人端粒酶反转录酶基因电转染优化培养大鼠前软骨干细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.020

摘要/Abstract

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文题释义：

人端粒酶反转录酶：端粒是真核细胞染色体末端的特有结构，正常情况下随细胞分裂而缩短。端粒长度是决定细胞增殖能力和寿命的分子标志。人端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，由人端粒酶反转录酶、人端粒酶RNA组分以及人端粒酶相关蛋白组成。端粒酶利用其自身携带的RNA为模板，在反转录催化下，将端粒重复序列合成到染色体末端，延长或稳定了随着细胞分裂而进行性缩短的端粒，在细胞永生化及恶性肿瘤的发生和发展中起到了重要的作用。

前软骨干细胞：近年来发现位于骨骺周围软骨膜中的前软骨干细胞是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，具有向软骨细胞和成骨细胞分化的潜质，其控制着动物肢体生长。成纤维细胞生长因子受体3为其特异性表面标志，应用免疫磁珠分选方法可以纯化得到前软骨干细胞，并且已作为种子细胞应用于软骨组织工程的多项研究。

背景：将人端粒酶反转录酶转染至目的细胞中，可以提高其端粒酶活性，保持端粒的长度，在调控增殖和分化方面有重要作用。

目的：探讨人端粒酶反转录酶基因转染对体外培养大鼠前软骨干细胞端粒酶活性及生物学特性的影响。

方法：体外培养Wistar大鼠前软骨干细胞，以反转录病毒PLXSN 为载体介导人端粒酶反转录酶基因转染，同时设置对照组、阴性对照序列组、转染组。用TRAP-ELISA法检测前软骨干细胞端粒酶活性，RT-PCR、Western blot检测前软骨干细胞人端粒酶反转录酶基因和蛋白的表达，CCK-8法、细胞生长曲线检测细胞生长增殖情况，流式细胞仪测定细胞周期分布的变化。

结果与结论：①人端粒酶反转录酶基因转染前软骨干细胞48 h，端粒酶活性明显升高；②与对照组、阴性对照序列组相比，转染组人端粒酶反转录酶基因和蛋白水平表达明显，细胞的生长速度明显增快，G₀/G₁期细胞数减少，S期细胞数增多，差异有显著性意义(P < 0.05)；③结果表明，以反转录病毒PLXSN为载体介导人端粒酶反转录酶基因转染使前软骨干细胞端粒酶活性明显升高，能够促进大鼠前软骨干细胞增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8365-3511(彭义)

关键词: 干细胞, 培养, 端粒酶反转录酶, 基因, 电转染, 大鼠, 前软骨干细胞

Abstract:

BACKGROUND: The human telomerase reverse transcriptase gene (hTERT) transfected into target cells can play an important role in target cell proliferation and differentiation by increasing telomerase activity and maintaining telomere length.

OBJECTIVE: To explore the effect of hTERT transfection on telomerase activity and biological characteristics of precartilage stem cells culured in vitro.

METHODS: Precartilage stem cells cultured in vitro were subjected to hTERT gene transfection via a retrovirus vector pLXSN. Meanwhile, control and negative control groups were set up. After transfection, TRAP-ELISA assay was used to detect telomerase activity; RT-PCR and western blot employed to detect hTERT mRNA and protein expressions; cell counting kit-8 used to detect cell proliferaiton based on cell growth curve; and flow cytometry adopted to detect cell cycle and distribution.

RESULTS AND CONCLUSION: The telomerase activity was significantly increased at 48 hours after hTERT gene was transfected into the precartilage stem cells. After transfection of hTERT, hTERT mRNA and protein levels were significantly increased, the cell growth rate was significantly increased, the proportion of cells at G₀/G₁ phase was decreased, and the number of S-phased cells increased compared with the control group and negative control group. There were significant differences among the groups (P < 0.05). In conclusion, hTERT transfection via retrovirus vector pLXSN can promote the proliferation of precartilage stem cells in rats by increasing the telomerase activity.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Telomerase, Transfection, Chondrocytes, Tissue Engineering

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图/表（结果） 6

2.1 前软骨干细胞形态及鉴定取材后未分选细胞培养至第3天时可见细胞形态不一，有长梭形、类三角形细胞亦可见死亡细胞，见图1A。分选后传代至第3代时贴壁细胞大小及形状均一，多为多角形或短梭形，贴壁牢固，胞体光滑，胞浆丰富，有很强的折光性，见图1B。免疫组织化学检测显示细胞明显着色，见图1C，说明该细胞明显表达FGFR-3，即该细胞为前软骨干细胞。

2.2 前软骨干细胞端粒酶活性采用TRAP-ELISA检测各组细胞端粒酶活性，结果显示：与阴性对照序列组和对照组相比，人端粒酶反转录酶转染组细胞端粒酶蛋白表达上调，阴性对照序列组和对照组细胞端粒酶蛋白表达差异无显著性意义(P > 0.05)，表明电转法转染人端粒酶反转录酶基因后提高了前软骨干细胞端粒酶活性。

2.3 Western blot检测人端粒酶反转录酶蛋白的表达转染48 h后，人端粒酶反转录酶基因转染组前软骨干细胞检测到人端粒酶反转录酶蛋白表达明显，而对照组和阴性对照序列组人端粒酶反转录酶蛋白无表达，说明人端粒酶反转录酶基因已稳定整合入前软骨干细胞中，目的蛋白稳定表达，见图2。

2.4 RT-PCR检测人端粒酶反转录酶mRNA的表达转染48 h后，人端粒酶反转录酶转染组前软骨干细胞检测到有人端粒酶反转录酶mRNA的表达，对照组、阴性对照序列组人端粒酶反转录酶mRNA无表达，证明了人端粒酶反转录酶基因已稳定整合前软骨干细胞中，见图3。

2.5 CCK-8检测细胞生长情况转染48 h后，与对照组、阴性对照序列组相比较，人端粒酶反转录酶转染组前软骨干细胞的吸光度值显著升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

2.6 细胞周期分布转染48 h后，与对照组、阴性对照序列组相比较，人端粒酶反转录酶转染组的S期细胞明显增多；与对照组、阴性对照序列组相比较，G₁期细胞在人端粒酶反转录酶转染组明显减少，差异有显著性意义(P < 0.05)，M期细胞无明显变化，见表3。

2.7 细胞生长曲线与对照组、阴性对照序列组比较，人端粒酶反转录酶转染组前软骨干细胞的增殖能力显著增强，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表4，图4。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点实验于2013年9月至2015年11月在河北医科大学动物实验室完成。

1.3 材料 Wistar大鼠9只，雌雄不限，体质量180- 200 g，由河北医科大学动物实验室提供，动物质量合格证号SYXK(冀)20090052，实验过程中对动物处置方法符合动物伦理学要求。

1.4 实验方法

1.4.1 前软骨干细胞的分离、纯化和鉴定无菌环境下分离其胫骨及股骨，去除周围附着的软组织，并将干骺端与骨连接处2 mm的组织剪下，修整为1 mm×1 mm× 1 mm小块，放入D-Hank’s液中漂洗，用吸管将其移至离心管中，1 000 r/min离心8 min，弃去上清，用胰酶重悬细胞，37 ℃水浴箱中消化5 min，再次离心，弃上清，加入0.1%Ⅰ型胶原酶重悬细胞后移至培养瓶中消化过夜，将消化液过滤去掉未消化的组织块，离心，去上清，D-Hank’s液重悬细胞，将细胞接种至含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中培养，放入37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中。

培养一两天后去掉未贴壁组织块，利用免疫磁珠分选系统纯化前软骨干细胞。无菌超净台上用吸管吸出原培养液，加入胰酶消化，于镜下观察细胞由梭形变为小圆形胞体变亮时用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，吹打并离心，弃上清，D-Hank’s液重悬细胞，离心去上清，再重悬于磁珠Buffer溶液中，先加入兔多克隆抗体FGFR-3(c-15)10 μL于培养箱中孵育15 min，离心去上清，用磁珠Buffer溶液清洗细胞2次，离心去上清，加入磁珠Buffer溶液重悬，加入羊抗兔IgG免疫磁珠10 μL孵育，离心去上清，用磁珠Buffer溶液清洗细胞2次，加入磁珠Buffer溶液重悬，将细胞悬液缓缓滴入位于磁场中的分离柱内，待悬液缓缓通过分离柱后，用Buffer缓缓冲洗，将阴性细胞洗脱。移开磁场，用Buffer溶液快速冲洗分离柱，将FGFR-3阳性细胞洗脱，即为前软骨干细胞。然后再次离心去上清，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬细胞，将细胞接种于培养瓶中，放入37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养。取部分做爬片，固定，用免疫组化法对其进行鉴定。

1.4.2 人端粒酶反转录酶基因电转染培养24 h后取对数生长期细胞，将其制成单细胞悬液，PBS冲洗，胰酶消化，离心，收集前软骨干细胞，加入电穿孔缓冲液使其重悬，离心800×g，静置5 min，清洗细胞3次，离心，重悬于电转液中，转移至电击杯，加入20 μg质粒DNA，轻轻混匀，静置于冰上30 min，以电压350 V/cm，电容25 μF，时间常数T为0.9 ms的电转化参数进行电穿孔。将转染后的前软骨干细胞在室温中放置30 min，移入DMEM培养基中放入37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养。以转染空质粒为阴性对照序列组，对照组未进行转染。

1.4.3 TRAP-ELISA法检测前软骨干细胞端粒酶活性采用Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA Kit试剂盒按说明书测定前软骨干细胞端粒酶活性，在Ep管中加入2×10⁵细胞，在4 ℃条件下按照3 000×g标准离心10 min，去除上清，加入200 μL Solution 1，依据16 000×g标准离心20 min，吸取1-3 μL上清于一新的Ep管中，加入 25 μL Solution 2；取3 μL细胞提取物于85 ℃灭活10 min作为阴性对照；在各管中加入Solution 6 使总体积至 50 μL；将样本进行扩增，整体反应温度及时间为：25 ℃ 10 min→94 ℃ 1 min→30个循环(94 ℃ 30 s→50 ℃ 30 s →72 ℃ 30 s )→72 ℃ 10 min；取PCR扩增产物5 μL进行ELISA实验，使用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值。

1.4.4 Western blot检测人端粒酶反转录酶蛋白的表达收集各组细胞，加入裂解液提取总蛋白，行Bradford法测定蛋白浓度。清洗玻璃板，灌胶上样并进行电泳，取纤维膜进行转膜，37 ℃温育2 h，加入一抗和二抗，并进行洗膜处理，显色剂显色。重复以上操作步骤3次。用Quantity one图像分析系统进行结果处理。

1.4.5 RT-PCR检测人端粒酶反转录酶mRNA的表达按照Trizol试剂说明书中的具体步骤提取各组细胞的总RNA，以紫外分光光度计检测样品吸光度并计算纯度及浓度。根据反转录合成试剂盒说明书进行反转录，PCR反应条件：95 ℃ 5 min-94℃ 30 s-55 ℃ 40 s-72 ℃ 30 s，36个循环，72 ℃延伸7 min。每一PCR反应重复3次。引物设计见表1。

将所得PCR产物在4 ℃条件下进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶自动成像仪上拍照提取图像。以β-actin作为内参照。

1.4.6 CCK-8法检测细胞生长情况将各组细胞接种在96孔板上，每孔100 μL，每组设3个平行孔，于37 ℃，体积分数为5%CO₂细胞培养箱中培养48 h，弃掉细胞培养液，加入CCK-8 10 μL，于培养箱温育2 h，在酶标仪上测定吸光度值。

1.4.7 流式细胞仪检测DNA含量分布收集各组细胞，调整细胞浓度为1.5×10⁶ L^-¹，用冷PBS冲洗2次，再用体积分数为70%的冷乙醇固定24 h，再次用冷PBS冲洗，加入Tris-HCl缓冲液温育30 min。用碘化丙啶进行细胞DNA染色，避光放置1 h，用流式细胞仪检测细胞DNA含量分布，并计算出各周期细胞所占的百分比。

1.4.8 生长曲线测定将各组同一时期转染前后的前软骨干细胞制成单细胞悬液，按每孔2.0×10⁴细胞密度接种于24孔板，每组设置3个复孔，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂孵箱培养。从培养的第2天起，每天同一时间消化3个孔，进行精确计数，连续5 d后绘制各组细胞的生长曲线。

1.5 主要观察指标 ①前软骨干细胞形态。②前软骨干细胞端粒酶活性。③前软骨干细胞人端粒酶反转录酶蛋白的表达。④前软骨干细胞人端粒酶反转录酶mRNA的表达。⑤前软骨干细胞生长情况。⑥前软骨干细胞DNA含量分布。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0软件包处理，计量资料以x(_)±s表示，两组间连续变量比较用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析及q 检验(即Newman-kueuls法)，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

前软骨干细胞具有向成熟软骨细胞定向分化的能力，且其细胞膜表面存在特异性标记物^[13-16]，因此，将其作为组织工程学的理想种子细胞^[17-19]。端粒酶既能够延长端粒的末端，使其寿命得以增长，又能够维持其长度^[20-21]。正常人体细胞中不能检测出端粒酶活性的表达^[22-23]，其表达的多少主要决定因素是人端粒酶反转录酶^[24-26]。近年来的研究发现，正常人体中人端粒酶反转录酶的表达受到抑制，且其表达是调控人端粒酶活性的重要因素^[27-29]。实验将人端粒酶反转录酶基因转染入大鼠前软骨干细胞，进一步探讨人端粒酶反转录酶基因的表达及调控机制。

TRAP-ELISA检测发现有端粒酶活性存在。RT-PCR检测和Western blot检测结果发现转染后存在人端粒酶反转录酶基因和蛋白的表达，外源性人端粒酶反转录酶转染使其表达量明显增加。由此表明，人端粒酶反转录酶转染对其在前软骨干细胞的表达有明显促进作用，并且不影响其他亚单位的表达，与有关研究结果一致^[24-29]。在对照组、阴性对照序列组中，人端粒酶反转录酶 mRNA 表现为阴性，启动子未被激活。在转染组中前软骨干细胞启动子的活性、mRNA表达处在较高水平^[30-32]，使端粒酶活性增加，端粒长度得以保持，延缓衰老。同时该研究亦证实人端粒酶反转录酶可以加速前软骨干细胞的增殖，诱使其发生永生化，与以往相关文献研究相符合^[33-35]。

综上所述，将人端粒酶反转录酶转染前软骨干细胞，可以明显提高端粒酶活性，S期细胞明显增多。因此，可通过人端粒酶反转录酶转染来促进前软骨干细胞增殖，进而达到治疗软骨损伤的目的。
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