成骨分化与修复调控转录因子Runx2在股骨头坏死组织中的表达：非随机平行对照临床观察试验方案

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.17.019

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (17): 2569-2574.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.17.019

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成骨分化与修复调控转录因子Runx2在股骨头坏死组织中的表达：非随机平行对照临床观察试验方案

杨礼庆，董成建，朱姝

中国医科大学附属盛京医院脊柱关节外科，辽宁省沈阳市 110004

收稿日期:2016-03-06 出版日期:2016-04-22 发布日期:2016-04-22
通讯作者: 杨礼庆，博士，副教授，中国医科大学附属盛京医院脊柱关节外科，辽宁省沈阳市 110004
作者简介:杨礼庆，博士，副教授，中国医科大学附属盛京医院脊柱关节外科，辽宁省沈阳市 110004
基金资助:
辽宁省科学技术计划项目(2009225010-15)

Osteogenesis-related factor Runx2 expression in necrotic femoral head tissue: study protocol for a non-randomized, parallel-controlled trial

Yang Li-qing, Dong Cheng-jian, Zhu Shu

Department of Orthopedic Surgery, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China

Received:2016-03-06 Online:2016-04-22 Published:2016-04-22
Contact: Yang Li-qing, Department of Orthopedic Surgery, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China
About author:Yang Li-qing, M.D., Associate professor, Department of Orthopedic Surgery, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China
Supported by:
the High-Tech Research and Development Program of Liaoning Province of China, No. 2009225010-15

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

Runx2：是一种成骨特异性转录因子，对骨组织的形成和重建起着重要作用。Runx2调控间充质干细胞向成骨细胞分化，促进软骨细胞的成熟和软骨的血管化，与破骨细胞分化及细胞外基质的形成密切相关。

股骨头坏死：是一个病理演变过程，作为一种破坏性退行性疾病，初始发生在股骨头的负重区，应力作用下坏死骨骨小梁结构发生损伤即显微骨折以及随后针对损伤骨组织的修复过程。造成骨坏死的原因不消除，修复不完善，损伤-修复的过程继续，导致股骨头结构改变、股骨头塌陷、变形，关节炎症，功能障碍。

背景：股骨头血供中断或受损引起骨细胞及骨髓成分死亡引发股骨头坏死。多种成骨相关因子如Runt相关转录因子2(Runx2)、骨形态发生蛋白、骨保护素、骨钙素，在其随后修复过程中发挥重要作用。研究发现Runx2基因为成骨分化和骨形成过程中的控制基因，能促进前成骨细胞中各种矿化相关蛋白基因的转录，使其向成骨细胞方向分化，从而在骨修复中起到关键性的作用。

方法/设计：研究在中国医科大学附属盛京医院完成，为回顾性、单中心、非随机平行对照试验。研究纳入拟进行全髋关节置换的15例股骨头坏死患者和15例骨关节炎患者。试验在术中获得的骨组织标本，以股骨头颈组织Runx2 mRNA表达为主要观察指标，以骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白7、骨保护素mRNA表达，以及骨钙素免疫反应为次要观察指标。试验方案已在ClinicalTrials.gov注册(注册号NCT02735538)，试验方案取得中国医科大学附属盛京医院伦理委员会的书面批准(批准号：2016PS222K)，并取得受试者或监护人的书面知情同意。

讨论：股骨头坏死患者股骨头颈组织包括Runx2 mRNA在内的多个骨修复相关基因表达的检测已于2010至2011年完成。研究结果为阐释Runx2 mRNA在股骨头坏死中可能扮演的角色，以及对骨修复重建的意义有所贡献
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程
ORCID: 0000-0002-1778-6957(杨礼庆)

关键词: 骨科植入物, 人工假体, 股骨头坏死, 骨关节炎, Runx2, 骨形态发生蛋白, 骨保护素, 骨钙素, 非随机对照试验

Abstract:

BACKGROUND: Osteonecrosis of the femoral head (ONFH) results from an interruption of the blood supply to the femoral head or injury-caused death of chondrocytes and bone marrow components. Many osteogenesis-related factors, such as Runt-related transcription factor 2 (Runx2), bone morphogenetic protein (BMP), osteoprotegerin and osteocalcin, are involved in the subsequent repair process. The Runx2 gene has been shown to control osteoblast differentiation and formation by upregulating the transcription of various mineralization-related protein genes, allowing osteoblast precursors differentiation into osteoblasts, and playing a key role in bone repair.

METHODS/DESIGN: This retrospective, single-center, non-randomized, parallel-controlled trial was performed at Shengjing Hospital of China Medical University, China. Fifteen patients with ONFH and 15 patients with osteoarthritis undergoing total hip replacement were included. Primary measure was Runx2messenger RNA (mRNA) expression in femoral head and neck tissue, and secondary measures included BMP-2, BMP-7 and osteoprotegerin mRNA expression, as well as osteocalcin immunoreactivity. This trial was registered at ClinicalTrials.gov (identifier: NCT02735538) and acquired written approval from the Ethics Committee of Shengjing Hospital of China Medical University (approval No. 2016PS222K). Written informed consent was obtained from each included patient.

DISCUSSION: This study involved in the detection of mRNA expression of several bone repair-related genes, including Runx2, in the femoral head and neck of patients with ONFH was performed between 2010 and 2011. This observational study will help clarify the role and possible clinical significance of Runx2 in femoral head necrosis, bone repair and reconstruction.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

Key words: Femur Head Necrosis, Osteoarthritis, Bone Morphogenetic Proteins, Osteoprotegerin, Osteocalcin

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引言

股骨头坏死(osteonecrosis of femoral head，ONFH)是一种破坏性退行性疾病，病情进展可以发生软骨下骨和关节面软骨的塌陷^[1-2]。股骨头坏死的发病机制中以骨内压增高理论受到众多学者的青睐，而该理论的核心是由于骨髓间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化失衡^[3]。成人正常骨髓间充质干细胞可向脂肪细胞和成骨细胞分化，且保持平衡，以维持正常生理状态。当受到外源性刺激，比如外源性激素和酒精的使用，骨髓微环境发生改变后这一平衡就会被打破，出现骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化增多，导致骨髓腔压力增高，从而引起股骨头发生“缺血性”坏死^[4]。

Runt相关转录因子2(Runx2)是一种成骨特异性转录因子，其过表达可增强骨髓间充质干细胞的成骨分化能力，从而有效提高间充质干细胞移植修复骨缺损及骨坏死的作用^[5-10]。Runx2控制着成骨细胞特异性基因骨钙素(osteocalcin)的表达，是成骨细胞分化及行使功能的中枢调控。骨钙素是评价骨形成和骨转化率的指标^[11]。骨钙素是由成骨细胞产生和分泌的一种具有骨代谢调节激素作用的因子^[12]，被认为是骨形成功能的良好标志^[13]。陈镇秋等^[14]以7例激素性股骨头坏死ARCO Ⅳ期患者为实验组，7例股骨颈骨折患者为对照组，应用免疫组化和qPCR法检测股骨头标本中骨钙素和Runx2的表达，结果显示激素性股骨头坏死的发病过程可能与Runx-2及骨钙素有密切联系。

股骨头坏死是由多种原因引起股骨头血供中断或受损引起骨细胞及骨髓成分死亡，在其随后修复过程中，骨形态发生蛋白(BMPs)不但能够刺激骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞，而且能促进成骨细胞的生长，其中骨形态发生蛋白2是骨组织形成过程中最关键的调节因子^[15-20]。

股骨头坏死后的骨质丢失与破骨细胞活性、分化的失衡密切相关。骨保护素(osteoprotegerin，OPG)具有抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性，并诱导其凋亡的作用^[21-23]。骨保护素及骨保护素配体(osteoprotegerinligand，OPGL)系统被证实是破骨细胞形成、分化和骨吸收调节的关键因子，在骨质疏松、骨关节炎、骨肿瘤等骨科的发病机制及治疗方面具有重要作用^[24]。

目前尚未见FicatⅢ-Ⅳ期股骨头坏死患者与骨关节炎患者股骨头中成骨相关因子骨形态发生蛋白、骨钙素、骨保护素，尤其是Runx2基因表达的临床对照试验。
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材料方法

2.1 试验设计回顾性、单中心、非随机平行对照试验。

2.2 试验完成地点中国医科大学附属盛京医院。

2.3 试验设计执行流程获得所招募患者的知情同意后，根据纳入和排除标准筛选受试。合格的Ficat Ⅲ-Ⅳ期股骨头坏死患者15例和骨关节炎患者15例^[25]，均在行全髋关节置换术过程中收集切除的股骨头样本，并对离体标本进行编号。应用Real time-PCR技术，定量分析Runx2、骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白7、骨保护素基因的表达水平。免疫组化染色法对骨钙素免疫反应进行检测(图1)。结局指标检测和统计学分析由对患者分组盲的专业人员完成。

数据分析

排除：

不符合入选标准

拒绝参加

其他原因

招募拟行全髋关节置换的股骨头坏死和骨关节炎患者

知情同意

筛选

股骨头坏死组(n=15)

骨关节炎组(n=15)

收集基线

术中取股骨头颈骨组织

实时PCR：Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2和7、骨保护素基因表达；免疫组化染色：骨钙素免疫反应

图1 试验流程

Figure 1 Flow chart of the trial protocol

2.4 受试对象纳入研究的30例拟行全髋关节置换的股骨头坏死和骨关节炎患者均来源于中国医科大学附属盛京医院。

2.4.1 纳入标准符合如下标准的患者将被纳入研究：

(1)经正位和侧位X射线片、CT确诊为股骨头坏死(Ficat Ⅲ-Ⅳ期)；

(2)经实验室检查及X线片确诊为髋关节骨关节炎；

(3)初次手术；

(4)健康情况允许，能耐受麻醉与手术；

(5)对试验内容知情同意。

2.4.2 排除标准符合如下标准的患者将被排除临床研究：

(1)合并有心血管、肝肾功能不全、造血系统等严重原发性疾病者；

(2)怀孕和哺乳期者；

(3)有凝血性疾病者；

(4)有癫痫或精神病史者；

(5)患者在纳入试验前30 d内参加过其他临床试验；

(6)孕妇及哺乳期妇女；

(7)正在参加其它临床试验者；

(8)生活不能自理或自控能力差者；

(9)HIV阳性、肝炎病毒阳性；

(10)全身或局部存在任何活动性感染；

(11)手术耐受力差。

2.5 样本量研究的主要指标为股骨头颈组织Runx2 mRNA表达。为了计算样本量，复习相关文献，最类似的是Chen等^[14]的研究。他们检测全髋关节置换术的激素性股骨头坏死ARCO Ⅳ期的患者(实验组，n=7)，股骨颈骨折的患者(对照组，n=7)，实验组表达明显低于对照组(1.000±0.017，0.383±0.023，P < 0.001)。使用Power Analysis and Sample Size 11.0 (PASS 11.0)软件中Tests for two means (Two-sample T-Test) [Differences]方法计算样本量。取I类错误概率(显著性水平)α=0.05，1-β把握度(power)为90%，1-β=0.9，β=0.1。最终确定此次试验有效样本量为：股骨头坏死组15例；骨关节炎组15例。

2.6 受试者招募通过医院公告版发布招募受试者信息，或医生在对患者进行诊治时，对患者进行宣传。感兴趣的患者可通过主治医生，以电话或email的形式联系项目负责人。

2.7 分组根据疾病类型将患者分为股骨头坏死组和骨关节炎组，各15例。

2.8 取材手术切除坏死或骨关节炎之股骨头，进行人工关节置换。对切除的股骨头进行取材。在2个部位进行取材：1个位于股骨头中心点，1个位于股骨颈基底部，各取出1 cm³骨组织。取出之骨组织一部分置于含体积分数4%甲醛的PBS中固定，另一部分骨组织置于液氮中速冻，保存于-80 ℃以备RNA分离。

2.9 实时PCR检测 500 mg骨组织块在室温下置于 6 mL溶解液中旋转1 h。接下来，根据生产商提供的数据在溶解液中提取RNA。未提纯的RNA置于37 ℃ DNA酶中消化1 h，加入DNA酶灭活溶液进行灭活。用 0.5 mol/L醋酸铵将RNA从上清液中析出，在-20 ℃体积分数100%乙醇中过夜。干燥的颗粒重新置于60 μL洗脱液并储存在-80 ℃。应用反转录试剂盒使RNA反转录为cDNA。PCR产物的克隆。应用如下引物：骨形态发生蛋白2，F：5’-CCC ACT TGG AGG AGA AAC AA-3’，R：5’-GCT GTT TGT GTT TGG CTT GA-3’；Runx2，F：5’-GCA GTT CCC AAG CAT TTC AT-3’，R：5’-CAC TCT GGC TTT GGG AAG AG-3’；骨形态发生蛋白 7，F：5’-TCC GGT TTG ATC TTT CCA AG-3’；R：5’-ATC CGG AAC GTC TCA TTG TC-3’；Osteoprotegerin，F：5’-GGC AAC ACA GCT CAC AAG AA-3’，R：5’-TCT GCT CCC ACT TTC TTT CC-3’。cDNA进行传统PCR。使用试剂盒纯化后，根据生产商参数，与pCR II Blunt-TOPO载体结合，转化完成后，胞浆DNA从阳性克隆中分离。用限制性内切酶序列进行插入子的鉴定。用50 ng cDNA进行绝对和相对RT-PCR定量。Runx2、骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白7使用试剂盒进行绝对量化，Osteoprotegerin(骨保护素)使用试剂盒及ABI prism 7000 SDS软件进行相对量化，确定基因表达水平。

2.10 免疫组化染色取出的骨样本在体积分数4% PBS甲醛溶液中4 ℃下固定24 h。在20%EDTA溶液中脱钙2-4周，埋入石蜡，切成5 μm切片。石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，自来水冲洗片刻，蒸馏水冲洗片刻，PBS洗5 min；复合消化液室温消化10 min，PBS洗3次，每次3 min；体积分数3%H₂O₂室温孵育5 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS洗3次，每次 3 min。体积分数5%山羊血清封闭，37 ℃ 30 min，倾去血清；滴加抗骨钙素抗体，阴性对照滴加山羊抗鼠IgG，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，每次3 min；滴加辣根过氧化酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃ 孵育 30 min，PBS洗3次，每次3 min；显色剂显色(现配现用)；自来水充分冲洗，复染，封固。图像分析Image-Pro Plus6.0图像处理系统完成。测定骨基质中骨钙素免疫阳性反应，并采用免疫反应积分(IRS)打分法判断免疫反应结果^[26]，即染色强度(SI)和阳性细胞百分比(PP)的乘积，即IRS=SI×PP。SI可分为4级，即0为未见阳性细胞即阴性，1级为弱阳性，2级为中等阳性，3级为强阳性。PP可分为5级，即0级为阴性，1级≤10%，2级11%-50%，3级51%-80%，4级> 80%。当SI与PP的乘积> 3分时视为免疫反应(+)。

2.11 观察指标

2.11.1 主要指标术中取材的股骨头颈组织Runx2 mRNA表达。Runx2被认为是调控成骨细胞定型和分化最主要的转录因子，可视为成骨细胞表型标识物，其表达及活性受抑制时，骨形成也受到抑制^[27]。

2.11.2 次要指标术中取材的股骨头颈组织骨修复相关基因-骨形态发生蛋白2，骨形态发生蛋白7，骨保护素mRNA表达，以及影响成骨的骨钙素免疫反应。

评估指标见表1。

2.12 数据收集、管理、分析、开放

2.12.1 数据收集根据实验设计类型和要求制成用于记录实验数据的表格，以收集实验数据。这些资料将被专业人员应用计算机，以双重录入的形式转化为电子版文件。

2.12.2 数据管理待所有受试入组并完成随访后核对文件的数据，由主要研究者对数据库进行锁定。锁定后的数据文件不允许再作变动并将数据库保存备查。所有与此次临床试验有关的研究资料均由中国医科大学附属盛京医院保存。

2.12.3 数据分析将数据库资料交给专业统计人员进行统计分析。

2.12.4 数据开放出版数据将公开发布于www. figshare.com。

2.13 统计学分析统计学分析由对试验分组盲的统计师应用SPSS 19.0软件完成。股骨头坏死组和骨关节炎组患者股骨头颈组织Runx2、骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白7、骨保护素基因表达和骨钙素免疫反应结果若符合正态分布，则差异比较采用两样本t 检验；若为非符合正态分布，差异比较采用Mann-Whitney U检验。以P < 0.05为差异有显著性意义。

2.14 伦理批准研究方案取得中国医科大学盛京医院伦理委员会的书面批准(批准号：2016PS222K)，且符合世界医学会制订的《赫尔辛基宣言》。试验取得患者的书面知情同意。

成骨分化与修复调控转录因子Runx2在股骨头坏死组织中的表达：非随机平行对照临床观察试验方案

Osteogenesis-related factor Runx2 expression in necrotic femoral head tissue: study protocol for a non-randomized, parallel-controlled trial

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