不同成脂条件下人骨髓间充质干细胞的早期成脂特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.003

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (23): 3366-3373.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.003

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不同成脂条件下人骨髓间充质干细胞的早期成脂特性

田健健¹，池颖¹，宋宝全¹，杜文静¹，韩之波¹，韩忠朝^1，2

1中国医学科学院、北京协和医学院血液学研究所血液病医院，实验血液学国家重点实验室，天津市 300020
2细胞产品国家工程研究中心，天津市 300457

收稿日期:2016-04-25 出版日期:2016-06-03 发布日期:2016-06-03
通讯作者: 韩忠朝，博士，研究员，博士生导师，中国医学科学院、北京协和医学院血液病医院血液学研究所，实验血液学国家重点实验室，天津市 300020；细胞产品国家工程研究中心，天津市 300457
作者简介:田健健，女，1986年生，河北省张家口市人，汉族，2016年北京协和医学院毕业，硕士，主要从事间充质干细胞及骨髓微环境相关的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(31470951)；国家自然科学基金重点项目(81330015)

Properties of human bone marrow mesenchymal stem cells in the early phase of adipogenic differentiation in different culture systems

Tian Jian-jian¹, Chi Ying¹, Song Bao-quan¹, Du Wen-jing¹, Han Zhi-bo¹, Han Zhong-chao^{1, 2}

1Hematonosis Hospital, Institute of Hematology, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, State Key Laboratory of Experimental Hematology, Tianjin 300020, China
2National Engineering Research Center of Cell Products, Tianjin 300457, China

Received:2016-04-25 Online:2016-06-03 Published:2016-06-03
Contact: Han Zhong-chao, M.D., Investigator, Doctoral supervisor, Hematonosis Hospital, Institute of Hematology, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, State Key Laboratory of Experimental Hematology, Tianjin 300020, China; National Engineering Research Center of Cell Products, Tianjin 300457, China
About author:Tian Jian-jian, Master, Hematonosis Hospital, Institute of Hematology, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, State Key Laboratory of Experimental Hematology, Tianjin 300020, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31470951, 81330015

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
共同前体细胞：骨髓中获得的间充质干细胞，在体外具有增殖和多向分化的能力，被认为是成骨和成脂分化的共同前体细胞。成脂和成骨过程被认为存在着一种平衡，即向成骨分化的同时抑制了成脂分化。该过程受到多种信号通路的共同作用，但最终都表现在对主要转录因子的调控上，包括PPARγ和Runx2。它们分别被认为是成脂和成骨的管家基因。
脂肪因子：脂肪组织在体内不仅起到贮存能量的作用，而且可以作为内分泌器官分泌多种生物活性成分。这些由脂肪细胞产生的生物活性分子称为脂肪因子，包括PPARγ，FABP-4，adiponectin，leptin等。它们不仅通过自分泌和旁分泌作用影响脂肪细胞的功能，而且可以分泌到血液中对能量代谢、免疫防御、成血管和脂肪代谢产生作用，以此维持机体平衡。

摘要
背景：目前骨髓间充质干细胞的成脂诱导方法众多，其主要诱导成分包含吲哚美辛或罗格列酮。各种方法均能诱导骨髓间充质干细胞成脂分化，但其成脂诱导效率和机制尚缺少相互对比。
目的：比较不同成脂诱导方法对人骨髓间充质干细胞的早期成脂效果，并探讨其成脂诱导差异的可能机制。
方法：分离培养人骨髓间充质干细胞，通过油红O染色和成脂相关基因检测，比较3种不同诱导方法对人骨髓间充质干细胞的成脂效果。在诱导早期不同时间点(0，1，3，7 d)检测成脂相关基因PPARγ，C/EBPα，Adiponectin，Leptin mRNA表达。Western blot检测成脂诱导第7天时PPARγ、C/EBPβ蛋白表达，并比较DIMI，DIMR对PPARγ-Ser273位点磷酸化作用。
结果与结论：①油红O染色和成脂相关基因检测结果显示，在骨髓间充质干细胞成脂诱导分化第7天，DIMR组成脂效果明显强于DIM组和DIMI组；②Western blot检测结果显示在成脂第7天，DIMI组PPARγ、C/EBPβ蛋白表达量高于其他组，差异有显著性意义；③DIMR组PPARγ-Ser273位点磷酸化比例低于DIMI组；④结果表明，含罗格列酮的成脂培养基DIMR对人骨髓间充质干细胞的早期成脂诱导作用最强，且该作用可能与减少PPARγ-Ser273位点磷酸化有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-2660-0402(田健健)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 罗格列酮, 人骨髓间充质干细胞, 成脂诱导分化, 吲哚美辛, PPARγ, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: There are various methods to induce adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, and the main component for adipogenic induction is indomethacin or rosiglitazone. However, there is a lack of comparative study on the induction efficiency and mechanism among these methods.
OBJECTIVE: To compare the adipogenic responses of human bone marrow mesenchymal stem cells to different induction methods, and to analyze the mechanism underlying different induction efficiency.
METHODS: After isolation and purification, the adipogenic abilities of human bone marrow mesenchymal stem cells in three different culture systems were compared by oil red O staining and lipogenic gene assay. At 0, 1, 3 and 7 days of adipogenensis, mRNA expressions of PPARγ, C/EBPα, Adiponectin and Leptin were detected. At 7 days of adipogenensis, protein expressions of PPARγ and C/EBPβ were detected by western blot assay, and effects of DIMI versus DIMR on phosphorylation of PPARγ at Ser273 were compared.
RESULTS AND CONCLUSION: Findings from oil red O staining and real-time PCR showed that DIMR significantly induced adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells compared with DIM and DIMI at 7 days of induction. Western blot showed that the protein expressions of PPARγ and C/EBPβ in the DIMI group were significantly higher than those in the DIMR and DIM at 7days of induction. In addition, the ratio of PPARγ phosphorylation at Ser273 was lower in the DIMR group than the DIMI group. To conclude, DIMR has the most potential to induce early adipogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells by weakening the phosphorylation of PPARγ-Ser273.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Adipogenesis, Indomethacin, PPAR gamma, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

田健健，池颖，宋宝全，杜文静，韩之波，韩忠朝. 不同成脂条件下人骨髓间充质干细胞的早期成脂特性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(23): 3366-3373.

Tian Jian-jian, Chi Ying, Song Bao-quan, Du Wen-jing, Han Zhi-bo, Han Zhong-chao. Properties of human bone marrow mesenchymal stem cells in the early phase of adipogenic differentiation in different culture systems[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(23): 3366-3373.

图/表（结果） 2

2.1 骨髓间充质干细胞的鉴定 经密度梯度离心法分离的人骨髓间充质干细胞贴壁培养14-20 d可达70%-80%融合，呈平行排列或漩涡样生长(图1A)；成脂诱导14 d后，经油红O染色可见被染成的红色脂滴(图1B)；成骨分化21 d后，经Von Kossa染色可见明显的黑色钙盐沉积(图1C)；采用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志物显示CD44、CD73、CD90和CD105呈阳性表达，CD14、CD19、CD34、CD45呈阴性表达(图1D)。

2.2 DIMR对骨髓间充质干细胞的成脂诱导作用明显 采用DIM，DIMI与DIMR成脂诱导方法对骨髓间充质干细胞诱导6-8 d，通过油红O染色发现，DIMR组细胞内较大脂肪滴形成，成脂程度明显高于DIM和DIMI组(图2)。

Real-time PCR检测不同时间点成脂相关基因PPARγ，adiponectin，LPL，C/EBPα，leptin及FABP4 mRNA表达，结果发现在成脂诱导早期，adiponectin，LPL mRNA表达不断增加，PPARγ、C/EBPα、leptin、FABP4 mRNA在DIMR组中3 d时表达最高(图3)。在成脂诱导第7天时，adiponectin表达在DIM组中基本不变，DIMI组和DIMR组表达明显增加，且DIMR组高于DIMI组。PPARγ和LPL mRNA在DIM、DIMI和DIMR组均明显升高，但在DIMR组增高程度高于其他两组。C/EBPα和FABP4 mRNA在诱导第7天时，DIM组基本无变化，DIMI组和DIMR组均明显增加，但两组差异不明显。Leptin mRNA在DIM、DIMI和DIMR组中均显著增高。DIMR组在成脂诱导第1天和第3天时高于其余两组，但在第7天时呈明显下降趋势。

2.3 不同方法成脂诱导后骨髓间充质干细胞成脂相关蛋白的表达 Western blot检测骨髓间充质干细胞成脂诱导分化第1，3，7天时各组PPARγ和C/EBPβ蛋白表达量。结果显示在成脂诱导第1天时，DIMI和DIMR组PPARγ表达量明显增加，DIM组无明显改变，在第3，7天时各组PPARγ蛋白表达量显著增加(图4)，差异有显著性意义(P < 0.05)。在各时间点，DIMI组均诱导表达更多的PPARγ。DIM，DIMI，DIMR组在成脂诱导第7天时，PPARγ表达量分别增加了2倍，2.8倍，2.2倍。在第7天，DIMI组与DIMR组PPARγ蛋白表达差异有显著性意义(P < 0.05)，这一结果与基因诱导表达情况不完全一致。C/EBPβ蛋白量在第3天时明显增加，第3天与第7天表达量无明显差异，但DIMI组在第3，7天时的诱导表达量显著高于其他两组，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 DIMI，DIMR对PPARγ-Ser273位点磷酸化的作用 虽然油红O染色及成脂相关基因mRNA均显示DIMR组较DIMI组有更强的诱导成脂效果，但PPARγ及C/EBPβ蛋白水平检测DIMI组对其诱导表达作用却强于DIMR组，考虑到罗格列酮作为PPARγ的强效激动剂，可直接激活PPARγ发挥作用，因而实验继续检测了DIMI、DIMR组PPARγ-Ser273的磷酸化水平，结果显示，诱导分化第7天时两组中pPPARγ-Ser273水平相似，但DIMR组pPPARγ/PPARγ比例明显低于DIMI组(图5)。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外对比观察。

1.2 时间及地点 于2015年1至11月在中国医学科学院血液学国家重点实验室完成。

1.3 材料 骨髓间充质干细胞来源于中国医学科学院血液病医院正常献髓者(均签署知情同意书)，男女比例 3︰2，中位年龄33岁(23-47岁)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离及培养 无菌抽取正常献髓者(经知情同意后提供)骨髓约5 mL，按Ficoll (1.077 g/mL)密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞。用DF12完全培养液(DMEM/F12、体积分数为10%胎牛血清、2 µmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素/链霉素)重悬分离的骨髓单个核细胞，按1×10⁵密度接种于25 cm²培养瓶中，每3 d换液1次，收集第3-5代细胞待用。

1.4.2 骨髓间充质干细胞流式鉴定 将80%融合的人骨髓间充质干细胞用0.25%胰酶消化，细胞悬液以 1 200 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗3次，再加入PBS重悬细胞，计数，每管细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，1 200 r/min离心5 min，弃上清，每管剩余100 μL PBS，打散细胞，分别加入CD14，CD19，CD34，CD45，CD44，CD73，CD90，CD105单克隆抗体，设空白对照管，4 ℃孵育30 min后，向各管加入1 mL PBS离心，重复洗细胞2次去除未标记抗体，加入400 μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。

1.4.3 骨髓间充质干细胞成骨分化及染色 骨髓间充质干细胞加入成骨诱导体系(IMDM培养基、体积分数为10%胎牛血清、0.1 μmol/L地塞米松、0.2 mmol/L 2-磷酸抗坏血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油、2 mmol/L L-谷氨酰胺和100 U/mL青霉素/链霉素)继续培养，每3 d换液1次，共诱导14-21 d，进行Von Kossa染色。步骤如下：用平衡至室温的PBS洗涤细胞2次，40 g/L多聚甲醛固定5 min，双蒸水冲洗3次，加入适量5%硝酸银溶液，将培养板开盖在紫外灯下照射一两个小时，吸出残留硝酸银溶液，双蒸水冲洗3次，加入适量5%硫代硫酸钠溶液以中和残留的硝酸银，最后吸出残液，室温干燥，该方法可将细胞内的钙盐染成黑色。

1.4.4 三种成脂培养基成分及培养方法 骨髓间充质干细胞培养于DMEM/F12培养基中至80%融合时，更换为成脂诱导培养基，每3 d换液1次。①DIM成脂诱导培养基成分：IMDM，体积分数为10%胎牛血清，10 mg/L胰岛素，1 μmol/L地塞米松，500 μmol/L IBMX。②DIMI成脂诱导培养基成分：IMDM，体积分数为10%胎牛血清，1 μmol/L地塞米松，500 μmol/L IBMX，10 mg/L胰岛素，60 μmol/L吲哚美辛。③DIMR成脂诱导成分：IMDM，体积分数为10%胎牛血清，250 nmol/L地塞米松，500 µmol/L IBMX，5 mg/L胰岛素，1 µmol/L罗格列酮。

1.4.5 油红O染色和免疫荧光 采用DIM，DIMI，DIMR方法诱导分化的骨髓间充质干细胞(n=3)在30 g/L多聚甲醛中固定15 min，0.1%Triton X-100破膜5 min，PBS洗3遍，5%BSA(PBS配)室温封闭30 min，Oil-Red O(60%异丙醇配制)染色45 min，PBS冲洗3遍。肌动蛋白微丝(actin filaments)使用Rhodamine Phalloidin染色。细胞核使用DAPI染色。所有荧光染料使用Leica激光扫描共聚焦显微镜检测。Image J半定量每40×视野中油红O染色面积。

1.4.6 Real-time PCR方法检测基因的表达 采用DIM，DIMI，DIMR方法诱导分化骨髓间充质干细胞，于成脂诱导第1，3，7天收集细胞，并以未刺激组做对照，用E.Z.N.A.TotalRNA kit(Omega)提取细胞总RNA，反转录成cDNA，使用Real-time PCR检测基因改变。反应扩增条件为：94 ℃ 30 s预变性；94 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s 40个循环。

引物序列见表1。结果以2^-^??Ct法计算各样本相对表达量。

1.4.7 Western blot检测 在诱导分化第0，1，3，7天收集细胞，RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，按30 μg上样，SDS-PAGE凝胶电泳后转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入GAPDH、PPARγ、C/EBPβ、pPPARγ-Ser273抗体4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入对应二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，显影、曝光。采用Image J软件对蛋白显影条带进行灰度值分析，以GAPDH为内参，计算目的蛋白的相对表达量。
1.5 主要观察指标 ①油红O染色检测骨髓间充质干细胞的成脂能力。②Real-time PCR检测分化早期阶段各成脂相关基因mRNA的表达。③Western blot检测分化早期阶段PPARγ、C/EBPβ、pPPARγ-Ser273蛋白表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行分析，结果数值以x(_)±s表示，两样本均数比较采用t 检验，3组比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨髓是分离培养间充质干细胞的最早来源^[1-2]。骨髓间充质干细胞被认为是脂肪前体细胞和成骨细胞的共同前体细胞^[6-8]。骨髓脂肪化研究在再生障碍性贫血和骨质疏松等疾病中具有重要意义^[9-11]。不仅如此，骨髓间充质干细胞也可作为人体模型用于干细胞分化调控和组织工程学等方面研究。例如，烧伤患者软组织萎缩，通过组织工程方法重塑脂肪组织可使之获益^[12]。目前成脂诱导方法众多，各方法成分组成及用量差别较大，不同诱导方法产生的脂肪细胞功能特性有可能不同，这使得不同研究方法的结果常常不存在可比性^[3]。有研究提出含有罗格列酮的成脂培养基在第6-8天即可诱导骨髓间充质干细胞成脂分化，较目前通用的成脂诱导方法迅速有效，因此有必要研究不同诱导条件下骨髓间充质干细胞的早期成脂特性。

吲哚美辛作为一种非类固醇抗炎药广泛应用于临床，其促成脂特性也得到普遍认可^[13]。目前认为吲哚美辛主要通过直接增加PPARγ蛋白表达量，或者影响PPARγ转录后调节机制，而非增加PPARγ转录激活能力来发挥促成脂特性^[14]。C/EBPβ是一种参与早期成脂分化的转录因子，一些研究证实它可能是PPARγ结合染色质的启动因子^[15]。目前认为，在成脂诱导分化开始时，cAMP首先升高，继而cAMP应答元件结合蛋白(CREB)磷酸化。磷酸化的CREB诱导表达C/EBP家族成员C/EBPβ。C/EBP家族的另外2个成员(C/EBPα，C/EBPδ)也参与骨髓间充质干细胞成脂分化。C/EBPβ和C/EBPδ在成脂诱导开始4 h内即快速上调，但此时的C/EBPβ为非活性蛋白，不能和DNA结合。C/EBPβ的激活需要Thr188、Thr179或Ser184位点磷酸化。C/EBPβ可以和C/EBPα、PPARγ启动子附近的调节元件结合，激活它们的转录。一旦被激活，C/EBPα可通过与C/EBPα、PPARγ相对应的C/EBP调节元件结合，来维持C/EBPα和PPARγ的持续表达。C/EBPα和PPARγ可共同作用来调节大量基因，包括脂肪细胞表型基因^[16-18]。C/EBPβ可以协同促进PPARγ、C/EBPα的表达，且在早期表达。C/EBPα的表达相对较晚，主要通过调节成脂特异性基因表达，促进脂肪细胞的终末分化。Western blot结果显示DIMI对C/EBPβ的诱导表达量显著高于其余2组，因此，DIMI有可能通过上调C/EBPβ表达量，促进PPARγ蛋白表达而促进成脂。罗格列酮属于噻唑烷二酮类抗糖尿病药，作为PPARγ的强效激动剂，可直接激活PPARγ而诱导相关基因表达^[19-20]。Benvenuti等^[21]证实1 μmol/L罗格列酮即可诱导人骨髓间充质干细胞成脂分化，形成脂滴。但David Contador，Ninomiya等研究表明单独应用罗格列酮并不足以诱导骨髓间充质干细胞分化为成熟脂肪细胞，而与地塞米松联合时可有效诱导成脂^[5^，^22]，这提示罗格列酮还可能通过增加对胰岛素的敏感性促进成脂，形成较成熟的脂肪细胞。此外，Choi等^[23]研究发现罗格列酮可通过降低PPARγ- Ser273磷酸化程度增加成脂相关基因表达。动物实验证实高脂饮食可以通过激活Cdk5增加PPARγ- Ser273位点磷酸化，从而降低一些对胰岛素敏感蛋白的表达，如adiponectin。罗格列酮可抑制该位点磷酸化，促进下游基因表达。当然通过调节PPARγ促进成脂的机制还有很多，比如增加活性PPARγ比例，调节PPARγ转录共刺激因子，增加PPARγ核转移等^[22^，^24]，其他成脂相关因子如adiponectin，瘦素，脂蛋白脂酶等在成脂中的作用尚不完全清楚，但它们可通过自分泌和旁分泌作用影响脂肪细胞的功能，而且可以分泌到血液中对代谢产生作用^[25-26]。

实验通过检测早期诱导骨髓间充质干细胞表达成脂相关基因的mRNA水平，发现在诱导0-7 d内，脂肪相关基因表达变化幅度大，均呈上升趋势，且在诱导后第1天就可观察到表达明显上升。通过比较3组培养条件下的诱导效果，可发现3种培养方法对基因的诱导表达程度并不相同，说明不同成脂诱导培养体系对人骨髓间充质干细胞产生的诱导特性并不相同，即在不同诱导条件下进行的实验结果很可能存在较大差异。通过比较DIM，DIMI与DIMR 3种方法对人骨髓间充质干细胞的成脂诱导能力，发现3种方法均可诱导成脂，但DIMR诱导体系能够更快速有效的促进骨髓间充质干细胞成脂分化。虽然不同样本间的成脂效率有所差别，但同一样本来源的骨髓间充质干细胞诱导结果均显示DIMR组成脂效率更高。有趣的是，虽然油红O染色与成脂相关基因检测均显示DIMR组具有更强的成脂诱导能力，但Western blot结果显示，在成脂第3天与第7天时DIMI组PPARγ、C/EBPβ蛋白表达量显著高于DIMR组。虽然调控骨髓间充质干细胞成脂分化的机制和分子众多，但PPARγ无疑是最重要的调控因子^[27-30]。PPARγ通常情况存在活化及非活化状态，而目前研究认为活化PPARγ在骨髓间充质干细胞成脂诱导中发挥着更重要的作用。相应研究显示PPARγ-Ser273位点磷酸化水平增高会减少PPARγ下游基因的表达^[14]。为探究DIMR快速有效成脂的机制，实验检测了PPARγ- Ser273位点磷酸化水平，结果发现DIMR组在成脂第7天时pPPARγ/PPARγ比值低于DIMI组，这提示DIMR有可能通过更强的翻译后修饰功能提高具有活性的PPARγ比例，使其高效转录激活下游基因。

综上所述，骨髓间充质干细胞在DIM，DIMI与DIMR条件下均能诱导成脂分化，但DIMR相比DIM和DIMI能使骨髓间充质干细胞更快速地成脂诱导，因此作者推论DIMR可能在骨髓间充质干细胞成脂诱导分化早期发挥更重要的功能，而该作用可能涉及到PPARγ蛋白活化。总之，通过比较不同成脂诱导条件，发现DIMR体系可以更快速有效的诱导骨髓间充质干细胞成脂，但其具体的机制有待进一步阐明。

不同成脂条件下人骨髓间充质干细胞的早期成脂特性

Properties of human bone marrow mesenchymal stem cells in the early phase of adipogenic differentiation in different culture systems

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