下观察并拍照。
1.5 主要观察指标 ①诱导型多能干细胞的鉴定；②定向诱导分化为胰岛分泌细胞的形态；③诱导分化的胰岛素分泌细胞功能基因检测结果；④体外胰岛素分泌量；⑤诱导分化的胰岛素分泌细胞移植后糖尿病小鼠随机血糖；⑥糖尿病小鼠肾包膜下移植物组织学观察结果。

讨论

作者对大量文献报道中应用的诱导方法进行筛选，最终采用了一种高效的诱导策略^[18]。此方法利用多种生长因子和小分子化合物组合，通过循序渐进的步骤，成功地获得了能够在体外分泌胰岛素的细胞。该方法比其他方法缩短了诱导天数，并且操作简单，避免了形成类胚体，细胞分选以及重新接种等操作；另外，此方法中采用小分子化合物能够使诱导过程维持稳定。通过RT-PCR对分化不同阶段基因进行检测，NeuroD1、NGN3、Insulin、ISL、Glu2、GCG等基因表达逐渐增强，这表明诱导获得的分泌胰岛素的细胞已具备类似胰岛细胞的特性。在葡萄糖刺激环境下，胰岛素分泌细胞的体外培养上清液及细胞裂解液中的胰岛素水平均高于未诱导的细胞，胰岛素分泌细胞能够感知葡萄糖浓度变化并分泌胰岛素，经高浓度葡萄糖刺激之后，胰岛素水平明显增加。尽管这个诱导方法能够获得胰岛素分泌细胞，但是仍然存在获得的成熟胰岛素分泌细胞含量较低的问题，这与其他诱导策略遇到的困难相一致^[13]，为了获得成熟的胰岛素分泌细胞，仍需要优化体外的培养条件。

胰岛β细胞在体内的分化发育大体分为4步：内胚层分化、胰腺分化、内分泌细胞分化和β细胞成熟。胰岛β细胞发育过程极其复杂，其表型功能维持涉及多种信号通路，需要多种转录因子如成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白、表皮生长因子、肝细胞核因子、PDX-1、NeuroD1、Sox9等调节。实验选择了多种关键的生长因子和小分子组合对诱导型多能干细胞进行诱导分化，但完全模拟体内胰腺发育过程是困难的，在胰岛β细胞胚胎发育过程中仍有其他因子是必需的。是否存在其他因子促进胰岛β细胞分化并显著提高细胞的成熟度、所诱导的胰岛素分泌细胞在体内能否长期发挥治疗作用并成为合格的替代细胞仍然有待进一步研究。

实验将C57BL/6J小鼠诱导型多能干细胞诱导为胰岛素分泌细胞，并将其移植到同品系糖尿病小鼠肾包膜下，避免移植后免疫排斥问题，与模型组小鼠相比较，移植组小鼠能够改善高血糖症状。对移植小鼠的胰腺进行组织病理检验，证实了链脲菌素实际上已经摧毁了小鼠自身的β细胞，并不存在小鼠自身胰岛再生的可能。因此，移植组的糖尿病小鼠血糖水平降低可以归因于所移植的胰岛素分泌细胞。值得注意的是，该诱导分化的细胞在移植后，小鼠的血糖水平下降，3周后再次反弹。实验排除了小鼠进食引起高血糖的可能性，因为测定葡萄糖水平前小鼠均禁食。目前尚不清楚这是否反映了移植的细胞仍不够成熟或者移植的细胞数量不足等问题，或者存在其他一些其他代谢调控机制的参与还需进一步研究。

目前临床多采用肝门静脉内胰岛移植，虽然肝脏移植能够给移植物提供丰富的血供和营养环境，但是移植后不久便会损失大量胰岛^[19]，且常伴一些并发症，如出血、血栓形成、门静脉高压症、经血液介导的炎症反应降低移植效果，以及移植失败导致肝内胰岛功能缺失，移植到门静脉后移植物无法活检等^[20]。由于肝内炎症反应的发生，引起多个信号通路被激活，大量的细胞因子被释放(肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、γ-干扰素等)，引起β细胞的损伤或凋亡^[21-23]。多数实验研究表明肾包膜下移植胰岛细胞是较为理想的移植部位^[24]，具有手术操作简单、并发症少、成功率高、移植物可长期存活、易于活检等特点。肾包膜下移植广泛应用于啮齿类动物的研究，肾脏血流丰富，利于术后胰岛的血管化，并且手术操作简单，不易引起感染。移植到此处的胰岛成活率高，血糖控制平稳，因此实验采用了肾包膜下进行诱导型多能干细胞来源的胰岛样细胞移植。移植3周后，取出小鼠的肾脏进行病理切片，免疫荧光染色结果显示移植的细胞结构完整，并表达胰岛素，表明肾包膜是胰岛移植的理想部位。

总之，作者采用了一种简单、稳定的诱导策略，将小鼠诱导型多能干细胞诱导为胰岛素分泌细胞，这些细胞能够在糖尿病小鼠体内发挥功能，为1型糖尿病实施细胞治疗提供理论依据。

诱导型多能干细胞体外向胰岛素分泌细胞分化及对血糖的调控

Insulin-secreting cells from induced pluripotent stem cells regulate blood glucose levels in vitro

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