人脐带间充质干细胞分离鉴定及移植后对肺癌小鼠化疗的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.017

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (23): 3457-3463.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.017

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人脐带间充质干细胞分离鉴定及移植后对肺癌小鼠化疗的影响

郑天亮¹，赵松¹，郭海周¹，崔广晖¹，林大维²

1郑州大学第一附属医院胸外一科，河南省郑州市 450052
2郑州大学医学院，河南省郑州市 450001

收稿日期:2016-05-05 出版日期:2016-06-03 发布日期:2016-06-03
通讯作者: 郑天亮，郑州大学第一附属医院胸外一科，河南省郑州市 450052
作者简介:郑天亮，1986年生，男，汉族，河南省信阳市人，主治医师，博士，主要从事胸部良恶性疾病的外科治疗及综合治疗研究。
基金资助:
国家自然科学基金(82541044)

Human umbilical cord mesenchymal stem cells: isolation, identification and transplantation combined with chemotherapy for lung cancer in mice

Zheng Tian-liang¹, Zhao Song¹, Guo Hai-zhou¹, Cui Guang-hui1, Lin Da-wei²

1First Department of Thoracic Surgery, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
2Medical College of Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, Henan Province, China

Received:2016-05-05 Online:2016-06-03 Published:2016-06-03
Contact: Zheng Tian-liang, First Department of Thoracic Surgery, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
About author:Zheng Tian-liang, M.D., Attending physician, First Department of Thoracic Surgery, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 82541044

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脐带间充质干细胞：是一类发育早期具备全能细胞特点的造血干细胞此外的另一类细胞，具有自我更新、多向分化潜能，细胞能调节机体免疫，而在脊髓损伤、糖尿病足以及免疫性疾病中得到应用。
肺癌化疗：其在肺癌的治疗中发挥不可替代的地位，随着化疗药物的不断发展以及不同药物的联合使用，使得肺癌患者生存期得到进一步延长。但是，化疗药物在杀灭肿瘤、抑制癌细胞增殖的同时对正常组织也会出现不同程度的损害，尤其是对于分裂增殖较快的细胞，导致患者治疗依从性较差，毒副反应发生率较高。

摘要
背景：间充质干细胞具备多向分化潜，能促进细胞植入和免疫调节，研究人脐带间充质干细胞分离鉴定方法及移植后对肺癌小鼠化疗的影响能为肺癌治疗提供新的思路。
目的：观察人脐带间充质干细胞分离、鉴定方法及移植后对肺癌小鼠化疗的影响。
方法：取新鲜的新生儿脐带，利用组织块培养法和酶消化法分离、鉴定人脐带间充质干细胞。将Balb/C裸小鼠肺癌模型20只，随机分为化疗组和人脐带间充质干细胞移植组，两组均给予化疗治疗，人脐带间充质干细胞移植组化疗期间联合移植人脐带间充质干细胞治疗。
结果与结论：①瘤质量、肠黏膜组织形态及血常规指标：与单纯化疗的肺癌模型小鼠相比，人脐带间充质干细胞移植组胃肠道红润、有光泽，肠黏膜光滑、完整，瘤质量和血常规指标稳定(P < 0.05)；②结果证实：通过组织块培养法和酶消化法能获得成熟的人脐带间充质干细胞，与化疗联合应用可明显减少胃肠道的损害，稳定外周血象。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-3339-7895(郑天亮)

关键词: 干细胞, 移植, 人脐带间充质干细胞, 分离, 鉴定, 肺癌, 化疗, 组织块培养法, 酶消化法, 毒副反应, 应用价值, 苏木精-伊红染色, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells have pluripotent differentiation, and can promote cell engraftment and immune regulation. Therefore, we attempt to use human umbilical cord mesenchymal stem cells as a new source for treatment of lung cancer by exploring cell isolation, identification and transplantation combined with chemotherapy for lung cancer in mice.
OBJECTIVE: To investigate the isolation and identification of human umbilical cord mesenchymal stem cells and its transplantation combined with chemotherapy for lung cancer in mice.
METHODS: Human umbilical cord mesenchymal stem cells were isolated from fresh umbilical cord of newborns and identified using tissue culture and enzyme digestion. Twenty Balb/C nude mouse models of lung cancer were randomly divided into two groups: mice in chemotherapy group were given chemotherapy, and those in combined group given combination of chemotherapy with human umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the chemotherapy group, the gastrointestinal tract was rosy and shiny, intestinal mucosa was smooth and complete, and tumor mass and blood indexes significantly decreased in the combined group (P < 0.05). To conclude, mature human umbilical cord mesenchymal stem cells can be obtained by tissue culture and enzyme digestion, and the cell transplantation combined with chemotherapy can significantly reduce gastrointestinal tract damage and the make peripheral hemogram in a stable level.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Lung Neoplasms, Umbilical Cord, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

郑天亮，赵松，郭海周，崔广晖，林大维. 人脐带间充质干细胞分离鉴定及移植后对肺癌小鼠化疗的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(23): 3457-3463.

Zheng Tian-liang, Zhao Song, Guo Hai-zhou, Cui Guang-hui, Lin Da-wei. Human umbilical cord mesenchymal stem cells: isolation, identification and transplantation combined with chemotherapy for lung cancer in mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(23): 3457-3463.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 实验中的Balb/C裸小鼠20只全部进行结果分析数量，中途无脱落。

2.2 人脐带间充质干细胞形态：人脐带间充质干细胞培养7 d后细胞开始贴壁生长，到13 d融合80%-90%。在显微镜下细胞呈现长梭形，单核，传代后细胞形态趋于一致，呈现放射或旋涡状排列，见图1。
2.3 人脐带间充质干细胞生长情况 人脐带间充质干细胞第3，5，8代细胞总体呈现上升增殖现象，但是随着代数的不断增加，人脐带间充质干细胞增殖能力出现下降，见表1。

2.4 不同生长因子对人脐带间充质干细胞增殖的影响 人脐带间充质干细胞加入生长因子后，表皮细胞生长因子以及肝细胞生长因子能进一步促进细胞增殖(P < 0.05)，而成纤维细胞生长因子和空白对照组的细胞增殖并不明显，见表2。

2.5 人脐带间充质干细胞对Balb/C裸小鼠肺癌生长的影响 在第21天时断颈处死小鼠，剥离腋下瘤体大小及肺癌生长曲线变化均差异无显著性意义(P > 0.05)。化疗组瘤质量为(4.59±1.45) g，人脐带间充质干细胞移植组瘤质量为(4.16±1.13) g，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.6 人脐带间充质干细胞对化疗后小鼠胃肠道的影响 大体观察人脐带间充质干细胞移植组小鼠胃肠道红润、有光泽，而化疗组胃肠道苍白；病例切片苏木精-伊红染色下，化疗组肠黏膜断裂、脱落，而人脐带间充质干细胞移植组光滑、完整，见图2。

2.7 两组Balb/C裸小鼠治疗后血清学指标比较 人脐带间充质干细胞移植组经过化疗后Balb/C裸小鼠治疗后相关血清学指标均显著低于化疗组(P < 0.05)，见表3。

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引言

肺癌已经成为威胁人类健康的恶性肿瘤，随着中国人口老龄化日益加剧及环境污染的严重化，导致肺癌发病呈现上升趋势。

文献报道显示：中国肺癌死亡率男性位居首位，而女性肺癌死亡率已经超过乳腺癌^[1]。目前，对于肺癌的治疗方法相对较多，包括手术治疗、放化疗、生物治疗，这些方法虽然能延长寿命，改善生存质量，延长生存期。但是，长期疗效欠佳，难以达到预期的治疗效果^[2-3]。

化疗是肺癌治疗中最典型的治疗方法，该方法能直接杀死癌细胞，快速改善患者症状^[4-5]。但是，化疗药物在杀灭癌细胞的同时对正常细胞也会产生明显的影响，药物毒不良反应较高，对患者创伤较大，导致治疗依从性较差^[6-7]。因此，肺癌患者治疗过程中如何采取积极有效的措施降低毒副反应，提高机体免疫和生存率成为研究重点^[8-9]。

人脐带间充质干细胞是一类发育早期具备全能细胞特点的造血干细胞以外的另一类细胞，具有自我更新、多向分化潜能，细胞能调节机体免疫，而在脊髓损伤、糖尿病足以及免疫性疾病中得到应用^[10-11]。人脐带间充质干细胞由于来源广泛，取材方便，对供者无不利影响，且不涉及伦理道德限制问题，具备广阔的应用前景^[12-13]。

相关研究显示，间充质干细胞对肿瘤的影响与多种因素关系密切，当采用组织学类型肿瘤、不同荷瘤动物以及间充质干细胞输注时间不同时，实验得出的结论也可能不同^[14-15]。因此，临床上研究利用人脐带间充质干细胞的分离鉴定方法及对肺癌小鼠化疗的影响能为肺癌治疗提供新的思路^[16-17]。

文章以此观察人脐带间充质干细胞分离、鉴定方法，探讨人脐带间充质干细胞对肺癌小鼠化疗的影响。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2013年10月至2015年12月郑州大学第一附属医院完成。

1.3 材料

实验动物：清洁级Balb/C裸小鼠20只，周龄2-7周，雌雄不限，实验动物均由郑州大学第一附属医院动物实验中心提供，饲养严格遵守相关标准进行饲养，合格证号：SCXK(豫)2007-0010。

对小鼠进行等条件喂养，处理符合《关于善待实验动物的指导下意见》中相关规则^[18-19]。采用随机对照方法将Balb/C裸小鼠分为化疗组和人脐带间充质干细胞移植组，每组10只。

脐带：经产妇知情同意，由医院提供健康新生儿脐带，采集后放入含双抗的生理盐水中，带回实验室进行消毒处理后实验。

1.4 实验方法

1.4.1 人脐带间充质干细胞分离、鉴定 取新鲜脐带，放入体积分数0.1%双抗的生理盐水中带回实验室。将脐带浸泡在乙醇5 min，采用碘酒擦拭、消毒，再次采用生理盐水冲洗脐带外周血块，将其清理干净。去除脐带膜，将其剪成2 cm节段，去除脐带静脉、动脉，并采用生理盐水将血块去除，整个操作过程中在生理盐水中进行，处理时必须严格遵循无菌操作，将其作为原代细胞，采用组织块法、酶消化法获得间充质干细胞^[20-21]。①组织块培养法：将已经除去静脉和动脉的华通氏剪成0.5 cm小块，将其放置在37 ℃培养箱中1 h，使得组织块紧贴在培养皿上。将华通氏胶接种在培养皿上，沿着培养皿加入体积分数10%-15%的胎牛血清DMEM/F12培养液，放入培养箱中进行培养，每隔3 d换液1次，培养7-14 d，待细胞浓度融合80%时开始传代培养。②酶消化培养法：将组织块检查1 mm³大小，然后均匀铺在瓶底，加入胶原酶Ⅱ型进行消化，放置培养箱内1 h。消化过后，采用200目筛网过滤，加入生理盐水进行洗涤，然后加入体积分红15%的血清的DMEM/F12培养液进行培养。取对数生长周期细胞，加入体积分数0.25%胰蛋白酶以及EDTA混合悬液进行消化，待细胞质回缩后终止消化，制备培养液重悬，放入冰箱中待用。取对数生长细胞，制备细胞悬液，调节细胞浓度为5×10⁶ L^-¹，并将其接种在24孔板，加入表皮细胞生长因子，成纤维细胞生长因子，肝细胞生长因子，并设置空白对照组，观察生长因子对细胞生长的影响^[22-23]。

1.4.2 Balb/C裸小鼠肺癌模型建立及处理 入选Balb/C裸小鼠均禁食12 h，手术前肌肉注射阿托品0.5 g，采用3.6%水合氯醛进行全身麻醉，待麻醉生效后进行消毒、铺巾，轻拉舌，压迫舌腹部，充分暴露喉头^[24-25]。在解剖显微镜下插入塑料管针，向Balb/C裸小鼠气管内注入细胞浓度为1×10⁹ IFU/L的Cpn TW-183菌液100 μL(美国Sigma公司)，注入完毕后将Balb/C裸小鼠直立、旋转并轻轻按压胸部，保证菌液分布在肺部2次，每周1次，连续干预2个月，建立Balb/C裸小鼠肺癌模型。经过CT或肿瘤标记物检测小鼠得到确诊，表明肺癌模型建立成功。

小鼠肺部模型建立7 d后对两组小鼠进行治疗。两组小鼠均给予化疗治疗，在大鼠接瘤后开始给予阿霉素化疗药物，以2 mg/kg腹腔注射给药，连续使用3 d，第4天人脐带间充质干细胞移植组治疗期间联合植入细胞浓度为1×10¹⁰ L^-¹人脐带间充质干细胞悬液，每只Balb/C裸小鼠接种0.2 mL细胞悬液，接种时间为第7，12，17天，第21天处理Balb/C裸小鼠进行观察^[26-27]。

1.5 主要观察指标 ①细胞形态。取人脐带间充质干细胞，将其放置在玻璃皿上，在倒置显微镜下观察人脐带间充质干细胞形态。②观察人脐带间充质干细胞生长动力学检测结果。取对数生长期细胞，制备单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁶ L^-¹接种24孔板，第3天开始取3孔计数，取平均值。③观察人脐带间充质干细胞加入生长因子后细胞增殖情况。取对数生长期细胞，制备单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁶ L^-¹接种于24孔板，实验分4组，每组分别加入1，3，5 mL的成纤维细胞生长因子，表皮细胞生长因子及肝细胞生长因子后使得最终质量浓度均为20 g/L，对照空白组不加入因子正常培养，每组取3孔计数，取平均值，实验重复3次。④观察人脐带间充质干细胞对化疗后小鼠胃肠道的影响。⑤观察两组Balb/C裸小鼠治疗后血清学指标水平^[28-29]。采集两组小鼠静脉血3 mL，采用全自动生化分析仪测定小鼠血象水平。

1.6 统计学分析 采集数据采用SPSS 18.0软件进行数据处理，计量资料采用x(_)±s表示，组间数据差异的比较采用t 检验和χ²检验，P < 0.05提示有显著性意义。

讨论

肺癌发病率较高，且发生率近年来呈现上升趋势和年轻化趋势，成为全球第一癌症杀手^[30-31]。目前，对于肺癌更多的以手术、放化疗。生物治疗等为主，不同的治疗方案均有其优缺点。

化疗作为治疗肿瘤最为重要的手段之一，在肺癌的治疗中发挥不可替代的地位，且随着化疗药物的不断发展以及不同药物的联合使用，使得肺癌患者生存期得到进一步延长^[32-33]。但是，化疗药物在杀灭肿瘤、抑制癌细胞增殖的同时对正常组织也会出现不同程度的损害，尤其是对于分裂增殖较快的细胞，导致患者治疗依从性较差，毒副反应发生率较高^[34-35]。因此，临床上采取积极有效的药物延长肺癌患者生存期，改善患者生存质量具有重要的意义。

间充质干细胞属于是一类特殊的细胞，该细胞是一种起源于中胚层发育早期的，具备全能干细胞特点的造血干细胞，该细胞和其他细胞相比具有自我更新、多向分化以及免疫调节等功能。相关研究显示：在人和动物中间质干细胞存在含量相对较多，广泛存在于外周血、胚胎、脐带血和骨膜等组织中^[36]。

临床应用研究显示：间充质干细胞的安全性。目前，临床上将人脐带间充质干细胞运用与各类损伤、肝硬化、股骨头坏死、系统性红斑狼疮等难治性疾病中，并取得阶段性进展。相关研究显示：间充质干细胞在机体内具备向损伤、炎症等部位迁移能力^[37]，并且细胞到达损伤部位后能自动进行修复，完成人体无法自我修复的心肌细胞和神经细胞。因此，肺癌小鼠在化疗过程植入人脐带间充质干细胞能提高机体免疫力和生活质量，从而提高患者治疗依从性^[38-39]。实验在第21天时断颈处死小鼠，剥离腋下瘤体，观察瘤体大小和肺癌生长曲线变化均差异无显著性意义，化疗组瘤质量显著大于人脐带间充质干细胞移植组。

实验选择正常免疫功能的小鼠，建立肺癌模型，采用盐酸多柔比星方案治疗，该化疗药物治疗过程中能干扰癌细胞DNA的合成，能抑制肿瘤的生长。小鼠化疗过程中植入人脐带间充质干细胞小鼠胃肠道具备良好的自我修复能力，并且能修复心肌损伤，减轻化疗药物对骨髓的抑制。

实验大体观察人脐带间充质干细胞移植组小鼠胃肠道红润、有光泽，而化疗组胃肠道苍白；病例切片苏木精-伊红染色下，化疗组肠黏膜断裂、脱落，而人脐带间充质干细胞移植组光滑、完整。对于多数化疗患者而言，骨髓抑制属于发生率较高的不良反应之一^[40-59]，患者化疗后主要以白细胞、血小板减少为主，相继引起感染、皮肤和黏膜出血等^[60]。实验中，人脐带间充质干细胞移植组经过化疗后Balb/C裸小鼠治疗后血液生化指标显著低于化疗组，由此看出：人脐带间充质干细胞不仅能改善小鼠化疗过程中的生存质量，还能稳定外周血象，提高化疗耐受性，提高治疗依从性。

综上所述，通过组织块培养法和酶消化法能获得成熟的人脐带间充质干细胞，且对肺癌小鼠化疗能产生明显的作用，修复化疗药物引起的毒副反应，具有较高的临床应用价值。

人脐带间充质干细胞分离鉴定及移植后对肺癌小鼠化疗的影响

Human umbilical cord mesenchymal stem cells: isolation, identification and transplantation combined with chemotherapy for lung cancer in mice

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