异氟醚抑制海马神经干细胞增殖并可促其向神经元分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.017

摘要/Abstract

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文题释义：

神经可塑性：研究发现，脑部的神经环路和神经连接终生都处于重组和修饰过程中，脑组织对内外刺激所产生的与功能相关的适应性改变被称为神经可塑性，即脑接受信息并对相同或相似的刺激做出适应性反应的基本过程。神经元之间通过突触进行信息传递和处理，而突触对信息传递和处理的能力是可以变化的，即具有可塑性，这种可塑性是大脑学习和记忆的基础。

异氟醚作用机制：异氟醚由于诱导和苏醒迅速、肌松弛良好及对循环系统抑制作用轻，已成为目前临床上应用较广泛的吸入麻醉药。异氟醚的全麻机制主要与增强GABA_A受体及降低N-甲基-D-天冬氨酸受体的功能，抑制电压门控性钠通道，激活电压门控性钾通道，同时也与一些神经递质及第二信使有关。

背景：异氟醚不仅可诱发新生大鼠广泛的大脑神经元凋亡，还可抑制新生大鼠海马神经发生，引起海马依赖性的学习记忆缺陷。

目的：探讨异氟醚对海马神经干细胞增殖、分化的影响。

方法：26只SD大鼠随机分为空气组和异氟醚组，每组13只。异氟醚组大鼠先吸入体积分数2.5%异氟醚3 min后再吸入体积分数1.5%异氟醚维持4 h，空气组仅吸入空气。干预后检测两组大鼠血糖、动脉血气指标；干预前以及干预结束后腹腔注射5-溴脱氧尿苷，末次注射5-溴脱氧尿苷后24 h取脑组织，制备冰冻切片，进行免疫荧光染色。

结果与结论：①两组大鼠pH、PaO₂、PaCO₂、HCO₃、BE以及SaO₂水平差异无显著性意义(P > 0.05)。②异氟醚组大鼠BrdU⁺细胞计数显著少于空气组(P < 0.05)。③异氟醚组NeuroD⁺/BrdU⁺细胞显著高于空气组(P < 0.05)。④异氟醚组不良反应发生率为23%，显著高于空气组(7.7%)，差异有显著性意义 (P < 0.05)。⑤结果表明异氟醚能够抑制海马齿状回神经干细胞增殖并促进其向神经元分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0002-0420-7768 (孙鼐)

关键词: 干细胞, 分化, 神经干细胞, 异氟醚, 海马, 细胞增殖, 细胞分化, 不良反应

Abstract:

BACKGROUND: Isoflurane cannot only induce a wide range of large neuronal apoptosis, but also inhibit hippocampal neurogenesis in neonatal rats, thereby resulting in hippocampus-dependent learning and memory defects.

OBJECTIVE: To investigate the isoflurane effect on proliferation and differentiation of the hippocampal neural stem cells.

METHODS: Twenty-six Sprague-Dawley rats were randomly divided into air group and isoflurane group (n=13 per group). Rats in the isoflurane group were subjected to 2.5% isoflurane inhalation for 3 minutes followed by 1.5% isoflurane inhalation for 4 hours. Rats in the air group only breathed in air. After the intervention, blood glucose and arterial blood gas changes were detected in the two groups. Additionally, rats in the two groups were given intraperitoneal injection of 5-bromodeoxyuridine before and after intervention. At 24 hours after the last injection of 5-bromodeoxyuridine, brain tissues were taken to make frozen sections for immunofluorescence staining.

RESULTS AND CONCLUSION: There were no significant difference in pH, PaO₂, PaCO₂, HCO₃, BE and SaO₂ levels between the two groups (P > 0.05). Compared with the air group, the number of BrdU⁺ cells was significantly less in the isoflurane group (P < 0.05), while the number of NeuroD⁺/BrdU⁺ cells was significantly higher in the isoflurane group (P < 0.05). The incidence of adverse reactions was 23% in the isoflurane group, which was significantly higher than that in the air group (7.7%; P < 0.05). These findings indicate that isoflurane can inhibit the proliferation of neural stem cells in the hippocampal dentate gyrus, and promote their differentiation into neurons.

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图/表（结果） 4

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引言

很多小儿临床创伤或非创伤操作和检查时均需要对其进行镇静和(或)在麻醉下完成^[1]，例如：超声检查、CT和MRI、气管镜、胃肠镜、骨髓穿刺、深静脉穿刺等。由于小儿正处于生长发育阶段，全身器官功能未完全成熟，使得对镇痛、麻醉要求相对较高。给药方法主要包括静脉给药、直肠给药、吸入给药、肌肉或皮下注射给药，部分患者麻醉时甚至需要进行蛛网膜下腔给药、神经阻滞等，其中静脉给药和吸入给药最为常见^[2-3]。异氟醚是临床上使用较多的吸入麻醉药物，该药物属于一种GABA_A受体激动剂^[4-6]，具有麻醉起效快、不良反应发生率低、苏醒速度快等特点。

海马是人脑的重要组成部分，担负记忆存储、信息处理、内脏和情绪等诸多生理功能活动，海马受到损伤或药物刺激后，其形态异常或功能失调，从而导致相关的学习、认知功能障碍，严重者将会引起痴呆等，局部区域的神经元细胞群因变性坏死或丢失成为该疾病的主要病理特征^[7-8]。研究表明，哺乳动物内源性神经干细胞主要存在于海马齿状回颗粒层下和室管膜下区，在生理刺激及脑损伤等病理因素的直接刺激下，内源性神经干细胞能大量增生并持续数周，新生的细胞能进一步分化为神经元并向脑损伤区域迁移，逐步替代受损的神经元，如果抑制神经干细胞的增生，将会影响脑损伤后认知功能的恢复，由此看出：内源性神经细胞再生对脑损伤后功能的恢复具有重要的影响。相关研究显示：在新生动物脑发育高峰期使用全身麻醉药物引起神经细胞凋亡，严重者甚至引起认知功能障碍^[9-11]。近年来陆续有文献报道氯胺酮和异氟醚等药物具有细胞毒性，单独或联合使用可诱发哺乳动物未发育成熟大脑神经元出现广泛凋亡^[12-13]。为此，实验通过形态学方法观察异氟醚对大鼠海马神经干细胞增殖、分化的影响。

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点于2014年11月至2015年12月在郑州大学附属郑州中心医院完成。

1.3 材料 SD大鼠26只，3-6月龄，清洁级，体质量0.16-0.25 kg，平均(0.19±0.04) kg，雌雄不限，由郑州大学医学院动物实验中心提供。实验过程中对SD大鼠的处理符合动物伦理学要求^[14-15]。26只SD大鼠随机分为空气组和异氟醚组，每组13只。

1.4 实验方法将异氟醚组大鼠放置在实验箱中，使用气体监测仪动态监测异氟醚、氧气以及二氧化碳体积分数，保证异氟醚吸入体积分数控制在2.5%，大鼠吸入异氟醚 3 min后将异氟醚体积分数调整为1.5%，维持 4 h，异氟醚以混合空气输送，气体流量为1.5 L/min。空气组仅吸入空气。干预后检测两组大鼠血糖、动脉血气^[16-17]。分别于给药前以及给药结束后腹腔注射5-溴脱氧尿苷，末次注射5-溴脱氧尿苷后24 h行全身灌注、固定，取脑组织，制备冰冻切片，进行免疫荧光染色^[18-19]。

1.5 主要观察指标

1.5.1 两组大鼠血糖、动脉血气指标利用血糖仪以及动脉血气仪检测血糖和动脉血气指标，如：pH、PaO₂、PaCO₂、HCO₃、BE以及SaO₂水平^[20-21]。

1.5.2 免疫荧光检测脑组织切片经枸橼酸缓冲液修复后，加入盐酸进行DNA变性，然后用驴血清封闭非特异性抗原，加入山羊抗神经源性分化蛋白(NeuroD)抗体孵育，弃去一抗，PBS漂洗，加入荧光二抗避光孵育，弃去二抗，PBS漂洗，用山羊血清重新封闭后，加入山羊抗大鼠BrdU抗体孵育，弃去一抗，PBS漂洗，加入山羊抗大鼠DyLight594抗体孵育，PBS漂洗，DAPI复染细胞核，甘油封固，荧光显微镜观察。选择3张相类似的平面切片，采用图像分析软件进行BrdU⁺细胞计数，观察神经干细胞增殖情况；再随机选择200个BrdU⁺细胞，进行NeuroD⁺细胞计数，计算NeuroD⁺细胞计数与BrdU⁺细胞计数的比值，反映神经干细胞向神经元分化情况^[22]。

1.5.3 两组大鼠不良反应发生率观察两组大鼠发生紫绀、呼吸抑制及其他不良反应。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0处理，计数资料行卡方检验，计量资料行t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

吸入性麻醉药物在临床上使用较多，由于吸入麻醉可控性好，使用过程中对机体呼吸、循环的影响相对较小，再加上患者使用过程中不良反应少等特点，使得吸入麻醉在儿科以及妇产科中广为运用^[23-24]。临床上使用的麻醉药对发育中哺乳动物大脑存在潜在的危害，且在大脑快速发育期即突触形成过程中容易造成其大脑敏感区域神经细胞出现明显的凋亡。目前，对于麻醉药物引起的神经细胞凋亡与神经功能损害机制尚不完全知晓。随着人们对麻醉药物研究的不断深入，发现异氟醚、七氟醚等容易产生神经毒性，主要表现为中枢神经系统组织病理学改变，神经细胞出现凋亡，抑制轴突生长发育以及脱髓鞘反应等，进一步出现学习记忆能力、认知功能障碍^[25-26]。异氟醚组3只大鼠出现不良反应，发生率为23%，显著高于空气组(1只，7.7%)。由于海马神经与机体学习、记忆功能关系密切，再加上NMDA受体拮抗剂能引起未成熟脑神经细胞的凋亡，因此，麻醉剂的安全性及对大脑发育的影响受到人们的一致关注^[27-28]。

异氟醚在儿科中使用较普遍，患儿使用异氟醚后很少引起颅内压增高，并且用药后药物在机体内的代谢产物相对较少，从而对机体产生的不良反应发生率相对较少^[29]。同时，异氟醚在标准大气压下沸点为48.5 ℃，使得该药物在液态下十分容易挥发，采用该药物麻醉时方法简便，可控性相对较好^[30]。研究显示，利用高碳酸血症或低血糖对新生大鼠进行相应处理时容易造成脑组织神经元凋亡。此项研究结果显示，异氟醚组大鼠麻醉后pH、PaO₂、PaCO₂、HCO₃、BE以及SaO₂水平差异无显著性意义(P > 0.05)。由此看出异氟醚麻醉并不会对血糖、动脉血气等产生影响。

BrdU是一种胸腺嘧啶脱氧核苷的类似物，该物质在DNA合成期掺入到细胞DNA双链中，能够有效标记增殖期的细胞^[31-32]。当细胞发生分裂后，BrdU可传递给其子细胞^[33]。因此，BrdU应用于神经发生的研究中，能够动态监测神经干细胞的整个演化过程，如细胞增殖、分化、迁移和存活等。实验选择在麻醉前以及麻醉后各注射1次BrdU，并在第2次给药后24 h测定BrdU的表达，了解海马神经细胞的增殖情况^[34-35]，结果表明异氟醚组大鼠BrdU⁺细胞计数显著少于空气组(P < 0.05)，说明异氟醚麻醉可抑制新生大鼠齿状回神经干细胞的增殖。

NeuroD是一种原神经碱性螺旋-环-螺旋转录因子，能够调控海马神经细胞的终末分化，当短暂扩增神经干细胞表达NeuroD时，表明其开始逸出细胞周期而停止有丝分裂，并分化为神经母细胞^[36-37]。实验结果显示异氟醚组海马齿状回存在大量的新生细胞表达NeuroD，在门区NeuroD⁺/BrdU⁺相对较高。异氟醚组NeuroD⁺/ BrdU⁺细胞显著高于空气组(P < 0.05)。国外学者研究结果显示：神经干细胞在发生去极化后，可通过多途径抑制神经干细胞DNA的合成^[38]，并促进其向神经元分化^[39-40]。异氟醚可能通过上述机制促进神经干细胞向神经元分化而抑制神经干细胞增殖。因此，临床应尽可能选择更加合适的麻醉药物，减少麻醉药对海马神经细胞的影响，提高手术成功率，促进机体早期恢复^[41]。