骨髓间充质干细胞促进肺癌转移的机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.19.007

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
细胞划痕实验：是测定肿瘤细胞运动特性的方法之一。在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后在加入药物等实验条件下观察其对肿瘤细胞迁移的影响。
细胞侵袭实验：人工重构基底膜材料Matrigel 是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。滤膜孔被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel的滤膜，这与体内情况较为相似。

摘要
背景：从目前研究来看，间充质干细胞对肿瘤细胞的增殖、转移具备促进或抑制作用存在较大的争议。
目的：探讨骨髓间充质干细胞促进肺癌转移的机制。
方法：釆用全骨髓直接贴壁法获得原代大鼠骨髓间充质干细胞，差速贴壁结合消化控制法纯化细胞。培养肺癌细胞株，采用划痕实验、细胞侵袭实验及迁移实验观察骨髓间充质干细胞对肺癌细胞迁移、侵袭、转移能力的影响，建立大鼠肺癌原位肿瘤模型，左侧肺接种骨髓间充质干细胞，移植后14 d观察肺组织病理改变。
结果与结论：①划痕后肺癌细胞迁移速率较大，随着时间的不断延长，划痕处愈合；②加入骨髓间充质干细胞后肺癌细胞迁移数增多；③加入骨髓间充质干细胞后肺癌细胞穿透Matrigel的能力增强；④肺癌组织周围存在明显的纤维结缔组织，且与周围组织边界清楚，肿瘤细胞核大；转移病灶组织出现明显的浸润，坏死比较明显，肿瘤细胞核大；⑤结果提示，骨髓间充质干细胞能提高肺癌细胞株的侵袭、迁移以及转移能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0003-0401-2132(郑天亮)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 肺癌转移, 骨髓间充质干细胞, 细胞划痕实验, 侵袭实验, 迁移实验, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: So far the positive or negative effects of mesenchymal stem cells on tumor growth and metastasis are under discussion.
OBJECTIVE: To explore the mechanism of bone marrow mesenchymal cells in promoting lung cancer metastasis.
METHODS: Primary rat bone marrow mesenchymal stem cells were obtained by direct adherence method of the whole bone marrow, and differential adherence combined with digestion control method was performed to purify cells. Lung cancer cell lines were cultured, and the effects of bone marrow mesenchymal stem cells on the migration, invasion and metastasis of lung cancer cells were observed by scratch test, cell invasion and migration assays. Orthotopic lung cancer models were established in rats and bone marrow mesenchymal stem cells were seeded onto the left lung of rats. Then, pathological changes of lung tissues were observed at 14 days after transplannation.
RESULTS AND CONCLUSION: After the scratch test, the migration rate of lung cancer cells became higher, and the scratches healed with time. And after cell transplantation, the number of migrated lung cancer cells increased, as well as the ability of lung cancer cells penetrating the Matrigel was strengthened. Besides, fibrous connective tissues could be found around the lung cancer tissues, and necrosis with distinct boundary and large tumor nuclei; the metastatic tissues showed obvious infiltration and necrosis with large tumor nuclei. These results suggest that bone marrow mesenchymal stem cells can promote the invasion, migration and metastasis of lung cancer cell lines.

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Lung Neoplasms, Cell Line, Tumor, Neoplasm Metastasis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 1

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引言

相关数据显示，非小细胞肺癌患者发病后5年存活率低于15%，10年存活率低于7%，多数患者一旦确诊已经是晚期，错过了最佳治疗时机^[1-3]。因此，对于非小细胞肺癌进行早期诊断，并采取积极有效的干预措施阻止肺癌进展是提高患者生存率的关键所在^[4-5]。目前，对于肺癌的转移机制尚不完全知晓，涉及肿瘤细胞间的同质性黏附能力、蛋白酶溶解破坏基底膜以及细胞外基质、细胞骨架重构导致细胞的运动、迁移能力增强等^[6-7]。

数据结果显示：肺癌根治性切除后3年复发率为40.0%-50.0%，5年复发率为60.0%-70.0%。因此，肺癌的诊治困难、预后较差，对居民健康构成了严重的威胁^[8-9]。

骨髓源性干细胞类型较多，主要包括造血干细胞、间充质干细胞以及多能成体祖细胞^[10]。间充质干细胞属于一类特殊的细胞，能够在体外贴壁培养并扩增，并且在特定的条件下分化为脂肪细胞、成骨细胞以及软骨细胞，静脉注射间充质干细胞能向肿瘤组织归巢并可整合入肿瘤组织中，且与肿瘤基质的形成关系密切^[11-12]。国际间充质及组织干细胞委员会在2006年对人来源骨髓间充质干细胞提出3条最低标准：①在标准培养下，分离获得的细胞必须具备对塑料底物的黏附性；②经流式细胞仪检测，骨髓间充质干细胞能表达CD105、CD73及CD90，且阳性率≥95%；③经体外诱导骨髓间充质干细胞必须能向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化。相关研究表明，间充质干细胞的作用并非统一，间充质干细胞对于肺癌的转移存在双向性，其在卡波氏肉瘤中能抑制肿瘤的生长，而在胶质瘤、结肠癌等疾病中，其能促进肿瘤的生长和转移^[13-14]。因此，研究骨髓间充质干细胞在肺癌转移中的机制能为肺癌治疗提供新的思路^[15-16]。

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 于2014年12月至2016年1月在郑州大学第一附属医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 38只SD大鼠(2只用于细胞培养，36只用于动物造模)，2-7周龄，雌雄不限，SPF级，体质量为0.14-0.38 kg，平均(0.38±0.18) kg，由郑州大学第一附属医院动物实验中心提供，严格遵守相关标准进行饲养，合格证号为SCXK(豫)2008-0004。实验过程中对SD大鼠的处理符合《关于善待实验动物的指导性意见》中相关规则^[17-18]。

1.3.2 主要仪器和试剂 胎牛血清(美国BECKMAN COULTER公司)，L-DMEM细胞培养液(美国 FORMA公司)，离心机(法国 Jouan BR4)，倒置相差显微镜(日本OLMYPUS公司)，青霉素及链霉素(华北制药)，含EDTA的胰酶消化液(上海蓝季科技)，常规手术器械(上海医疗器械厂)，流式细胞仪(美国 Becton-Dickinson公司)，Cpn TW-183菌液(美国Sigma公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的制备方法 ①全骨髓贴壁培养法：将2只SD大鼠处死，在体积分数为75%乙醇中浸泡15 min，取出胫骨和股骨，将胫骨和股骨两端剪断，充分暴露骨髓腔，采用无菌注射器吸取含体积分数为10%胎牛血清的培养基反复冲洗骨髓腔，制作成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹接种于培养皿中，在 37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中进行培养。②骨髓间充质干细胞的体外扩增：原代细胞培养24，48 h后各换液1次，去除不贴壁细胞，连续培养3 d，观察出现集落样生长的细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，倒置显微镜下观察细胞单层收缩突起出现空隙时，加入完全培养基终止消化，用吸管吹打瓶壁细胞成细胞悬液，以1 000 r/min速度离心5 min，弃上清，加新的培养液于离心管中，吹打成单细胞悬液，以1×10⁴/cm²细胞密度传代培养，每 3 d换液1次，贴壁融合80%-90%，胰酶消化，并根据 1︰3比例进行传代^[19-20]。

1.4.2 肺癌细胞株培养 肺癌细胞株购买于中国科学院上海细胞所，细胞复苏后放置在含体积分数为10%胎牛血清的完全培养液中，在37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度培养箱培养，隔天换液1次。

1.4.3 细胞划痕实验 采用Maker笔在6孔板背后均匀划横线，每隔0.5-1.0 cm间距划一道，横穿过孔，在孔中加入5×10⁵个肺癌细胞，待细胞贴壁生长后，采用 200 μL枪头垂直于6孔板背后的横线划痕，加入骨髓间充质细胞培养液，放入37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱培养，观察0，24，48 h后划痕愈合程度^[21-22]。

1.4.4 细胞侵袭实验 将Mateigel放入冰上或4 ℃过夜，使之成为液体状态。由于室温下基质胶容易凝成固态，使用时需要对24孔板、枪头放置在-20 ℃进行预冷。使用预冷过的无血清DMEM稀释Mateigel，取60 μL稀释胶加入24孔板的Tranwell小室中孵育1 h。利用胰酶消化法消化肺癌细胞，细胞计数，加入无血清DMEM调整细胞浓度为2×10⁸L^-¹，平铺于每个Tranwell小室内。对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的H-DMEM培养基，实验组在含体积分数为10%胎牛血清的H-DMEM培养基中加入骨髓间充质干细胞，培养24 h，固定，染色计数^[21-24]。

1.4.5 细胞迁移实验 将Tranwell小室内放入24孔板内，不进行任何处理。利用胰酶消化法消化肺癌细胞，细胞计数，用无血清DMEM调整细胞浓度为1×10⁵ L^-¹，每个Tranwell小室内均匀铺200 μL，其余步骤见侵袭实验^[25-27]。

1.4.6 SD大鼠肺癌模型建立及细胞移植 36只SD大鼠禁食12 h，术前肌肉注射0.5 g阿托品，尾部注射3.6%水合氯醛进行全身麻醉，待麻醉生效后仰卧位固定于实验台上，轻拉舌，压迫舌腹部暴露喉头，于解剖显微镜直视下插入塑料套管针，向大鼠气管内注入100 μL Cpn TW-183菌液(含有1×10⁹ IFU/L)，注入完毕后立即将大鼠直立、旋转并轻轻按压胸部，保证菌液分布在肺部两侧，每周1次，持续2个月，建立SD大鼠肺癌模型，造模成功后选取左侧肺接种骨髓间充质干细胞3×10⁶/只。

骨髓间充质干细胞移植后14 d处死大鼠，解剖肺部组织，用体积分数为10%的中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色^[28-29]，观察肺组织病理改变。

1.5 主要观察指标 采用细胞划痕实验、细胞侵袭实验及迁移实验观察骨髓间充质干细胞对肺癌细胞侵袭、迁移、转移能力的影响。

1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0处理，计量资料采用x(_)±s表示，进行t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

原发性肺癌是目前全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，多数患者一旦确诊已经是中晚期，从而错过了最佳手术治疗时机^[30-31]。目前，临床上对于肺癌治疗方法相对较多，如手术、化疗、放疗以及生物治疗等，这些方法虽然能改善患者症状，但是死亡率依旧很高。肺癌转移则是肺癌患者治疗预后不良的主要原因之一，对于该疾病的发病机制尚不完全清楚^[32-33]。因此，研究肺癌的转移机制并采取积极有效的措施进行干预具有重要的意义。

“细胞融合”于19世纪被提出，它是指两个或多个细胞在自然或人工作用下，通过浆膜的合并成为一个细胞过程，并且该过程中伴或不伴有细胞核膜的合并，它是胚胎发育过程中最为重要的一个生理现象^[34-35]。研究显示，机体在创伤、肿瘤等病理下，融合机制将会被全部激活，促进肿瘤的发生、发展^[36]。众所周知，慢性炎症与肿瘤的发生、发展关系密切，许多慢性炎症最终能演变为恶性肿瘤，部分学者甚至将肿瘤称为“永不愈合的炎症”。肺癌的转移与肿瘤的微环境关系密切。骨髓间充质干细胞在炎症、创伤以及肿瘤等病态作用下定向趋化、迁移^[37-38]。实验成功制备出骨髓间充质干细胞，传代后细胞为梭形，呈漩涡状，且排列具备一定的方向性，细胞表面CD90以及CD105为阳性表达，CD45以及CD34为阴性表达。由于骨髓间充质干细胞具备可融合性、高迁移活性以及间质细胞特性，使得骨髓间充质干细胞能与肺癌细胞相互融合，从而促进肺癌的转移^[39]。肺癌转移属于一个多步骤、复杂的过程。在整个过程中涉及肿瘤细胞的局部侵袭、远端转移。在局部侵袭中，肿瘤细胞必须具备水解基底膜、间质结缔组织能力，才能保证细胞穿过细胞外基质进入定植区域^[40]。从细胞侵袭实验以及迁移实验结果均可以看出骨髓间充质干细胞在一定条件下能促进肺癌的转移。

综上所述，釆用全骨髓直接贴壁法能获得成熟的骨髓间充质干细胞，其能提高肺癌细胞株的侵袭、迁移以及转移能力。