养精胶囊提取液对精原干细胞增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.019

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (14): 2104-2109.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.019

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

养精胶囊提取液对精原干细胞增殖的影响

李俊涛¹，张培海²，曲晓伟³，李郑生¹，李松伟⁴

河南省中医学院第一附属医院，1男科，4风湿科，河南省郑州市 450000；2四川省中西医结合医院男科，四川省成都市 610000；3郑州人民医院泌尿外科，河南省郑州市 450000

收稿日期:2016-02-16 出版日期:2016-04-01 发布日期:2016-04-01
通讯作者: 李郑生，博士，主任医师，河南省中医学院第一附属医院男科，河南省郑州市 450000
作者简介:李俊涛，男，1978年生，河南省宜阳县人，汉族，2014年成都中医药大学毕业，博士，主治医师，主要从事中西医结合男性泌尿生殖系统疾病的临床与基础方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(U1204828)

Seminiferous capsule extract effect on the proliferation of spermatogonial stem cells

Li Jun-tao¹, Zhang Pei-hai², Qu Xiao-wei³, Li Zheng-sheng¹, Li Song-wei⁴

1Department of Andrology, 4Department of Rheumatism, First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China; 2Department of Andrology, Sichuan Hospital of Integrative Medicine, Chengdu 610000, Sichuan Province, China; 3Department of Urology, Zhengzhou People’s Hospital, Zhengzhou 450000, Henan Province, China

Received:2016-02-16 Online:2016-04-01 Published:2016-04-01
Contact: Li Zheng-sheng, M.D., Chief physician, Department of Andrology, First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
About author:Li Jun-tao, M.D., Attending physician, Department of Andrology, First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. U1204828

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

精原细胞：原始的胚细胞经分化形成精原细胞，精原细胞经复制形成初级精母细胞，初级精母细胞经过第1次减数分裂后形成次级精母细胞，再经过第2次减数分裂形成精细胞。精细胞经过变形最终形成精子。精子的数量和质量直接影响着机体的生育能力。

细胞增殖标记物BrdU：BrdU为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期)，活体注射或细胞培养加入，而后利用免疫细胞化学，显示增殖细胞。同时结合其他细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。因组织细胞内无内源性BrdU存在，所以BrdU应用较广。

背景：临床研究显示补肾填精中药能够促进精原干细胞的增殖和分化。

目的：验证养精胶囊提取液对精原干细胞增殖的影响。

方法：取雄性小鼠睾丸，分离精原干细胞，用无血清培养液同步化24 h后，加入10，50，100 mg/L养精胶囊提取液24 h，观察对精原干细胞活性、增殖及细胞周期变化。

结果与结论：①与对照组相比，养精胶囊提取液干预的细胞数量增加、活力增强、S期细胞比例增加，BrdU标记的精原干细胞的数量增加，其中以50 mg/L养精胶囊提取液的效果最为显著；②提示养精胶养精胶囊提取液能促进精原干细胞的增殖和促进精原干细胞活力的增加。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-7382-106X(李俊涛)

关键词: 干细胞, 培养, 养精胶囊提取液, 精原干细胞, 细胞增殖, 小鼠, 细胞培养, 无血清培养, MTT法, 细胞周期, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Chinese herbs for kidney nourishment can promote the proliferation and differentiation of spermatogonial stem cells.

OBJECTIVE: To verify the effect of seminiferous capsule extract on spermatogonial stem cell proliferation.

METHODS: Spermatogonial stem cells were isolated from the testis of male mice and synchronized by serum-free medium followed by an addition of 10, 50, 100 mg/L seminiferous capsule extracts. After 24 hours of culture, viability, proliferation and cell cycle of spermatogonial stem cells were observed.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, seminiferous capsule extracts promoted the cell number, viability and proportion at S stage. The number of BrdU-labeled spermatogonial stem cells was increased significantly after intervention with seminiferous capsule extracts, especially at the concentration of 50 mg/L. These findings indicate that seminiferous capsule extracts can promote the proliferation and viability of spermatogonial stem cells.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Spermatozoa, Cell Proliferation, Tissue Engineering

李俊涛，张培海，曲晓伟，李郑生，李松伟. 养精胶囊提取液对精原干细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(14): 2104-2109.

Li Jun-tao, Zhang Pei-hai, Qu Xiao-wei, Li Zheng-sheng, Li Song-wei. Seminiferous capsule extract effect on the proliferation of spermatogonial stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(14): 2104-2109.

图/表（结果） 6

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照细胞学实验。

1.2 时间及地点实验在2014年9月只2015年9月在河南省中医学院第一附属医院实验室完成。

1.3 材料

动物：SPF级雄性昆明种小鼠30只，鼠龄8-10周，购买于四川省医学科学院实验动物中心，许可证号：SCXK(川)2013-17。实验符合动物伦理学要求，经过动物伦理委员会批准。

药物：养精胶囊，为解放军南京军区总医院院内制剂[院临(2004)第01002号]，溶于蒸馏水中，调整pH至中性后，过滤除菌，-80 ℃保存备用。用DMEM培养基稀释成10，50，100 mg/L的溶液。

养精胶囊干预精原干细胞增殖使用的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
胎牛血清、DMEM培养基、碘化丙腚、胰酶	美国Hyclone公司
MTT	Invitrogen公司
二甲基亚砜	Sigma公司
胶原酶Ⅳ	GIBCO公司
BrdU	BD Biosciences公司
倒置显微镜	日本Nikon公司
酶标仪、流式细胞仪	美国Bio-rad公司
移液器	德国Eppendorf公司

1.4 方法

1.4.1 精原干细胞的分离纯化培养参照文献[12]，戊巴妥纳麻醉雄性小鼠，取睾丸30个，去除上面的白膜纤维膜，Hanks漂洗2次，胰酶消化4 min，Hanks漂洗2次，1 000 r/min离心2 min，去除间质杂质细胞。胰酶消化4 min，用含胎牛血清的培养基终止消化，过滤器过滤，1 000 r/min离心3 min，Hanks清洗，加入培养液(含胎牛血清、100 U/mL青霉素和链霉素)5 mL吹打混匀，以3×10⁵/cm²接种到培养皿中，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中过夜，在细胞贴壁后24 h轻轻吹打收集漂浮的细胞，种植到新的10 cm的细胞培养皿中，去除贴壁较快的其他间质细胞，获得比较纯的精原干细胞，通过锥虫蓝染色，将纯化的精原干细胞用Hanks清洗2次后采用无血清的培养液(加入20 μL含MTT溶液的DMEM/F12培养液)重悬，以2×10⁵/cm²种植到10 cm的培养皿中，每4 d更换培养液1次。在倒置显微镜下观察精原干细胞的形态变化。

1.4.2 养精胶囊提取液对精原干细胞增殖的剂量效应取第4代精原干细胞，胰酶消化，调整细胞密度为1.5×10⁴/孔，接种于24孔培养板，CO₂培养箱中进行培养，之后用无血清的培养基进行培养24 h，加入含10，50，100 mg/L养精胶囊的DMEM培养液，每组作5个重复孔，继续培养24 h后，终止培养，用胰蛋白酶消化成细胞悬液，用血球计数板进行细胞计数。

1.4.3 养精胶囊提取液对精原干细胞活性的影响取第4代精原干细胞，胰酶消化，用PBS洗2次，加入胰酶消化2 min，加入培养液含胎牛血清、1×10⁵ U/L青霉素和链霉素终止消化，1 000 r/min离心4 min，弃上清，加入新的培养液含胎牛血清、1×10⁵ U/L青霉素和链霉素吹打混匀，加入100 μL细胞悬液(2×10⁷ L^-¹)加到96孔板内，每孔种6 000个细胞20个。在CO₂培养箱培养过夜，待细胞贴壁后，吸除培养液，加入0，10，50，100 mg/L养精胶囊提取液，分别于作用12，24，48 h后，每孔加入MTT溶液，继续培养4 h，加入150 μL二甲基亚砜振荡混匀10 min。显微镜下观察活细胞的百分比。实验重复3次。

1.4.4 养精胶囊提取液对精原干细胞周期的影响取第4代精原干细胞，胰酶消化，用PBS洗2次，胰酶消化2 min，培养液 (加入20 μL含MTT溶液的DMEM/ F12培养液)终止消化，1 000 r/min离心4 min，倒弃上清，加入新的培养液(加入20 μL含MTT溶液的DMEM/ F12培养液)吹打混匀，6孔板内每孔接种200 000个细胞，放入CO₂培养箱培养过夜，第2天去除培养液，加入0，10，50，100 mg/L养精胶囊提取液，作用48 h后，胰酶消化， 1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗2遍，冰乙醇固定过夜，PBS洗，吹打重悬细胞，加入RNA酶37 ℃孵育30 min，碘化丙淀染色，4 ℃避光50 min后，流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.4.5 BrdU标记检测养精胶囊提取液对精原干细胞的增殖作用取第4代精原干细胞，胰酶消化，用PBS洗2次，胰酶消化2 min，加入培养液终止消化，1 000 r/min离心4 min，弃上清，加入新的培养液吹打混匀，计数细胞在2×10⁸ L^-¹左右，培养至贴壁，用无血清培养液同步化24 h，10，50，100 mg/L养精胶囊提取液，同步化24 h，加入15 μmol/L BrdU孵育4 h。家兔小鼠BrdU固相抗体，再加入HRP标记的二抗，观察细胞增殖变化。

1.5 主要观察指标精原干细胞活性、增殖及细胞周期变化。

1.6 统计学分析数据用SPSS 20.0统计软件进行分析，以x(_)±s表示，采用t 检验比较组间差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

养精胶囊提取液对精原干细胞增殖的影响

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