体外培养骨髓间充质干细胞的增殖活性：脑灌注剂量CT扫描评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.007

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

CT灌注扫描：是从静脉注射对比剂后对选定层面(1层或多层)进行同层动态扫描，以获得该层面内每1像素的时间-密度曲线，根据该曲线利用数学模型计算脑血流量、脑血容量、对比剂平均通过时间、峰值时间和表面通透性等参数，通过伪彩处理得到组织灌注功能图，用来表现并评价组织器官灌注状态的功能成像方法。它反映的是组织或病灶内造对比剂的灌注规律，以及这些组织或病灶内的血流微循环规律。

MTT检测细胞增殖活性：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490 nm波长处测定其吸光度值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值来判断活细胞数量，吸光度值越大，细胞活性越强。

背景：利用骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性脑血管病是目前的研究热点，移植后大多采用CT脑灌注扫描的方式了解缺血区血流改善情况，但CT脑灌注X射线照射可能会影响所移植骨髓间充质干细胞的活性，并影响到治疗效果。

目的：探讨大鼠CT脑灌注扫描剂量对骨髓间充质干细胞活性的影响。

方法：选取第5代SD大鼠骨髓间充质干细胞，随机分为3组，每组6管。从每组6管中随机选择 1 管不进行照射，其余 5 管分别进行1-5 次 CT 脑灌注扫描。扫描结束之后，连续计数培养10 d的细胞数量，描绘各管细胞生长曲线，流式细胞仪检测各管细胞周期，MTT法检测细胞活性。

结果与结论：连续计数 10 d，各管细胞数量经比较差异均无显著性意义(P > 0.05)。各管细胞的生长曲线基本重合。各管细胞的不同细胞周期比例和细胞活性差异均无显著性意义(P > 0.05)。实验结果表明，常规进行CT脑灌注扫描对骨髓间质干细胞活性无影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0002-0113-2000(付风魁)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间质干细胞, CT脑灌注, X射线, 细胞活性

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation is a hot spot in the treatment of ischemic cerebrovascular diseases, and CT brain perfusion scan is mostly used to observe the improvement in the blood flow in the ischemic region. However, X-ray irradiation during CT brain perfusion may affect the viability of transplanted bone marrow mesenchymal stem cells, and then influence the therapeutic efficacy.

OBJECTIVE: To investigate the effect of CT brain perfusion dose on the viability of bone marrow mesenchymal stem cells.

METHODS: Passage 5 bone marrow mesenchymal stem cells from Sprague-Dawley rats were selected and randomized into three groups, with 6 tubes in each group. One of the six tubes in each group was randomly selected with no irradiation, and the remaining five tubes in each group were subjected to CT brain perfusion scans 1-5 times, respectively. After scanning, the cell number was counted after 10-day continuous culture and cell growth curve of each tube was drawn. Cell cycle was detected by flow cytometry, and cell viability was measured by MTT method.

RESULTS AND CONCLUSION: After 10 days of continuous counting, the number of cells per tube showed no difference (P > 0.05), and cell growth curves were basically coincided. Moreover, there was no significant difference in the cell cycle and cell viability (P > 0.05). Experimental findings show that the CT brain perfusion scan has no effect on the viability of bone marrow mesenchymal stem cells.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Perfusion Imaging, Tomography, Spiral Computed, Tissue Engineering.

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图/表（结果） 6

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞学观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015年6至8月在滨州市人民医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验细胞 SD大鼠骨髓间充质干细胞由上海拜力生物科技有限公司提供，经流式细胞仪检测细胞表面标志物CD29与CD44呈阳性表达，CD45呈阴性表达。

1.3.2 实验试剂及仪器胰蛋白酶(美国Amresco公司)，乙醇(东光鑫源化工有限公司)，锥虫蓝(北京索莱宝科技有限公司)，MTT 溶液(上海微蒙生物技术有限公司)，二甲基亚砜(广州速聚生物科技有限公司)，GE Light Speed64排CT扫描机(美国通用电器公司)，Ependoff 管(上海雅心生物技术有限公司)，流式细胞仪(上海信裕生物科技有限公司)，CO₂培养箱(上海恒远生物科技有限公司)，酶联免疫检测仪(北京裕恒丰科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组与CT灌注扫描选取第5代骨髓间充质干细胞，加入胰蛋白酶进行消化，细胞计数后，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹。将细胞接种在18个Ependoff管(1.5 mL)中，每管1 mL，随机分为3组，每组6管。从每组中随机选择1管不进行射线照射，其余5管分别行1-5次CT脑灌注扫描，按预先设定的大鼠脑灌注方式进行扫描，扫描参数：管电压80 kV，管电流100 mA，矩阵512×512，扫描范围40 mm/s，采集16幅图像，连续扫描40 s，共采集640幅图像，间隔2 min扫描1次，扫描在30 min内完成^[6]。

1.4.2 细胞生长曲线的绘制扫描结束之后，取上述一组6管细胞分别接种于48孔培养板，每孔细胞数量为 2.5×10⁴个。连续10 d每天在同一时间取4孔细胞，添加胰蛋白酶消化，并进行细胞计数^[7]，以每孔细胞数量为纵坐标，培养时间为横坐标，描绘各管细胞生长曲线。
1.4.3 流式细胞仪检测细胞生长周期取一组6管细胞在照射结束之后进行离心，去掉多余的培养液，添加冰冻乙醇制备混合物，置于4 ℃冰箱48 h，利用流式细胞仪检测各管细胞周期[8]。
1.4.4 MTT法检测细胞活性取一组6管细胞混合物进行射线照射，每管取3滴经锥虫蓝染色，计算细胞活力。将细胞接种于96孔培养板，每孔细胞数量为2×104个，每管5孔，置37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中孵育24 h，添加20 µL MTT溶液，继续孵育4 h，吸弃孔内培养液，添加二甲基亚砜150 µL，振荡10 min，利用酶联免疫检测仪检测各孔在490 nm波长处的吸光度值，以150 µL二甲基亚砜为空白对照组[9]。
1.5 主要观察指标不同脑灌注剂量照射下细胞生长计数、细胞生长周期、细胞活性。
1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件完成数据处理。计量资料以x(_)±s表示，并进行方差齐性检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

神经系统疾病具有发病率高、患病率高、致残率高等特点。临床上采用常规治疗大多无法获得理想的效果^[10-14]。为此，积极寻找有效促进脑组织修复以及功能重建的治疗方法，成为临床治疗的重点内容^[15]。随着干细胞理论及相关技术的不断发展，干细胞开始被积极的应用于各种神经系统疾病的治疗^[16-20]。骨髓间充质干细胞具有很强的自我更新和多向分化能力^[21]，且取材方便，移植后不良反应较为轻微，是一种理想的干细胞类型^[22-25]。

随着科学技术的迅猛发展，CT已成为医疗机构诊断治疗疾病不可或缺的辅助手段，其出现将医学影像检查带入了一个新的划时代阶段，CT的不断升级换代显著提高了疾病诊断效果。CT灌注成像作为一种显示器官功能的影像技术，由普通CT增强扫描发展而来，保留了CT检查微创、快速的优点，其在静脉注射对比剂的同时对选定的脑层面进行连续多次同层扫描，可以对脑组织的血流动力学变化进行定量或半定量分析^[26-27]。CT 灌注成像技术不但可以显示器官组织的形态图像，还能显示器官组织的功能图像，可以评价脑组织缺血程度和实际范围等，对于骨髓间充质干细胞治疗效果评估具有重要意义^[28]，然而随着CT的不断普及，显著增加了放射剂量。在扫描过程中，CT脑灌注X射线照射可能会对所移植骨髓间充质干细胞的活性产生影响。

细胞周期指的是细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束整个阶段所经历的过程^[29]。细胞周期可以分为细胞间期以及细胞分裂期(M期)，细胞间期又可以划分为3个不同的阶段，包括G₁期——DNA合成前期，S期——DNA 合成期，G₂期——DNA合成后期^[30]。从放射生物学理论角度进行分析，在接受一定剂量辐射之后，细胞会受到不同程度的损伤^[31]，其中M期细胞最敏感，G₂期细胞对射线的敏感性与M期细胞较为接近，S期细胞对射线的敏感性最差^[32]。研究结果显示，各管照射细胞生长周期呈正态分布，各管细胞的不同细胞周期比例差异均无显著性意义(P > 0.05)，表明经一定的脑灌注CT扫描剂量，骨髓间充质干细胞的分裂期不会受到显著影响，此条件下细胞所受到的直接损伤作用较小。研究结果还显示，将接受不同处理的各管细胞连续培养10 d，细胞数量经比较差异均无显著性意义(P > 0.05)。各管的细胞生长曲线基本重合。经锥虫蓝染色，各管细胞活力平均数均大于95%。未照射组与各照射组细胞活性比较差异无显著性意义(P > 0.05)。上述结果提示，各管细胞生长速度基本保持一致，不同脑灌注剂量照射作用下，细胞生长均未受到较大的影响。以往对放射线照射后细胞活性的研究大多是体内条件下进行，研究内容主要为免疫细胞以及各种肿瘤细胞，关于体外细胞的研究相对较少^[33-37]。另外，在对射线照射与细胞活性相关问题进行研究过程中，大多使用 X 射线治疗机^[38-40]。该实验选择使用CT机进行照射，研究不同照射剂量下的细胞活性，以了解CT扫描监测是否会对干细胞移植效果产生影响。研究结果表明，常规照射剂量不会对骨髓间质干细胞的活性产生影响。受到入组样本数量以及观察时间等因素的影响，研究所得到的相关结果以及相应的结论可能存在一定的片面性和不准确。另外，该实验仅在体外环境下对脑灌注扫描下骨髓间充质干细胞的有关生物学特性进行分析。体外观察性实验与临床体内实际情况存在一定差异，因此，还需要在今后的研究中予以进一步完善和分析，以期为临床治疗等提供更多可靠的参考依据。
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