视网膜干细胞移植对青光眼视网膜神经节细胞的保护

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.015

摘要/Abstract

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文题释义：
视网膜干细胞：是一种特殊的神经干细胞，视网膜Müller细胞是能够产生视网膜干细胞的惟一胶质细胞，大量研究表明Müller细胞是视网膜中的潜在视网膜干细胞，在视网膜神经节细胞缺失的兔眼中移植Müller细胞，可以分化为视网膜神经节祖细胞，促进视网膜神经节细胞功能的恢复。
神经节细胞层：位于视网膜的最内层，由多极的节细胞组成，其树突主要与双极细胞联系，也可通过无足细胞横向联系，其轴突延伸至视神经乳头处，穿过筛板，形成视神经。

摘要
背景：干细胞移植是治疗致盲性眼病的一种新方法，关于视网膜干细胞移植对青光眼视网膜神经节细胞保护作用的研究不多。
目的：探讨视网膜干细胞移植对青光眼大鼠视网膜神经节细胞的保护作用。
方法：将45只SD大鼠随机分为3组(n=15)：对照组、模型组、视网膜干细胞移植组，后2组建立青光眼大鼠模型，视网膜干细胞移植组大鼠在建模后第7天向玻璃体腔内注射1 mL视网膜干细胞(5×10⁶个细胞)，模型组大鼠注射等量的PBS，对照组大鼠不予任何处理，移植2周后进行相关指标检测。
结果与结论：①模型组脑源性神经营养因子和胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白的表达均明显低于对照组(P < 0.05)，视网膜干细胞移植组脑源性神经营养因子和胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白的表达明显高于模型组 (P < 0.05)，但仍低于对照组(P < 0.05)；②模型组的视网膜神经节细胞的凋亡数明显高于对照组(P < 0.05)，视网膜干细胞移植组的视网膜神经节细胞的凋亡数明显低于模型组(P < 0.05)，但仍高于对照组(P < 0.05)；③模型组的视网膜神经节细胞数明显低于对照组(P < 0.05)，视网膜干细胞移植组的视网膜神经节细胞数明显高于模型组(P < 0.05)，但仍低于对照组(P < 0.05)；④结果表明，视网膜干细胞移植治疗大鼠青光眼可以保护视网膜神经节细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-7865-2063(顾志敏)

关键词: 干细胞, 移植, 视网膜, 青光眼, 大鼠, 神经节细胞, 保护作用

Abstract:

BACKGROUND: Stem cell transplantation is a new method for blinding eye disease. But there is a lack of research about the protective effect of retinal stem cell transplantation on retinal ganglion cells in glaucoma.
OBJECTIVE: To explore the protective effect of retinal stem cell transplantation on retinal ganglion cells of rats with glaucoma.
METHODS: Forty-five Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups (n=15 per group) including control, model and retinal stem cell transplantation groups. Rat models of glaucoma were prepared in the latter two groups, and at 7 days after modeling, rats in the three groups were given intravitreal injection of 1 mL retinal stem cells (5x10⁶ cells), the same amount of PBS, and no treatment, respectively. Subsequently, relative indicators were detected at 2 weeks after transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: The expressions of brain-derived neurotrophic factor and insulin-like growth factor I protein as well as the number of retinal ganglion cells were the highest in the control group, followed by the retinal stem cell transplantation group model group, and the lowest in the model group (P < 0.05). The number of apoptotic retinal ganglion cells in model group was significantly higher than that of control group (P < 0.05), and which in the retinal stem cell transplantation group was significantly lower than that in the model group (P < 0.05), but higher than that in the control group (P < 0.05). These results suggest that retinal stem cell transplantation for rat glaucoma can exert a protective effect on retinal ganglion cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Retina, Stem Cell Transplantation, Glaucoma, Retinal Ganglion Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

顾志敏，周利晓，齐若. 视网膜干细胞移植对青光眼视网膜神经节细胞的保护[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(28): 4203-4209.

Gu Zhi-min, Zhou Li-xiao, Qi Ruo . Protective effect of retinal stem cell transplantation on retinal ganglion cells in glaucoma[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(28): 4203-4209.

图/表（结果） 1

2.1 视网膜干细胞的形态 原代培养第3天出现细胞球，形状为类圆形，原代培养第5天，细胞球增多增大，折光性增强，形成立体感比较强的神经球，培养第7天以后神经球增大不明显。视网膜干细胞培养至第7天时开始传代培养，传代培养第3天出现细胞克隆，呈小圆形，第2代细胞培养24 h出现细胞团(图1)。

2.2 视网膜干细胞的鉴定 免疫荧光染色鉴定结果显示：培养细胞中96%以上细胞为Nestin阳性表达细胞(图2)。

2.3 大鼠青光眼模型的鉴定 在术后第1天有20只大鼠实验眼出现眼结膜轻度水肿，11只出现角膜轻度水肿，6只出现前房房水混浊，术后第7天时所有症状均消失，实验眼均未出现晶状体浑浊。30只对照眼均未出现异常。由表1可以看出，30只实验眼在术后第7天和第21天时的眼内压均明显高于对照眼(P < 0.05)，表明青光眼大鼠模型均建造成功。

2.4 各组大鼠视网膜中脑源性神经营养因子和胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白的表达 由表2可以看出，模型组脑源性神经营养因子和胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白的表达均明显低于对照组(P < 0.05)，视网膜干细胞移植组脑源性神经营养因子和胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白的表达明显高于模型组(P < 0.05)，但低于对照组(P < 0.05)。

2.5 视网膜神经节细胞的凋亡情况 由表3可以看出，模型组视网膜神经节细胞的凋亡数明显高于对照组(P < 0.05)，视网膜干细胞移植组的视网膜神经节细胞的凋亡数明显低于模型组(P < 0.05)，但高于对照组(P < 0.05)。

2.6 视网膜神经节细胞的计数 由表4可以看出，模型组视网膜神经节细胞数明显低于对照组(P < 0.05)，视网膜干细胞移植组的视网膜神经节细胞数明显高于模型组(P < 0.05)，但低于对照组(P < 0.05)。

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引言

青光眼是一种致盲性眼科疾病，具有不可逆转性，主要是由眼内压增高等原因造成神经纤维层和视神经节细胞损伤后继发的一种神经系统变性病变，其发生由多种细胞因子共同参与。青光眼的治疗主要有改善微循环、诱导热休克蛋白表达、抗氧化、增加神经营养因子以及谷氨酸途径抑制剂等多种方法^[1-2]，但上述方法不能有效阻止视网膜神经节细胞凋亡。

干细胞具有自我更新和分化能力，将胚胎干细胞移植到小鼠视网膜内可以和视网膜层融合，分化为神经元细胞并提高其存活率^[3]，研究表明移植到青光眼鼠体内的干细胞可以融合到视网膜中，分化为胶质细胞和视网膜神经元细胞，产生各种神经营养因子^[4]。未分化的干细胞移植后可以产生化学因子受体和调节蛋白，并诱导Th1细胞凋亡，减少神经组织损伤，因此移植未分化干细胞可以治疗慢性神经系统疾病。青光眼的视觉功能异常主要是由视神经节细胞损伤引起的，因此找到一种能够分化为视神经节细胞并建立神经元功能联系的方法是治疗青光眼的一种途径。视网膜干细胞是存在于睫状边缘带的一种具有干细胞特性的细胞，可以分化为神经胶质细胞、光感受器细胞以及双极细胞等视网膜细胞，用于治疗视网膜变性疾病、老年性黄斑病变以及遗传性视网膜变性等致盲性眼科疾病。

实验将分离和培养的视网膜干细胞用于移植治疗青光眼大鼠，观察青光眼大鼠视网膜中脑源性神经营养因子和胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白的表达、视网膜神经节细胞的凋亡情况以及视网膜神经节细胞的数量，为保护视网膜神经节细胞提供一种新的方法。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年3月至2015年6月在郑州大学第五附属医院完成。

1.3 材料 健康雄性SD大鼠48只，清洁级，8-10周龄，体质量190-220 g，其中3只用于视网膜干细胞的培养，其余用于动物体内实验，所有大鼠购自河南省动物实验中心。实验前按实验动物饲养标准饲养于大鼠专用鼠笼，实验大鼠符合卫生部一级动物标准，经过动物伦理学委员会批准。

1.4 实验方法

1.4.1 视网膜干细胞的培养 取3只8-10周龄大鼠，水合氯醛麻醉，摘下大鼠眼球，乙醇消毒，去掉眼球的视神经以及眼球外组织，分离出睫状体部组织，剪碎后置于离心管中，加入胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化，胎牛血清终止消化，尼龙滤网过滤单细胞悬液，离心后弃去上清液，加入干细胞培养液进行培养。原代培养每3 d进行1次半量换液，原代培养第3天时开始出现细胞球，第7天左右细胞球在瓶底融合，开始进行传代培养。
1.4.2 视网膜干细胞的鉴定 将原代培养的细胞置于多聚赖氨酸包被的盖玻片上，培养第2天进行免疫荧光染色，PBS洗涤，多聚甲醛固定，PBS洗涤，TritonX-100作用，PBS洗涤，BSA封闭，一抗兔抗Nestin多克隆抗体孵育，阴性对照一抗用PBS替代，PBS洗涤后加入羊抗兔IgG-Cy3二抗，PBS孵育，DAPI复染，甘油封固剂封固，显微镜下拍照观察。取5个不同视野观察并计数染色阳性细胞，计算阳性细胞率，取平均值。

1.4.3 建立青光眼大鼠模型 取8-10周龄SD大鼠30只，水合氯醛麻醉，双眼行布鲁卡因表面麻醉，将每只大鼠的左眼设置为实验眼，右眼设置为对照眼，测量每只眼的眼内压，激光对实验眼血管进行光凝，光凝后第7天及第21天测双眼眼内压，左眼眼内压比右眼眼内压升高大于10 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)为青光眼模型建造成功。

1.4.4 实验动物分组及处理 将15只未进行建模的大鼠作为对照组，将30只建模大鼠分为模型组15只和视网膜干细胞移植组15只，视网膜干细胞移植组大鼠在建模后第7天向玻璃体腔内注射1 mL视网膜干细胞(5×10⁶个细胞)，模型组大鼠在建模后第7天向玻璃体腔内注射等量的PBS。

1.4.5 Western blot法检测脑源性神经营养因子和胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白表达 移植2周后，随机选取每组大鼠各5只，取下视网膜组织，加适量RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂cocktail，经1 mL手动匀浆器匀浆裂解后，转移至1.5 mL离心管，冰上放置1 h，其间揺晃3-5次，4 ℃下12 000 r/min离心30 min，收集离心后蛋白上清液于-70 ℃低温冰箱储存备用，采用BCA法测定总蛋白质的浓度，将己制备好的蛋白样品加到8% SDS-PAGE凝胶上的梳孔中，然后利用Mini- PROTEAN 3电泳系统在120 V恒压条件下电泳90 min左右，从而将视网膜蛋白按分子质量大小在SDS-PAGE胶上依次分离开，再用 Mini Trans-Blot电转系统在恒流300 mA条件下转膜2 h，将蛋白从凝胶转印到PVDF膜上，然后进行封闭、一抗孵育、二抗孵育、荧光显影，并进行扫描分析。

1.4.6 采用TUNEL法检测视网膜神经节细胞的凋亡 移植2周后，随机选取每组大鼠5只，取下视网膜组织，制备切片。①新鲜配制的4% PFA/KPBS溶液(pH 7.4)浸染视网膜组织玻片，室温15 min；②1×KPBS液浸泡 5 min，室温，重复1次；③预渗透：滴加20 mg/L Proteinase K工作液，在室温下孵育8-10 min；④4%PFA再固定5 min，1×KPBS液浸泡5 min，室温；⑤平衡：滴加100 μL Equilibration液，室温5-10 min；⑥反应：滴加反应孵育液，37 ℃湿盒中避光孵育1 h；⑦终止反应：置玻片于2× SSC工作液中，室温15 min；⑧1×KPBS液中浸泡5 min，室温，重复3次；⑨滴加DAPI染液，室温孵育15 min，用1×KPBS液浸洗5 min；⑩加盖玻片封固，置荧光显微镜观察拍片，绿色荧光为TUNEL阳性信号。每张切片选择10个不同视野计算视网膜神经节细胞的凋亡数，取平均值。

1.4.7 视网膜组织免疫荧光染色 移植2周后，每组选择5只大鼠，将视网膜先置入甲醇冰上固定30 min，再置于3 g/L TritonX-100中4 ℃孵育过夜，滴加山羊血清室温封闭抗原 2 h，吸去封闭液，不洗，加入α-SMA单克隆抗体(1︰100，1 g/L TritonX-100稀释)37 ℃水浴箱孵育 3 h，水平摇床上1 g/L TritonX-100洗3次，每次20 min，滴加山羊抗鼠IgG-FITC(1︰100，1 g/L TritonX-100稀释)室温避光孵育 2 h，水平摇床上1 g/L TritonX-100洗3次，每次20 min，手术显微镜下铺片，神经层向上，滴少许抗荧光淬灭剂封固，于荧光显微镜490 nm波长下观察并照相。每张切片选择10个不同视野计算视网膜神经节细胞数，取平均值。

1.5 主要观察指标 ①视网膜干细胞的形态及鉴定；②视网膜脑源性神经营养因子和胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白的表达；③视网膜神经节细胞的凋亡数；④视网膜神经节细胞数。

1.6 统计学分析 所有数据输入SPSS 18.0软件进行处理，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

青光眼的主要病理改变是眼内压升高，主要表现为视野缺损和视神经损伤，是位居第2位的致盲性眼科疾病，目前的治疗主要是通过手术或者药物的方法控制眼内压，但仅仅控制眼内压并不能阻止视网膜神经节细胞的凋亡，导致视神经细胞的进行性损伤，阻止神经节细胞凋亡的方法是保护视神经。青光眼患者视神经损害的机制有机械压力学说以及血管缺血学说，青光眼视神经的损害除了上述机制外，免疫、应激和遗传等也参与损害青光眼视神经^[5]，视网膜神经节细胞凋亡的原因有神经营养因子被剥夺、谷氨酸和内皮素兴奋等^[6]。青光眼视神经保护治疗的方法主要有：①抗青光眼药物：抗青光眼药物除了降低眼内压外，还有视神经的保护作用^[7]；②热休克蛋白：热休克蛋白是一种神经保护因子，能够清除变性蛋白质，提高对刺激的耐受，维持细胞稳定，减少视网膜神经节的凋亡，降低肿瘤坏死因子α的表达^[8-9]；③神经干细胞治疗：神经干细胞治疗在神经节的再生中起到一定作用，可以保护损伤的神经节细胞^[10]，经玻璃体腔注入间充质干细胞能够促进轴突和神经节的再生^[11]；④其他：其他方法有视网膜神经节细胞营养因子及中医治疗等。

多种视神经病变都会引起视网膜神经节细胞的损伤，视网膜神经节细胞是惟一将视网膜消息传达到大脑的神经元，不能分化代替已经死亡的细胞，因此视网膜神经节细胞的进行性死亡是致盲的主要原因，对于视网膜神经节细胞进行性死亡所致的致盲性疾病，目前没有有效的治疗方法。干细胞移植治疗为其提供了新的治疗方法^[12-13]：①干细胞移植对视网膜神经节细胞的保护作用：神经干细胞可能生成一些营养因子，并可以通过免疫调节作用保护受损的视网膜神经节细胞^[14-15]，也可以对神经干细胞进行预处理增加神经干细胞移植的多靶向性和时效性^[16]，视网膜干细胞是一种特殊的神经干细胞，视网膜Müller细胞是能够产生视网膜干细胞的惟一胶质细胞，大量研究表明Müller细胞是视网膜中的潜在视网膜干细胞^[17]，在视网膜神经节细胞缺失的兔眼中移植 Müller细胞，可以分化为视网膜神经节祖细胞，促进视网膜神经节细胞功能的恢复^[18]。间充质干细胞移植也可以保护视网膜神经节细胞^[19-21]，其中比较常用的有骨髓间充质干细胞^[22]、人脐血间充质干细胞^[23-26]、诱导多能干细胞等^[27-30]；②干细胞移植替代治疗：在青光眼等致盲性疾病的晚期阶段，视网膜神经节细胞的替代治疗是希望恢复视功能的惟一办法，不过目前的替代治疗仍处于动物实验阶段。视网膜干细胞相对与其他干细胞来说，向视网膜神经元分化的潜能更大^[31-32]，目前视网膜干细胞已在体外被成功分离培养^[33-35]，移植细胞的迁移和整合与炎症聚集^[36]、视网膜的微环境以及移植细胞的发育阶段等因素有关，通过改善上述因素可以为干细胞移植提供更好的整合条件，使细胞移植更具功能性^[37-39]。

视网膜干细胞在1998年被提出^[40]，鸡睫状体色素细胞层中能够分离出视网膜前体细胞^[41]，在小鼠和大鼠的睫状体中也可以分离出视网膜干细胞^[42-43]，不同动物的视网膜神经细胞分化的终末细胞所需的时间大致相同^[44-45]，一般先出现水平细胞和视网膜神经节细胞，再出现视杆细胞、双极细胞等，最后是Müller细胞。该研究通过建立青光眼大鼠模型，对青光眼大鼠进行视网膜干细胞移植治疗，观察青光眼大鼠视网膜干细胞移植后视网膜中脑源性神经营养因子、胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白的表达，视网膜神经节细胞的凋亡以及视网膜神经节细胞的数量，结果发现，模型组脑源性神经营养因子、胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白的表达均明显低于对照组(P < 0.05)，视网膜干细胞移植组脑源性神经营养因子、胰岛素样生长因子Ⅰ的表达明显高于模型组(P < 0.05)。模型组的视网膜神经节细胞的凋亡数明显高于对照组(P < 0.05)，视网膜干细胞移植组的视网膜神经节细胞的凋亡数明显低于模型组(P < 0.05)。模型组的视网膜神经节细胞数明显低于对照组(P < 0.05)，视网膜干细胞移植组的视网膜神经节细胞数明显高于模型组(P < 0.05)。由此可见，视网膜干细胞移植对大鼠青光眼具有治疗作用，可以保护视网膜神经节细胞。