人脐血单个核细胞中CD133+细胞移植治疗心力衰竭的评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.014

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
CD133⁺细胞：是单个核细胞群中一类纯化细胞，具有非常高的倍增特性和较好的血管新生潜能，具有分化为层状心肌内皮细胞的能力，可改善心肌缺血，利于心肌修复。
干细胞表面特异性抗原CD133、CD34：造血系统中，CD133在35%-75%的CD34⁺细胞亚群上表达，主要见于人类胎肝、骨髓、脐血、外周血中CD34bright干细胞和前体细胞。CD133也见于这些组织的一小部分CD34-细胞，在成熟的血细胞上不表达。与CD34抗原不同的是，CD133在晚期祖细胞，如前B细胞、红系集落形成单位、粒系集落形成单位上不表达。最近发现CD133还可以作为其他非造血干、祖细胞的表面标志，如神经干细胞、胚胎干细胞系和具有多向分化潜能的成熟干细胞，这些细胞均为CD34^-细胞。

摘要
背景：细胞纯化方法可以消除细胞的生物变异性，为细胞再生治疗提供了新的思路。
目的：探讨CD133⁺细胞在人脐血单个核细胞移植治疗心力衰竭中的作用。
方法：①采用淋巴细胞分离液法提取人脐血单个核细胞，经免疫磁珠分离CD133⁺细胞及CD133^-细胞，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-1；②将40只SD大鼠随机分为5组：假手术组、模型组、CD133⁺细胞组、CD133^-细胞组和单个核细胞组，除假手术组，其余4组腹腔注射异丙肾上腺素建立心脏衰竭模型，CD133⁺细胞组经尾静脉注射1 mL CD133⁺细胞和1 mL PBS，CD133^-细胞组经尾静脉注射1 mL CD133^-细胞和1 mL PBS，单个核细胞组经大鼠尾静脉注射1 mL CD133⁺细胞和1 mL CD133^-细胞，假手术组和模型组经尾静脉注射2 mL PBS；③细胞移植后4周，观察大鼠的心肌病理组织学改变，心肌纤维化程度以及CD133⁺细胞在心肌内的定植情况。
结果与结论：①苏木精-伊红染色结果：模型组大鼠心肌排列紊乱，假手术组心肌排列整齐，CD133⁺细胞组心肌紊乱程度最轻，单个核细胞组其次，CD133^-细胞组和模型组接近；②Masson染色结果：模型组胶原纤维增多，排列紊乱，胶原纤维断裂，假手术组胶原纤维很少，排列整齐，CD133⁺细胞组心肌胶原纤维减少和紊乱程度最轻；③模型组、CD133⁺细胞组、CD133^-细胞组和单个核细胞组的胶原纤维面积均明显高于假手术组(P < 0.05)，其中CD133⁺细胞组的胶原纤维面积最小；④免疫组化和免疫荧光染色结果：在移植后4周各组大鼠心肌组织中均未发现特异性染色细胞；⑤结果表明，CD133⁺细胞移植治疗可以改善心肌受损程度，减少心肌纤维化程度，其治疗效果较单个核细胞移植治疗效果好，CD133⁺细胞并未定植于心脏局部。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0003-4886-0723(马力)

关键词: 干细胞, 移植, 脐血, 单个核细胞, CD133⁺细胞, 心力衰竭, 纤维化, 细胞移植

Abstract:

BACKGROUND: Cell purification can eliminate the biological variability of cells, providing new insight into cell regeneration therapy.
OBJECTIVE: To study the Influence of CD133⁺ cells on human umbilical cord blood mononuclear cell transplantation for treatment of heart failure.
METHODS: Human cord blood mononuclear cells were isolated using lymphocyte separation medium method, and CD133⁺ and CD133^- cells were sorted using immunomagnetic beads at a cell density of 1×10⁸/L. Forty Sprague-Dawley rats were randomized into five groups: sham group, model group, CD133⁺ cell group, CD133^- cell group and mononuclear cell group. Animal models of heart failure were made using intraperitoneal injection of isoproterenol in all the groups except for the sham group. Rats in the CD133⁺ cell group and CD133^- cell group were given 1 mL CD133⁺ cells plus 1 mL PBS and 1 mL CD133^- cells plus 1 mL PBS via the tail vein, respectively. Rats in the mononuclear cell group were given 1 mL CD133⁺ cells plus 1 mL CD133^- cells via the tail vein, and those in the sham and model groups given 2 mL PBS via the tail vein. After 4 weeks, cardiac pathology, degree of myocardial fibrosis and colonization of CD133⁺ cells in myocardial tissues were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining showed that myocardial tissues arranged disorderly in the model group, but regularly in the sham group; myocardial disorders were mildest in the CD133⁺ cell group, successively followed by the mononuclear cell group, and severest in the CD133^- cell group and model group. Masson staining showed that in the model group, collagen fibers were proliferated, arranged irregularly and even broken, while in the sham group, the collagen fibers were less in number and arranged in order. Additionally, there was less reduction in collagen fibers and milder myocardial disorders in the CD133⁺ cell group compared with the other groups. Area of collagen fibers was increased significantly in all the groups except for the sham group (P < 0.05), but this increment was the minimal in the CD133⁺ cell group. Findings from immunohistochemistry and immunofluorescence staining showed that there were no CD133⁺ cells in the myocardial tissues of rats. Therefore, our data indicate that compared with the mononuclear cell transplantation, CD133⁺ cell transplantation exerts superiorities in relieving myocardial damage and reducing myocardial fibrosis. However, CD133⁺ cells are not colonized in the myocardial tissue after transplantation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Cord Blood Stem Cell Transplantation, Heart Failure, Membrane Glycoproteins, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

马力，谢宜旭，常羽，姚磊. 人脐血单个核细胞中CD133+细胞移植治疗心力衰竭的评价[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(28): 4196-4202.

Ma Li, Xie Yi-xu, Chang Yu, Yao Lei . Influences of CD133⁺ cells on human umbilical cord blood mononuclear cell transplantation for treating heart failure[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(28): 4196-4202.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 40只SD大鼠均进入结果分析，中途无脱落。

2.2 各组大鼠心脏组织苏木精-伊红染色结果 模型组大鼠出现心肌排列紊乱，假手术组心肌排列整齐，CD133⁺细胞组、CD133^-细胞组和单个核细胞组的心肌紊乱程度介于模型组和对照组之间。CD133⁺细胞组、CD133^-细胞组和单个核细胞组比较，CD133⁺细胞组心肌紊乱程度最轻，单个核细胞组其次，CD133^-细胞组最重，CD133^-细胞组和模型组接近，见图1。

2.3 各组大鼠心脏组织的Masson染色结果 Masson染色后红细胞、纤维素和肌纤维呈红色，弹力纤维呈棕色，胶原纤维呈蓝绿色。镜下观察发现，模型组出现胶原纤维增多，排列紊乱，胶原纤维断裂等现象，假手术组胶原纤维很少，且排列整齐，CD133⁺细胞组、CD133^-细胞组和单个核细胞组的胶原纤维增多和紊乱程度介于模型组和对照组之间。CD133⁺细胞组、CD133^-细胞组和单个核细胞组比较，CD133⁺细胞组心肌胶原纤维减少，紊乱程度最轻，单个核细胞组其次，CD133^-细胞组最重，CD133^-细胞组和模型组接近。
模型组、CD133⁺细胞组、CD133^-细胞组和单个核细胞组的胶原纤维面积均明显高于假手术组(P < 0.05)，与模型组比较，CD133⁺细胞组和单个核细胞组胶原纤维面积减小(P < 0.05)，模型组和CD133^-细胞组相近，差异无显著性意义(P > 0.05)。CD133⁺细胞组胶原纤维面积少于单个核细胞组(P < 0.05)，见表1，图2。
2.4 各组大鼠心脏组织的免疫组化染色结果 免疫组化染色后，深棕色为特异性染色，蓝色为细胞核，显微镜下观察发现，各组大鼠心肌组织中均未发现特异性染色细胞，考虑脐血CD133细胞没有在心肌组织中定植，见图3。
2.5 各组大鼠心脏组织的免疫荧光染色结果 免疫荧光染色后，特异性抗体经FITC标记后，在荧光显微镜下可见到翠绿色荧光，深蓝色为细胞核，显微镜下观察各组大鼠心肌组织中均未发现与细胞核重合的特异性荧光细胞，与免疫组化结果一致，脐血CD133细胞没有在心肌组织中定植，见图4。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年3月至2015年6月在郑州市中心医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 脐血标本 采集正常足月分娩的婴儿脐血，产妇年龄20-33岁，无传染病及其他妊娠并发症。脐血留取前均经家属签字同意，每个婴儿留取脐血100 mL，血液采集后3 h内分离^[12]。

1.3.2 实验动物 健康雄性SD大鼠40只，8周龄，清洁级，体质量200-250 g，购自河南省实验动物中心。实验前适应性饲养1周，自由进食饮水。实验大鼠符合卫生部一级动物标准，并经过动物伦理学委员会批准。

1.3.3 主要试剂 胎牛血清、EDTA-胰蛋白酶(美国Gibco公司)；淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)，MAB1281(美国 Millipore公司)，青霉素、链霉素(哈尔滨制药总厂)；PE-133抗体(德国Miltenyi Biotcc公司)，PBS干粉(北京博奥森生物技术有限公司)；磁性分选试剂盒(德国Miltenyi Biotcc公司)；苏木精-伊红染色试剂盒(上海碧云天生物技术公司)；中性树脂(广州威佳科技有限公司)等。

1.3.4 实验器械与仪器 超净工作台(苏州净化设备厂)；流式细胞仪(美国Beckman Coulte公司)；二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；电热恒温水槽(山东光明仪器有限公司)；微量加液器及吸头(Finnpipette)；培养皿、离心管、玻璃吸管、分装瓶、EP管、96孔细胞培养板、25 cm²、75 cm²细胞培养瓶(美国Coring公司)；细胞计数板(上海玉光光学仪器厂)；电子分析天平(梅特勒-托利多仪器)；PHS-3E 型精密酸度计(上海雷磁分析仪器公司)；生物倒置显微镜(日本Olympus)；石蜡切片机(德国 Leica 公司)等。

1.4 实验方法

1.4.1 提取脐血单个核细胞^[13] 将肝素抗凝的脐血和等量的Hank’s液混匀，在离心管中加入Ficoll淋巴细胞分离液，然后将脐血稀释液沿管壁缓慢叠加于分离液面上，进行水平离心，上层和中层交界处的白色云雾层狭窄带即为单个核细胞，用毛细血管将单个核细胞移至另一试管中，加入RPMI1640培养液，离心，洗涤，在显微镜下计数细胞。

1.4.2 分离CD133⁺细胞^[14] 将分离的单个核细胞用少量PBE孵育液充分混悬，加入一抗孵育，PBE洗涤，PBS重悬细胞，加入二抗包被的超微磁珠孵育，孵育后置于磁场中，加入PBS预处理分离柱，收集首次流下的细胞即为CD133^-细胞，待用。然后分离柱中加入PBS洗柱，分离柱从磁场中取出，加入PBS，冲出阳性细胞，重复上述过程重新分离1次，收集CD133⁺细胞，待用。

1.4.3 动物分组 将40只SD大鼠随机分为5组：假手术组、模型组、CD133⁺细胞组、CD133^-细胞组和单个核细胞组，每组8只。

1.4.4 大鼠心力衰竭模型的建立 模型组、CD133⁺细胞组、CD133^-细胞组和单个核细胞组大鼠每天腹腔注射异丙肾上腺素(5 mg/kg)，共注射5 d，假手术组每天腹腔注射等量生理盐水，注射期间大鼠正常进食和饮水。

1.4.5 细胞移植 将CD133⁺和CD133^-细胞浓度调整为1×10⁸ L^-¹，CD133⁺细胞组经大鼠尾静脉注射1 mL CD133⁺细胞和1 mL PBS，CD133^-细胞组经大鼠尾静脉注射1 mL CD133^-细胞和1 mL PBS，单个核细胞组经大鼠尾静脉注射1 mL CD133⁺细胞和1 mL CD133^-细胞，假手术组和模型组用同样方法经尾静脉注射2 mL PBS。

1.4.6 取材和检测 细胞移植后4周，脱颈处死大鼠，取出心脏，剪去周围的血管和结缔组织，放入体积分数为10%甲醛中固定，石蜡包埋，切成5 μm厚的切片，铺于载玻片上，烤箱烘干，进行苏木精-伊红染色、 Masson染色、免疫组化染色、免疫荧光染色。

1.5 主要观察指标 各组大鼠心脏病理学变化、心脏胶原纤维面积、心脏组织中是否有特异性染色细胞。

1.6 统计学分析 所有数据输入SPSS18.0软件进行处理，计量资料用x(_)±s表示，多组资料比较采用ANOVA分析，方差齐性采用LSD法，方差不齐采用Games- Howeir法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

心力衰竭是各种心脏病的终末阶段，主要表现为乏力、呼吸困难和液体潴留^[15]，心力衰竭的治疗目的由原来的改善临床症状，提高生活水平，转变为现在的延缓及防治心肌重构，降低再住院率和死亡率，目前主要以药物治疗为主：醛固酮受体拮抗剂、β受体阻滞剂、血管紧张素转化酶以及磷酸酯酶抑制剂、洋地黄类、多巴胺等。醛固酮对心肌重构以及心力衰竭的进展有重要作用，醛固酮可以引起低钾、低镁，引起自主神经功能丧失，引起心脏结构功能异常^[16]，应用血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素受体拮抗剂治疗会引起醛固酮的逃逸现象^[17]，醛固酮抑制剂治疗心力衰竭有良好效果，可以降低死亡率^[18-19]；心脏窦房结起搏电流抑制剂可以降低心率，改善心肌缺血^[20-21]；钙离子增敏剂可以增加心肌收缩力，扩张外周静脉，降低心脏的前负荷^[22]；抗凝和抗血小板治疗不作为常规的治疗药物，在临床中的应用存在争议，是否应用结合患者的基础疾病而定^[23]；LCZ696是一种结合了诺华的Diovan和正处于研究阶段的AHU-377的药物，可以舒张血管，促进水钠排泄，降低心力衰竭的死亡率^[24]；中药在心力衰竭中的应用也比较广泛，单纯中药或者中药联合西药治疗心力衰竭也取得了良好效果^[25-26]。对于心力衰竭失代偿早期，药物治疗可以取得良好效果^[27-29]，对于终末期心力衰竭，药物治疗不能逆转坏死心肌，心脏移植是惟一有效的方法，因心脏供者的不足，心脏移植在临床上并未得到广泛应用，干细胞移植成为心力衰竭的一种新的治疗方法^[30]。

干细胞是一类可以自我复制和多向分化的细胞，在特定条件下可以分化为心肌细胞。骨髓源性干细胞取材和培养比较方便，是目前治疗心脏疾病研究最多的干细胞^[31-32]，骨髓源性干细胞可以定植在心脏内，分化为心肌细胞，参与心肌细胞的修复和心肌重建，促进血管的生成，还有改善窦房结起搏的作用^[33]。异体干细胞移植免疫原性存在争议^[34]，自体干细胞移植不存在免疫原性的问题，因此现阶段的研究基本都采用自体干细胞移植^[35]。脐血干细胞具有来源丰富，对供者没有伤害，移植后抗宿主病发生率低等优点^[36]，脐血来源的单个核细胞有修复受损心肌细胞的作用^[37]。纯化细胞可以消除生物变异性，清除惰性细胞亚群，增强细胞修复能力^[38]，为细胞再生治疗提供了新的思路。在治疗慢性心脏病方面，目前纯化的细胞主要有CD34⁺内皮祖细胞和人间充质干细胞^[39]。CD133是一种糖蛋白^[40]，可以联合CD34或者单独作为干细胞表面特异性抗原^[41]。从脐血中分离CD133细胞并用于治疗心脏疾病的研究比较少，CD133细胞在单个核细胞中是否发挥作用，纯化的CD133是否可以提高移植治疗效果是目前主要研究内容。研究发现脐血来源的CD133⁺细胞与骨髓来源的CD133⁺细胞移植治疗心力衰竭的效果相当^[42]。

实验通过提取人脐带单个核细胞并分离CD133⁺细胞及CD133^-细胞，并将其移植到心力衰竭大鼠模型体内，观察其对心功能的影响，结果发现模型组大鼠心肌排列紊乱，假手术组心肌排列整齐，CD133⁺细胞组、CD133^-细胞组和单个核细胞组的心肌紊乱程度介于模型组和假手术组之间，CD133⁺细胞组心肌紊乱程度最轻。模型组胶原纤维增多，排列紊乱，胶原纤维断裂，假手术组胶原纤维很少，且排列整齐，CD133⁺细胞组、CD133^-细胞组和单个核细胞组的胶原纤维和紊乱程度介于模型组和假手术组之间，CD133⁺细胞组心肌胶原纤维减少和紊乱程度最轻。免疫组化和免疫荧光染色后，各组大鼠心肌组织中均未发现特异性染色细胞。实验证实了CD133⁺细胞在人脐血单个核细胞移植治疗心力衰竭中所起的作用，为后期临床心力衰竭的治疗提供新的方法。