辛伐他汀对骨髓基质干细胞特异性成骨分化基因表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.19.006

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (19): 2777-2782.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.19.006

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辛伐他汀对骨髓基质干细胞特异性成骨分化基因表达的影响

刘昊¹，张岩¹，刘家寅¹，刘光源¹，张克忠¹，张国彬²，邢磊¹，田发明³

华北理工大学，¹附属医院，²研究生学院，³医学实验研究中心，河北省唐山市 063000

收稿日期:2016-03-17 出版日期:2016-05-06 发布日期:2016-05-06
通讯作者: 田发明，博士，副教授，硕士生导师，华北理工大学医学实验研究中心，河北省唐山市 063000
作者简介:刘昊，男，1982年生，河北省衡水市人，汉族，2008年华北煤炭医学院研究生部毕业，硕士，主治医师，主要从事骨与关节退行性疾病的研究。
基金资助:
河北省高等学校科学研究计划(QN20131007)；河北省自然科学基金(H2013209255)；唐山市老年医学重点实验室资助项目(14140221B)

Simvastatin effects on the expressions of specific osteogenic genes in bone marrow stromal stem cells

Liu Hao¹, Zhang Yan¹, Liu Jia-yin¹, Liu Guang-yuan¹, Zhang Ke-zhong¹, Zhang Guo-bin², Xing Lei¹,Tian Fa-ming³

¹Affiliated Hospital, ²Graduate School, ³Medical Research Center, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China

Received:2016-03-17 Online:2016-05-06 Published:2016-05-06
Contact: Tian Fa-ming, M.D., Associate professor, Master’s supervisor, Medical Research Center of North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China
About author:Liu Hao, Master, Attending physician, Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Hebei, No. H2013209255; the Scientific Research Project of Hebei Universities and Colleges, No. QN20131007; Tangshan Key Laboratory Project of Geriatric Medicine, No. 14140221B

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨形态发生蛋白：是转化生长因子超家族成员之一，其中骨形态发生蛋白2是公认的骨髓基质干细胞成骨分化的关键蛋白，不仅可以促进成骨细胞及其前体细胞的增殖，而且能够促进成骨细胞的分化，是骨髓基质干细胞成骨分化中晚期表达的特异性标志蛋白，国外首次发现辛伐他汀的成骨潜能即是通过筛选发现辛伐他汀可以刺激骨形态发生蛋白2启动子活性。
Ⅰ型胶原：由成骨细胞以原胶原的形式分泌，在骨骼与结缔组织中通过形成和保持骨架的完整性来发挥作用，在形成特定的细胞外微环境中也起到主要作用，而这些微环境对于维持细胞的完整性及传递细胞外信号起到关键作用。

摘要
背景：以往研究表明降脂类药物辛伐他汀具有促进体外培养骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的潜能，有望成为新型促成骨类药物，但干预不同时间点相应特异性成骨分化基因的表达是否有差异尚不得而知。
目的：观察辛伐他汀体外刺激不同时间点大鼠骨髓基质干细胞骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原的表达。
方法：取第1代骨髓基质干细胞分为两组，对照组加入成骨诱导培养基培养，辛伐他汀组在对照组基础上加入终浓度为10-7 mol/L的辛伐他汀培养，干预第7天检测第3代细胞碱性磷酸酶的表达。取第4代骨髓基质干细胞分为两组，对照组加入成骨诱导培养基培养，辛伐他汀组在对照组基础上加入终浓度为10-7 mol/L的辛伐他汀培养，干预12 h和36 h提取细胞RNA及蛋白，采用Realtime PCR 和Western blot 法检测骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原的表达。
结果与结论：①两组细胞均有碱性磷酸酶分泌，辛伐他汀组大鼠碱性磷酸酶阳性细胞比例显著高于对照组(P < 0.05)；②辛伐他汀组2个时间点骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原mRNA表达均显著高于对照组 (P < 0.05)；③Western blot 法检测辛伐他汀组2个时间点骨形态发生蛋白2的表达均显著高于对照组(P < 0.05)；辛伐他汀组Ⅰ型胶原蛋白的表达于12 h显著高于对照组(P < 0.05)，36 h无显著差别；④以上结果提示，辛伐他汀可以促进大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化晚期特异性标志蛋白骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原的表达，药物刺激12 h较36 h作用更显著。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-7083-3380(田发明)

关键词: 干细胞, 骨髓基质干细胞, 辛伐他汀, 碱性磷酸酶, 骨形态发生蛋白2, Ⅰ型胶原, 河北省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have demonstrated that simvastatin that can promote osteogenic differentiation of bone marrow stromal stem cells in vitro, is likely to be a new osteogenic drug. While it is still unknown whether there is time-dependent stimulation of simvastatin on the expressions of bone morphogenetic protein 2 and collagen type I.
OBJECTIVE: To investigate the expressions of bone morphogenetic protein 2 and collagen type I in rat bone marrow stromal stem cells in vitro stimulated by simvastatin at different time points.
METHODS: Passage 1 bone marrow stromal cells were divided into control and simvastatin group, followed by cultured in osteogenic differetiation medium with or uithout 10-7 mol/L simvastatin. After 7-day intervention, expression of alkaline phosphatase was detected in passage 3 cells. Passage 4 cells were divided and cultured as described above, and afterwards, RNA and proteins were extracted at 12 and 36 hours to detect the expressions of bone morphogenetic protein 2 and collagen type I using real-time PCR and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Both two groups could express alkaline phosphatase, while the rate of positive cells significantly increased in the simvastatin group compared with the control group (P < 0.05); at 12 and 36 hours after intervention, mRNA expressions of bone morphogenetic protein 2 and collagen type I in the simvastatin group were significantly higher than those in the control group (P < 0.05). Besides, western blot assay showed: at both 12 and 36 hours, simvastatin significantly enhanced the expression of bone morphometric protein 2, while the expression of collagen type I significantly increased at 12 hours (P < 0.05), but not at 36 hours. In conclusion, simvastatin can promote the expressions of bone morphometric protein 2 and collagen type I in rat bone marrow stromal cells, with more favorable outcomes after 12-hour treatment.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Simvastatin, Bone Morphogenetic Proteins, Collagen Type I, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

刘昊，张岩，刘家寅，刘光源，张克忠，张国彬，邢磊，田发明. 辛伐他汀对骨髓基质干细胞特异性成骨分化基因表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(19): 2777-2782.

Liu Hao, Zhang Yan, Liu Jia-yin, Liu Guang-yuan, Zhang Ke-zhong, Zhang Guo-bin, Xing Lei,Tian Fa-ming. Simvastatin effects on the expressions of specific osteogenic genes in bone marrow stromal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(19): 2777-2782.

图/表（结果） 1

参考文献

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引言

他汀类药物作为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methylglutaric acid，HMG-CoA)还原酶抑制剂，能够抑制胆固醇生物合成、减少血清胆固醇浓度，进而降低心脏疾病的发生率，一直应用于心血管疾病的治疗。辛伐他汀作为他汀类药物的一种，因表现出对炎症、缺血再灌注损伤、癌症、骨丢失等降脂以外的潜在治疗作用而备受关注^[1-7]，其中促进骨形成的作用已成为骨组织工程、骨代谢等相关领域研究的热点之一。课题组在前期研究中发现辛伐他汀体外刺激骨髓基质干细胞可明显促进其成骨分化，然而，在实际科研进程中发现，部分实验结果重复性较差，其原因可能与取材时间点，尤其是药物干预后时间不够精确有关。

骨髓间充质干细胞是一种从骨髓提取的多潜能成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，在一定条件下可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞、心肌细胞等方向分化^[8-13]，因其取材方便，易于扩增，已成为组织工程、组织修复与再生等领域的研究热点。骨髓间充质干细胞作为骨髓腔内的主要功能细胞，其成骨分化方向和功能活性直接影响着骨量及骨折愈合的生理进程。Song等^[14]首次发现辛伐他汀在促进小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的同时，抑制其向脂肪细胞分化，随后以老龄大鼠、人、小鼠骨髓间充质干细胞为干预对象的研究中也得出相同的结论^[15-17]。

骨髓基质干细胞体外分化不同时期会表现出相应的成骨生物学行为并表达特异性因子，其中骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原是其成骨分化中晚期表达的特异性标志蛋白。骨形态发生蛋白2是公认的骨髓基质干细胞成骨分化的关键蛋白，不仅可以促进成骨细胞及其前体细胞的增殖，而且能够促进成骨细胞的分化^[18-22]。Ⅰ型胶原由成骨细胞分泌，可与其他细胞和基因共同作用，大量胶原累积可形成骨雏形，为矿化做准备，最终能够在多因素共同作用下形成骨组织^[23]。

实验选用第4代骨髓基质干细胞为观察对象，判断药物刺激12 h和36 h后，骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原在mRNA和蛋白水平的表达是否有区别，以期为相关后续研究选择取材和检测时间点提供依据和参考。

材料方法

1.1 设计 细胞对照实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年5至12月在华北理工大学医学实验研究中心完成。

1.3 材料 4周龄清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠6只，体质量(80±10) g，购自北京维通利华实验动物中心，动物合格证号SCXK(京)2014-0001号。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓基质干细胞的提取和培养 采用颈椎脱位法处死大鼠，无菌条件下取双侧股骨和胫骨，去除干骺端，DMEM完全培养基(含青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/L和体积分数为10%胎牛血清的DMEM高糖培养基)反复冲洗骨髓腔，收集细胞于 50 mL离心管中，1 000 r/min离心8 min，弃上清，加入DMEM完全培养基，吹打成单细胞悬液，以5×10⁶/cm²细胞密度接种于培养瓶中，置于 37 ℃、体积分数为5% CO₂的孵箱培养。

细胞传1代后分为2组，对照组加入诱导培养基(含有10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L抗坏血酸和10^-⁸ mol/L地塞米松)培养，辛伐他汀组在对照组基础上加入终浓度为10^-⁷ mol/L的辛伐他汀培养，每个培养瓶中培养基总量为8 mL，传到第3代时检测细胞碱性磷酸酶的表达。取第4代细胞于传代24 h后分为2组，对照组加入诱导培养基，辛伐他汀组在对照组基础上加入10^-⁷ mol/L辛伐他汀，干预12 h和36 h提取细胞RNA及蛋白，采用Realtime PCR和Western blot法检测骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原的表达。

1.4.2 碱性磷酸酶染色 第3代细胞接种于预置有盖玻片的12孔板，细胞生长至60%-70%时，PBS冲洗，采用磷酸萘酚AS-MX，固定TR法，进行碱性磷酸酶染色，细胞核染为红棕色，碱性磷酸酶阳性细胞胞浆为蓝色。

1.4.3 Real-time PCR检测骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原mRNA的表达 第4代细胞于传代24 h后加入 10^-⁷ mol/L辛伐他汀干预12 h和36 h提取细胞，采用Trizol一步法提取细胞总RNA，定量后反转录合成第一链cDNA后，用荧光定量PCR系统进行PCR反应。选择25 μL PCR反应体系，加入各反应成分：上下游引物 (10 μmol/L)各0.5 μL，模板cDNA 1.5 μL，ddH₂O 10 μL，SYBR Green 12.5 μL。反应条件均为预变性95 ℃ 3 min，1个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，35个循环。反应结束后，使用Rotor-Gene 6.1.0.81软件(Corbett Research公司)分析PCR过程，检测样本的Ct值，Ct值随模板浓度增大而减少。以β-actin为对照内参基因，软件自动得出?Ct、??Ct及2^-^??Ct数值。

引物序列：骨形态发生蛋白2上游引物：5’-AAG GCA CCC TTT GTA GTG TGT GG-3’，下游引物：5’-CAT GCC TTA GGG ATT TTG GA-3’；Ⅰ型胶原上游引物：5’-AAG AAT GGC GAC CGT GGT GA-3’，下游引物：5’-ACG ATG ACC CTT TAT GCC TCT GT-3’；β-actin上游引物：5’-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GA-3’，下游引物5’-TTC ACC ACC ATG GAG AAG GG-3’。
1.4.4 Western blot检测骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原蛋白的表达 第4代细胞于传代24 h后加入10^-⁷ mol/L辛伐他汀干预，并于干预后12 h和36 h提取培养瓶中细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，根据测得的蛋白含量，计算含30 μg蛋白的溶液体积即为上样量，常规电泳及转膜后，将PVDF膜在TBST中漂洗3次，每次10 min，然后移至含有BSA的平皿中室温摇动封闭2 h，以封闭非特异性抗原。封闭结束后将膜与骨形态发生蛋白2或Ⅰ型胶原抗体4 ℃孵育过夜，次日加入二抗(1∶1 000稀释)稀释液中，37 ℃摇床孵育2 h，TBST缓冲液洗膜后，加入适量BCIP/NBT显色液显色，在避光环境下进行显色，待蛋白条带清晰后立刻取出PVDF膜，置于清水中终止显色。

1.5 主要观察指标 ①碱性磷酸酶染色结果。②Real time PCR法、Western blot法检测骨形态发生蛋白2或Ⅰ型胶原mRNA和蛋白的表达水平。

1.6 统计学分析 实验数据资料用SPSS 19.0来处理。各组数据经过Shapiro-Wilk正态性检验和Bartlett方差齐性检验后，利用单因素方差分析比较各组之间的差异，LSD-t 检验比较两组间差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

通过对体外培养大鼠骨髓基质干细胞的观察发现，在成骨诱导条件下，骨髓基质干细胞可向成骨细胞分化，表现出成骨特异性生物学行为，表达骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原等成骨特异性因子，而辛伐他汀干预后可促进大鼠骨髓基质干细胞成骨分化，对不同干预时间点的分析发现，辛伐他汀对成骨特异性因子骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原表达的刺激作用在给药后12 h较36 h更明显。

目前国内外大多数辛伐他汀体外干预骨髓基质干细胞的相关研究均证实了辛伐他汀促进其成骨分化的作用潜能，但也有研究得出不同结论，Sonobe等^[24]在以地塞米松为阳性对照的前提下，同时检测3种相同剂量他汀类药物(氟伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀)对体外培养大鼠骨髓基质干细胞的作用，发现3种他汀类药物均不能显著增强基质矿化、碱性磷酸酶活性及骨钙素的表达，除干预剂量和检测指标等影响因素外，相关检测时间点尤其是药物干预后精确时间点也可能影响研究结果。目前的相关研究中，仅以细胞培养代数或天数作为大致时间点，Hu等^[25]选择第1，2，3，4代细胞，观察骨髓基质干细胞成骨分化不同时期相关成骨特异性因子的表达水平，并证实第4代细胞已具备成骨细胞功能。Wang等^[26]则在第7，14，21，28天观察碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原等成骨特异性因子的表达，课题组先前的研究中，也以培养天数作为观测点^[27]。然而，对于末次加药后不同时间点相关指标的分析是否有区别目前未见报道，如能选择相对效应更大的时间点作为观测点，无疑有助于相关研究结果的分析。此研究将第4代细胞传代后24 h(即细胞贴壁展开后)加入含有辛伐他汀或等含量溶剂的培养基，并分别于加药后12 h和 36 h取材，通过分析mRNA和蛋白表达水平，发现辛伐他汀干预12 h较干预36 h对骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原表达的促进作用更明显，辛伐他汀组与对照组比较，两个因子在12 h上升比例均高于36 h，此外，两个因子mRNA升高比例要高于蛋白水平，一方面可能是由于蛋白表达水平受到翻译前后多种因素影响，另一方面，蛋白合成后会分泌至细胞外等因素有关，而实验提取的蛋白仅为细胞总蛋白，Ⅰ型胶原在36 h表达组间无显著差别可能也与此有关。

综上所述，经体外研究首次发现辛伐他汀对第4代大鼠骨髓基质干细胞成骨诱导分化过程中骨形态发生蛋白2和Ⅰ型胶原的表达作用效果与时间有关，其中药物干预12 h效果较36 h更明显，建议相关后续研究以此为观测时间点。当然，实验仅观察了12 h和36 h两个时间点，虽然证实了12 h较36 h更适合作为观测时间点，但12 h是否为最佳时间点尚有待设计更为细致的观测点进一步研究。

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