沉默ABCE1基因电转染卵巢癌肿瘤干细胞对β-榄香烯乳的敏感性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.007

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
ABCE1基因：属ATP结合盒转运子基因亚家族成员之一，与细胞生长、发育和增殖、分化有密切关联，其在人体各组织器官中均持续表达。相关研究表明，在肿瘤细胞系中抑制ABCE1的表达能够显著抑制癌细胞的生长，因此如能阻断肿瘤细胞中ABCE1的表达，通过抑制肿瘤细胞的增殖分化、侵袭、迁移及蛋白质的合成，就可以抑制肿瘤的发展，这为肿瘤的治疗提供了新的有效方法。
肿瘤干细胞：从本质上讲，肿瘤干细胞通过自我更新和无限增殖维持着肿瘤细胞群的生命力，肿瘤干细胞的运动和迁徙能力又使肿瘤细胞的转移成为可能；肿瘤干细胞可以长时间处于休眠状态并具有多种耐药分子而对杀伤肿瘤细胞的外界理化因素不敏感，因此常规肿瘤治疗方法消灭大部分普通肿瘤细胞后一段时间复发。

摘要
背景：对肿瘤干细胞相关基因ABCE1的深入研究有可能会发现它在参与恶性肿瘤的发生及进展等方面的重要作用。
目的：观察沉默ABCE1基因电转染卵巢癌肿瘤干细胞的增殖特性及对β-榄香烯乳的敏感性。
方法：设计合成ABCE1的siRNA序列，通过电转染入卵巢癌肿瘤干细胞。RT-PCR和Western blot检测ABCE1基因沉默后卵巢癌肿瘤干细胞ABCE1 mRNA及蛋白的表达，流式细胞仪检测细胞周期变化，MTT法和细胞克隆形成实验分析ABCE1基因沉默后卵巢癌肿瘤干细胞对β-榄香烯乳的敏感性。
结果与结论：①ABCE1基因沉默后卵巢癌肿瘤干细胞的ABCE1基因和蛋白表达明显降低；②ABCE1基因沉默后细胞周期被阻滞在G0/G1期，S期细胞数减少；③ABCE1基因沉默后β-榄香烯乳对卵巢癌肿瘤干细胞的增殖抑制率和克隆形成抑制率显著增加；④结果表明，沉默ABCE1基因能显著抑制卵巢癌肿瘤干细胞的增殖能力，并能增强肿瘤干细胞对β-榄香烯乳的敏感性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-9995-8862(王俊)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 卵巢癌, ABCE1, 细胞增殖, &beta, -榄香烯乳

Abstract:

BACKGROUND: It is likely to find that ABCE1 plays an important part in the occurrence and progression of cancers through in-depth study.
OBJECTIVE: To investigate the effects of ABCE1 silencing on the proliferation and sensitivity to β-eiemene of ovarian cancer stem cells via electrotransfection.
METHODS: siRNA sequence of ABCE1 was designed and synthesized, and then was electrotransfection into ovarian cancer stem cells. Subsequently, expressions of ABCE1 mRNA and protein in ovarian cancer stem cells after ABCE1 silencing were detected by RT-PCR and western blot assay; the cell cycle was detected using flow cytometry; the sensitivity of ovarian cancer stem cells to β-eiemene after ABCE1 silencing was analyzed by MTT assay and colony-formation assay.
RESULTS AND CONCLUSION: After ABCE1 silencing, expressions of ABCE1 mRNA and protein in ovarian cancer stem cells were significantly reduced. And the cell cycle was arrested in G0/G1 phase, and the number of cells in S phase significantly decreased. Furthermore, the sensitivity of ovarian cancer stem cells to β-eiemene after ABCE1 silencing was significantly enhanced. In conclusion, ABCE1 silencing cannot only significantly inhibit the proliferation of ovarian cancer stem cells, but also enhance the sensitivity of cancer stem cells to β-eiemene.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Ovarian Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, Gene Silencing, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王俊，王建中. 沉默ABCE1基因电转染卵巢癌肿瘤干细胞对β-榄香烯乳的敏感性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(28): 4149-4154.

Wang Jun, Wang Jian-zhong. ABCE1 silencing enhances sensitivity to beta-eiemene of electrotransferred ovarian cancer stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(28): 4149-4154.

图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年1月至2015年6月在武汉大学动物实验中心完成。

1.3 材料 人卵巢癌肿瘤干细胞(中国科学院上海细胞研究所)；DMEM培养液、胎牛血清(美国Gibco公司)；胰蛋白酶(美国Hyclone公司)；RNA提取试剂Trizol、质粒提取试剂盒(厦门百维信生物科技有限公司)；DNA凝胶纯化回收试剂盒(美国Hyclone公司)；AMV反转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；RT-PCR两步法试剂盒(美国Klontech公司)；RNA干扰序列(北京赛百盛基因技术有限公司)；cDNA合成试剂盒(大连宝生物公司合成)；siRNA基因片段(上海闪晶生物公司设计并合成)；兔抗人ABCE1多克隆抗体(美国SABC公司)；HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(美国Thermo公司)；β-榄香烯乳(大连华立金港药业有限公司)；流式细胞仪(美国Biorad公司)；生物倒置显微镜(日本TOYOBO公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 ABCE1的siRNA序列设计合成及转染 ABCE1 siRNA序列根据参考文献[12]设计，由上海闪晶生物公司设计合成，其正义链为：5’-ATC CGC TAC AGC GAG TAC GTT TAC CTG TGA AGC CAC AGA TGG GGT AAA CGT ACT CGC TTA GCT TTT TTG-3’；反义链为：5’-AAT FCA AAA AAG CTA CAG CGA GTA CGT TTA CCC CAT CTG TGG CTT CAC AGG TAA ACG TAC TCG CTG TAG CG-3’。阴性对照siRNA正义链为：5’-GAT CCG CGA GAC CTC AGT ATG TTA CCT GTG AAG CCA CAG ATG GGG TAA CAT ACT GAG GTC TCG CTT TTT TG-3’；反义链为：5’-AAT TCA AAA AAG CGA GAC CTC AGT ATG TTA CCC ATC TGT GGC TTC ACA GGT AAC ATA CTG AGG TCT CGC G-3’。卵巢癌肿瘤干细胞接种于含体积分数为10%小牛血清的DMEM培养基，放置于37 ℃，体积分数为5%CO₂的饱和湿度培育箱中进行培养，每隔2 d传代1次，选取对数生长期的细胞制成单细胞悬液，胰酶消化，PBS清洗，离心，收集肿瘤干细胞，用电穿孔缓冲液重悬，离心(800×g)，静置5 min，清洗细胞3次，重悬于电转液中，离心，转移至电击杯，加入20 μg的质粒DNA混匀，置于冰上30 min，以电容25 μF，电压350 V/cm，时间常数T为0.9 ms的电转化参数，进行电穿孔。转染ABCE1的肿瘤干细胞在室温中放置30 min，接种于含1%双抗、体积分数为10%小牛血清的DMEM培养基的培养皿中，放置于37 ℃，体积分数为5%CO₂的饱和湿度培育箱中进行培养。

细胞分为3组：未转染的卵巢癌肿瘤干细胞为空白组，转染NC siRNA载体的卵巢癌肿瘤干细胞为对照组，电转染ABCE1-siRNA载体的卵巢癌肿瘤干细胞为实验组。

1.4.2 RT-PCR检测ABCE1 mRNA的表达 收集各组生长状态良好的卵巢癌肿瘤干细胞，在4 ℃下离心，弃去上清液，PBS冲洗3遍，运用TRIzol法提取总RNA，按cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA。ABCE1基因序列设计特异性引物，ABCE1引物序列：上游5’- TTG GTT GTG GGA AGT CGT-3’，下游5’-GCT TAT GTA GTT AAT GGG AGG T-3’，扩增产物为415 bp；GAPDH引物序列：上游5’-GAG TCA ACG GAT TGG TCG T-3’，下游5’-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3’，扩增产物为185 bp。PCR反应条件为94 ℃变性35 s，93 ℃变性5 min，77 ℃延伸26 s，53 ℃退火32 s，33个循环周期后，71 ℃延伸6 min，5℃下保存产物。取5 mL PCR产物经2%琼脂糖凝胶进行电泳(152 V，90 min)，电泳后放置于GDSS000凝胶自动成像仪上拍照并保存图像，用ABCE1/GAPDH比值表示ABCE1 mRNA的相对表达量。

1.4.3 Westem blot检测ABCE1蛋白的表达 收集每组生长状态良好的卵巢癌肿瘤干细胞1×10⁶个，弃培养液，PBS冲洗3次，加入含有PMSF的裂解液充分裂解细胞，4 ℃下离心，提取总蛋白，使用BCA法测定蛋白质浓度，吸取50 μg总蛋白进行10%SDS-PAGE电泳，电转移到PVDF膜上，封闭于5%脱脂奶粉FIBS液中，37 ℃孵育2 h，加入1∶1 000稀释的ABCE1多克隆一抗，4 ℃下孵育过夜，TBST洗膜5次，每次5 min，加入1∶5 000 HRP标记的二抗孵育，PBS洗涤，ECL显色，于暗室内曝光X射线片，运用GDSS000凝胶自动成像系统摄像，漂洗干燥后避光保存。运用Image-Pro Plus 8.0软件对条带灰度值进行分析，以ABCE1/GAPDH比值表示ABCE1蛋白的相对表达量。

1.4.4 流式细胞仪检测卵巢癌肿瘤干细胞周期变化 收集每组生长状态良好的卵巢癌肿瘤干细胞，体积分数为70%乙醇固定后重悬，调整细胞浓度为1×10⁶ L^-¹，PBS冲洗2遍，与含50 mg/L RNA酶的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)共同孵育30 min，采用碘化丙啶染色，置于暗室中1 h，流式细胞仪检测细胞周期分布。

1.4.5 MTT实验检测干扰ABCE1基因后卵巢癌肿瘤干细胞对β-榄香烯乳的敏感性 卵巢癌肿瘤干细胞转染干扰质粒48 h后，收集未转染与转染的肿瘤干细胞，将其接种于96孔板，每个样本设3个复孔，当细胞贴壁后加入不同浓度的β-榄香烯乳(2.5，5，10，20 μmol/L)培养48 h，每孔加5 g/L的MTT 20 μL，孵箱4 h后，加入 200 μL二甲基亚砜振荡15 min，使用全自动酶标仪检测490 nm处的吸光度值。抑制率(%)=(A_对照组-A_实验组)/(A_对照组- A_空白组)×100%。

1.4.6 平板克隆实验检测干扰ABCE1基因后卵巢癌肿瘤干细胞对β-榄香烯乳的敏感性 卵巢癌肿瘤干细胞转染干扰质粒48 h后，收集未转染和转染的肿瘤干细胞，接种于6孔板，每个样本设3个复孔，细胞贴壁后加入不同浓度的β-榄香烯乳(2.5，5，10，20 μmol/L)培养7 d，去掉培养液，PBS洗2遍，体积分数为95%乙醇固定10 min，吉姆萨染液染色10 min，自来水冲洗并晾干，使用Quantity One软件计算克隆数。克隆形成抑制率(%)=1-(实验组克隆数/对照组克隆数)×100%。

1.5 主要观察指标 ①RT-PCR检测ABCE1 mRNA的表达；②Westem blot检测ABCE1蛋白的表达；③流式细胞仪检测卵巢癌肿瘤干细胞周期变化；④MTT实验检测干扰ABCE1基因后卵巢癌肿瘤干细胞对β-榄香烯乳的敏感性；⑤平板克隆实验检测干扰ABCE1基因后卵巢癌肿瘤干细胞对β-榄香烯乳的敏感性。

1.6 统计学分析 使用SPSS 15.0软件包处理。计量资料用x(_)±s表示，两组间的连续变量进行t 检验，多组间变量进行单因素方差分析、q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

基因治疗肿瘤是实验研究中的一个热点问题，目前卵巢癌的临床治疗效果欠佳，因此选择高效率的治疗方法对防治卵巢癌的发展尤为重要。从中国传统中药中寻求抗肿瘤新药物，以降低药物的毒副作用、提高患者的疗效，是重要策略之一。ABCE1属于ATP结合盒转运子基因亚家族的成员，与细胞生长、发育和增殖、分化有密切关联，其在人体各组织器官中均持续表达^[13-15]。相关研究表明，在肿瘤细胞系中抑制ABCE1的表达能够显著抑制癌细胞的生长^[16]。理论上理想的治疗基因应有效地抑制肿瘤细胞生长，因此如能阻断肿瘤细胞中ABCE1的表达，通过抑制细胞内核糖核酸酶L的活性来抑制细胞凋亡，参与肿瘤细胞的增殖分化、侵袭、迁移及蛋白质的合成，就可以抑制肿瘤的发展，这为肿瘤的治疗提供了新的有效方法^[17]。

实验通过RT-PCR及Western blot检测RNA干扰卵巢癌肿瘤干细胞ABCE1的mRNA及蛋白的表达，研究结果显示，siRNA-ABCE1干扰卵巢癌肿瘤干细胞后，下调了ABCE1 mRNA及蛋白的表达，提示了siRNA干扰可以抑制ABCE1 mRNA及蛋白的表达。通过流式细胞仪检测其细胞周期，研究结果表明实验组的细胞增殖明显受到抑制，说明siRNA干扰ABCE1基因作用具有高效性；空白组、对照组的细胞增殖差异无显著性意义，表明转染空载质粒及未转染的肿瘤干细胞毒性作用较轻微。通过MTT法和细胞克隆形成实验法分析结果得知，ABCE1基因沉默后实验组的肿瘤干细胞对β-榄香烯乳的敏感性显著性增强。

在卵巢癌治疗过程中，多数患者随着疗程的增加，会对化疗药物产生耐药反应，有的患者甚至出现多药耐药，进而导致肿瘤复发。对卵巢癌较为敏感的紫杉醇是临床应用的主要化疗药物，但其所产生的耐药反应亦成为卵巢癌治疗的难点之一^[18-20]。β-榄香烯乳是从姜科植物莪术中提取的有效抗癌成分，是中国自行研制出的一种新型抗癌中药药物^[21-24]。大量实验研究证明，β-榄香烯乳具有疗效稳定、毒副作用少、抗癌谱广等优点，其临床应用较为广泛^[25-27]。β-榄香烯乳治疗卵巢癌的可能作用机制是诱发肿瘤细胞凋亡，使肿瘤细胞的生长受到阻滞^[28-30]。

综上所述，沉默ABCE1基因电转染入卵巢癌肿瘤干细胞，可为卵巢癌的治疗提供新的策略。此外提高β-榄香烯乳的化疗敏感性能有效提高患者的生存率，也为临床中药化疗增敏剂的应用提供理论依据。