兔骨膜细胞分离培养的方法改进

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.24.004

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
骨膜：是骨表面除关节外所被覆的坚固的结缔组织包膜。在骨端和肌腱附着部位，非常致密地附着在骨上。其他部位的骨膜厚，容易从骨上剥离。
细胞分离技术：包括离心技术、流式细胞术和细胞电泳。离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。细胞电泳是指在一定pH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动。

摘要
背景：近年来，骨膜作为细胞治疗的种子细胞来源，因其自身的优越性而备受关注。
目的：探讨兔骨膜细胞分离培养的最佳方法及其生物学特性。
方法：无菌条件下取出兔胫骨内侧面骨膜，以Ⅱ型胶原酶消化结合组织块贴壁法分离培养兔骨膜细胞，置于DMEM/F12完全培养基培养。倒置显微镜观察细胞形态；CCK-8法检测骨膜细胞增殖活性，绘制细胞生长曲线图；流式细胞仪检测细胞表型CD90、CD105；成骨诱导培养基诱导骨膜细胞成骨分化，2周后茜素红染色检测钙结节沉积；成脂诱导培养基诱导骨膜细胞成脂分化，2周后油红O染色检测脂滴颗粒。
结果与结论：①Ⅱ型胶原酶消化结合组织块贴壁法原代培养耗时短，提高了组织块成活率；Ⅱ型胶原酶消化结合组织块贴壁法获得的骨膜细胞纯度较高，增殖能力强，呈梭形旋涡状或平形状生长，茜素红染色、油红O染色证实骨膜细胞具有多向分化潜能；②结果表明，Ⅱ型胶原酶消化结合组织块贴壁法能够在较短时间内获得高纯度的骨膜细胞，且增殖能力强，细胞具有多向分化能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-3059-6875(张峻玮)

关键词: 组织构建, 骨细胞, 骨膜细胞, 分离培养, Ⅱ型胶原酶, 细胞分化

Abstract:

BACKGROUND: Periosteum is considered as a source of seed cells for cell therapy due to its biological features.
OBJECTIVE: To seek the optimal way to isolate and culture rabbit periosteal cells and identify their biological features.
METHODS: Rabbit periosteum on facies medialis tibiae was taken out under aseptic conditions. Periosteal cells isolated through the digestion of type II collagenase with the explants culture method were cultured in DMEM/F12 complete medium. Cell ultrastructure was observed under an inverted microscope. Periosteal cell proliferation was determined by cell counting kit-8 assay. Cell surface antigens CD90 and CD105 were determined using flow cytometry. Osteogenic and lipogenic induction mediums were applied to induce periosteal cells to differentiate into osteocytes and adipocytes, respectively. After 2 weeks of induction, cells were harvested for alizarin red staining and oil red O staining to assay the calcium nodules and lipid droplet.
RESULTS AND CONCLUSION: The digestion of type II collagenase with the explants culture method shortened the period of primary cells culture and enhanced the survival rate, which caused higher purity and stronger reproductive activity of harvested periosteal cells. Primary cultured periosteal cells grew in form of spindle spiral or parallel. Alizarin red and Oil red O staining verified the multi-directional differentiation potentiality of periosteal cells. These findings suggest that the periosteal cells with high purity, strong reproductive activity, and multi-directional differentiation potentiality can be harvested in short time using digestion of type II collagenase with the explants culture method.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Periosteum, Cell Separation, Collagenases, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点实验于2014年9月至2015年6月在徐州医学院附属医院中心实验室完成。

1.3 材料

实验动物：6月龄新西兰大白兔购自徐州医学院实验动物中心，许可证号：SCXK(苏)2005-0005。

实验试剂及仪器：DMEM/F12培养基(Thermo，美国)，DMEM(HG)培养基(Thermo，美国)，青/链霉素(碧云天生物技术研究所)，胎牛血清(Hyclone，北美)，磷酸盐缓冲液PBS(北京中杉金桥生物技术有限公司)，0.25%胰蛋白酶(碧云天生物技术研究所)，Ⅱ型胶原酶(碧云天生物技术研究所)，地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、吲哚美辛(Sigma，美国)，CCK-8试剂盒(上海七海复泰生物科技有限公司)，CD90、CD105鼠抗兔抗体(BD，美国)，茜素红(合肥博美生物科技公司)，油红O染色(合肥博美生物科技公司)，Tritonx-100 (Biosharp公司)，多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司)，YMT-Z型倒置显微镜(Olympus，日本)，HTS 700型酶联免疫检测仪(TOSHIBA，日本)，流式细胞仪(BD，美国)，CO₂培养箱(Thermo，美国)低氧培养箱，高速离心机，电子天平等。

1.4 实验方法

1.4.1 兔骨膜细胞的分离培养取6月龄新西兰大耳白兔，耳缘静脉注射麻醉后，无菌条件下，分离、剥开肌肉及周围组织，暴露胫骨，仔细剥离附着的软组织，无菌条件下，切取胫骨上段内侧面骨膜，PBS冲洗3-5次，用眼科剪将骨膜剪成1 mm×1 mm大小组织块，2 g/L Ⅱ型胶原酶消化20 min，PBS洗涤3遍后种植于培养瓶中。培养瓶中加入DMEM/F12完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL)，于体积分数5%CO₂、37 ℃恒温培养箱内培养，第5天首次换液，并观察贴壁组织周围的细胞生长情况，细胞融合单层达80%-90%后用胰酶消化传代培养，相差显微镜下观察细胞的生长形态变化。

1.4.2 兔骨膜细胞的传代培养兔骨膜细胞培养7 d时融合超过90%，将培养瓶移入无菌操作台中，轻轻倒去旧培养基，加入2 mL PBS漂洗细胞表面2次后倒去，经0.25%(2.5 g/L)胰蛋白酶消化，轻轻摇晃培养瓶，消化过程中将培养瓶放置于倒置相差显微镜下观察，见贴壁细胞胞质回缩，形状逐渐趋于圆形时立即加入含血清的DMEM/F-12培养基2 mL终止消化，然后用巴氏吸管轻轻吹打瓶壁细胞，制成细胞悬液。移至15 mL无菌离心管中，以1 200 r/min离心5 min，弃上清。反复漂洗两三次，以去除细胞碎片。最后加少许新鲜培养基将沉淀细胞轻轻吹打均匀，即可获得单细胞悬液，按1∶2的比例，将细胞接种于含10%FBS DMEM/F12培养基(含青霉素100 U /mL，链霉素100 U /mL)的培养瓶中，再次置于37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度恒温培养箱进行单层细胞培养。每两三天换液1次，每日在显微镜下观察细胞形态及数量变化。传代2次后兔骨膜细胞基本纯化，取第3代兔骨膜细胞进行实验。

1.4.3 骨膜细胞生长曲线绘制第3，5，7代骨膜细胞以同等细胞浓度1×10⁷ L^-1接种于96孔培养板内，每孔200 μL，每组6孔，于37 ℃、体积分数5%CO₂恒温培养箱内培养。每天同一时间点随机抽取6孔，每孔加CCK-8(5 g/L)20 μL。用酶标仪(波长492 nm)测定各孔吸光度值(A值)。取6孔吸光度的均值，以时间(d)为横坐标，吸收值(A值)为纵坐标，绘制生长曲线图，实验重复3次。

1.4.4 流式细胞仪鉴定细胞表面标记物胰蛋白酶消化收集第3代骨膜细胞。PBS重悬细胞，调整细胞浓度至1×10⁸L^-1，分别滴加CD90、CD105鼠抗兔抗体，室温下反应30 min，PBS洗涤2次，滴加异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的二抗后避光条件下孵育30 min，洗涤重悬至0.5 mL，使用流式细胞仪进行检测。

1.4.5 成骨、成脂诱导分化对于成骨诱导分化，将第3代骨膜细胞以1×10⁷ L^-1的细胞浓度接种于24孔板内，细胞贴壁后去掉原培养基，加入含有体积分数为10%胎牛血清、0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L甘油磷酸钠、50 μmol/L抗坏血酸的DMEM/F12成骨诱导培养液进行诱导培养^[9]，每隔3d换1次液，诱导2周，当观察到有圆形钙化结节形成时用茜素红染色鉴定，茜素红染色：骨膜细胞成骨诱导培养2周后取出，弃培养基后用PBS清洗细胞2遍，40 g/L多聚甲醛固定30 min，2%茜素红染液室温孵育20 min，吸去多余染料，PBS清洗2遍，置于倒置显微镜系统成像；对于成脂诱导分化，将第3代骨膜细胞以1×10⁷L^-1的细胞浓度接种于24孔板内，细胞贴壁后去掉原培养基，加入含体积分数为10%胎牛血清、1 μmol/L地塞米松、10 mg/L胰岛素、200 mmol/L吲哚美辛的DMEM(HG)成脂诱导培养液进行诱导培养^[10]，每隔3 d换1次液，诱导2周。当观察到胞质中脂滴形成时用油红O染色鉴定。油红O染色：骨膜细胞成脂诱导培养2周后取出，弃培养基后用PBS清洗细胞2遍，40 g/L多聚甲醛固定30 min，油红O染色30 min，于倒置显微镜下观察、拍照。

1.5 主要观察指标倒置相差显微镜下观察细胞形态；流式细胞仪检测细胞表型标志物；CCK-8法检测细胞增殖能力；茜素红染色鉴定细胞成骨分化能力；油红O染色鉴定细胞成脂分化能力。

讨论

间充质干细胞自我更新能力强，具有多系分化潜能，是目前组织工程和细胞替代治疗研究中重要的种子细胞来源^[11-13]。骨髓间充质干细胞作为组织工程中最早发现并且研究最深入的种子细胞，尽管在基础研究领域取得了重大进展，但始终未能在临床上获得广泛应用。这主要是因为：骨髓间充质干细胞的主要来源为成人骨髓，其细胞数量及增殖分化潜能随供者年龄的增大而下降^[1]，骨髓间充质干细胞的分化方向不易控制，体外培养更易向脂肪细胞分化；骨髓间充质干细胞的采集须行骨髓穿刺术，来源受到限制。因此，寻找更好的种子细胞来源成为组织工程研究的热点。与骨髓间充质干细胞相比，体外培养的骨膜细胞增殖能力强^[14]，分化潜能不随着年龄增加而丧失，体外培养表现出较强成骨、成软骨能力^[15-17]。因此骨膜细胞可能比骨髓间充质干细胞更适合作为组织工程的种子细胞用于修复损伤^[18-19]。

骨膜细胞具有较强的自我更新和分化潜能，大量的骨膜细胞位于骨膜生发层，骨膜细胞是一种混杂细胞群，包括骨祖细胞、成骨前体细胞、软骨前体细胞等^[20-21]。体外分离培养其中高纯度的具有较强的多向分化潜能的细胞是关键。目前，骨膜细胞体外分离方法主要是组织块贴壁法，此法获得细胞成分较为单一，但成功率不高，而且细胞增殖慢，原代培养耗时长^[22-23]。本实验采用Ⅱ型胶原酶消化结合组织块贴壁法，利用Ⅱ型胶原酶短时(20 min)预消化，将骨膜组织块分散，细胞容易大量释放，迅速贴附伸展，细胞融合单层快，原代培养时间明显缩短，贴壁第3天，开始有细胞从组织块边缘爬出，细胞呈细小梭形、三角形贴壁生长，培养5 d左右组织块周围爬出细胞明显明显增多，传代后细胞形态均一，增殖速度加快，呈平行排列生长或旋涡状生长。

多位学者利用流式细胞技术对骨膜细胞表型分析研究，发现其中CD90和CD105是骨膜细胞重要表面抗原^[24-26]。本实验利用流式细胞仪对原代骨膜细胞表面抗原物质分析，结果显示分离培养的骨膜细胞表型均一，细胞表达CD90(56.1%)，CD105(52.9%)，这与相关学者的研究相一致，说明获得的骨膜细胞纯度较高，由于CD90和CD105是间充质干细胞表面抗原标志物之一^[27-30]，这表明获取的骨膜细胞具有间充质干细胞的特征^[31]。根据CCK-8法绘制细胞生长活力曲线可以发现所检测第3，5，7代骨膜细胞潜伏期较短，仅为一两天，对数生长期细胞分裂增殖显著，群体倍增时间约为2 d，均具有较强的增殖能力；同时本实验对获得的骨膜细胞的分化多向性进行了验证，成骨、成脂诱导2周后分别用茜素红染色和油红O染色检测到了钙盐沉积和脂滴颗粒，这说明本实验获得的骨膜细胞符合间充质干细胞多向分化潜能的特性^[32]。

实验对兔骨膜细胞分离培养的方法进行了改进，能够在较短时间内获得高纯度的骨膜细胞，且增殖能力强，细胞具有多向分化能力。骨膜细胞作为种子细胞在细胞替代治疗方面拥有巨大的应用前景，实验所用的这种改进的骨膜细胞分离培养方法，能够为组织工程研究和应用提供快速、稳定的细胞来源。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程