高渗环境结合氯化钴低氧预处理骨髓间充质干细胞移植治疗椎间盘退变

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.012

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (10): 1452-1460.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.012

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高渗环境结合氯化钴低氧预处理骨髓间充质干细胞移植治疗椎间盘退变

叶涵¹，孟真²，林嘉琛³，李嘉伟⁴，张永兴²，林南河²，赵庆华²

¹复旦大学附属中学，上海市 200433；²上海市第一人民医院，上海市 201620；³上海交通大学医学院附属仁济医院，上海市 200127；⁴解放军第四军医大学附属西京医院，陕西省西安市 710032

收稿日期:2016-01-26 出版日期:2016-03-04 发布日期:2016-03-04
通讯作者: 赵庆华，上海市第一人民医院，上海市 201620
作者简介:叶涵，主要从事高中生身心健康方面的研究。
基金资助:
上海市自然科学基金(14ZR1433100)

Pretreatments with hypertonic solution and cobalt chloride in bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for treatment of degenerative disc disease

Ye Han¹, Meng Zhen², Lin Jia-chen³, Li Jia-wei⁴, Zhang Yong-xing², Lin Nan-he², Zhao Qing-hua²

¹High School Affiliated to Fudan University, Shanghai 200433, China; ²Shanghai General Hospital, Shanghai 201620, China; ³Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University Medical School, Shanghai 200127, China; ⁴Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China

Received:2016-01-26 Online:2016-03-04 Published:2016-03-04
Contact: Zhao Qing-hua, Shanghai General Hospital, Shanghai 201620, China
About author:Ye Han, High School Affiliated to Fudan University, Shanghai 200433, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Shanghai, No. 14ZR1433100

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

高渗透压细胞培养：可促进干细胞向髓核细胞分化，并可通过影响低分子量酪氨酸磷酸酶等蛋白活性，激活JNK等多条信号通路，调节自噬等途径影响细胞存活。

低氧环境细胞培养：可影响干细胞的分化，并可调节低氧诱导因子等信号通路，影响低氧相关microRNA表达等途径影响细胞的活性和功能。高渗低氧的刺激均可影响细胞代谢，增强细胞的负向调控能力。

背景：有研究表明，干细胞可以用来预防和治疗椎间盘退变类疾病，但由于椎间盘的低氧高渗的特殊环境，使得体外培养的干细胞移植到椎间盘以后存活率及分化能力降低，治疗效果不佳。提高干细胞的移植效率及治疗效果成为干细胞移植治疗椎间盘退变研究的难点和热点。

目的：观察氯化钴和高渗溶液预处理对骨髓间充质干细胞移植治疗椎间盘退变疾病效果的影响。

方法：①细胞体外实验，将骨髓间充质干细胞分为3组，对照组正常培养，高渗组采用体积分数1%高渗母液干预，低氧组采用100 μmol/L氯化钴干预，高渗低氧组采用体积分数1%高渗母液和100 μmol/L氯化钴联合干预，培养1周后，使用体积分数2%高渗母液和200 μmol/L氯化钴作为应激条件分别对预处理骨髓间充质干细胞和未处理骨髓间充质干细胞进行刺激24 h，以RT-PCR检测caspase-3的表达评估细胞凋亡情况；②动物体内实验：将SD大鼠分为3组，对照组建立椎间盘退变模型大鼠，细胞移植组造模后骨髓间充质干细胞移植治疗，高渗低氧治疗组造模后采用高渗低氧预处理后的骨髓间充质干细胞治疗，细胞分别移植至大鼠针刺椎间盘退变模型的椎间盘中，2周后取材，以免疫组织化学染色鉴定细胞分布情况、RT-PCR检测相关基因表达情况，评估预处理对于干细胞治疗效果的影响。

结果与结论：①细胞体外实验：经预处理的骨髓间充质干细胞的caspase-3 mRNA的表达相比未经处理的对照组明显降低(P < 0.05)；②动物体内实验：相较于对照组，细胞移植组椎间盘caspase-3、白细胞介素1β以及多项椎间盘退行性指标的mRNA表达量均呈现下降趋势，高渗低氧治疗组的效果更佳(P < 0.05)；③结果证实：骨髓间充质干细胞具有治疗椎间盘退变的潜力，且经高渗低氧预处理后对高渗低氧应激的适应性增强，移植效果更佳。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0001-9104-0216 (赵庆华)

关键词: 干细胞, 移植, 椎间盘退变, 干细胞治疗, 骨髓间充质干细胞, 高渗, 低氧, 增殖活性, 凋亡, 基质金属蛋白酶3, 基质金属蛋白酶13, caspase-3, 上海市自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Stem cell therapy has been used for prevention and treatment of degenerative disc disease. Considering the special microenvironment in the intervertebral disc, the survival rate and differentiation ability of transplanted cells are decreased, which may lead to the poor efficacy of stem cell therapy. How to improve the survival ability and therapeutic effect of the transplanted cells is the focus of stem cell therapy for degenerative disc disease.
OBJECTIVE: To investigate the effects of cobalt chloride combined with hypertonic solution pretreatment on bone marrow mesenchymal stem cells that will be transplanted for treatment of degenerative disc disease.
METHODS: (1) In vitro cell experiment: bone marrow mesenchymal stem cells were divided into three groups and subjected to normal culture medium (normal control group), 1% hypertonic mother solution (hypertonic group), 100 μmol/L cobalt chloride (hypoxia group), or 1% hypertonic mother solution plus
100 μmol/L cobalt chloride (combined group) for 1 week. Then, 2% hypertonic solution and 200 μmol/L cobalt chloride cobalt chloride were used to simulate the anaerobic and hypertonic environment intervenes in pretreated and untreated bone marrow mesenchymal stem cells for 24 hours. After that, RT-PCR was used to detect the expression of caspase-3 for apoptosis evaluation. (2) In vivo animal experiment: Sprague-Dawley rats were divided into model, cell transplantation and hypertonic plus hypoxic groups. Rat models of intervertebral disc degeneration were made in these three groups. After modeling, rats in these three groups were given no treatment, bone marrow mesenchymal stem cell transplantation or transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells which were subjected to hypertonic and hypoxia pretreatments into the intervertebral disc. Two weeks later, immunohistochemistry and RT-PCR methods were used to detect cell distribution and related gene expression, respectively, thereby to evaluate the therapeutic effect of stem cells.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In vitro cell experiment: caspase-3 mRNA expression was significantly reduced in pretreated bone marrow mesenchymal stem cells compared with the untreated cells (P < 0.05). (2) In vivo animal experiment: compared with the control group, the caspase-3 and interleukin-1β in the intervertebral disc and a number of degenerative indexes were decreased in the cell transplantation. Compared with the cell transplantation group, these indicators had better outcomes in the hypertonic plus hypoxic group (P < 0.05). These findings indicate that bone marrow mesenchymal stem cells have therapeutic potential for degenerative disc disease, and have better adaptability and transplantation effects by hypertonic and hypoxia pretreatments.

叶涵，孟真，林嘉琛，李嘉伟，张永兴，林南河，赵庆华. 高渗环境结合氯化钴低氧预处理骨髓间充质干细胞移植治疗椎间盘退变[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(10): 1452-1460.

Ye Han, Meng Zhen, Lin Jia-chen, Li Jia-wei, Zhang Yong-xing, Lin Nan-he, Zhao Qing-hua. Pretreatments with hypertonic solution and cobalt chloride in bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for treatment of degenerative disc disease[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(10): 1452-1460.

图/表（结果） 5

2.1 细胞提取鉴定结果提取的骨髓间充质干细胞纯度及分化能力鉴定结果：所取得的骨髓间充质干细胞，绝大多数CD29，CD90表达阳性，CD31，CD45表达阴性，符合骨髓间充质干细胞表达特点，细胞纯度高，并经过诱导培养基处理3周后，分化为成骨细胞(碱性磷酸酶和茜素红阳性)和脂肪细胞(油红O染色阳性)。见图1，2。

2.2 体外实验结果

2.2.1 高渗和低氧对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响高渗低氧浓度梯度表明，在高渗母液超过体积分数1%时，对骨髓间充质干细胞的生长活性产生显著影响，并随浓度增加影响增强；低氧梯度显示，氯化钴加入可显著影响细胞活性，且与浓度呈正相关。选择体积分数1%高渗母液联合100 μmol/L氯化钴作为高渗低氧预处理条件，对细胞增殖影响和细胞凋亡影响均显著，但均属可接受范围。在具有较强预处理效果同时，可兼顾细胞活性。见图3。

2.2.2 高渗低氧预处理对骨髓间充质干细胞高渗低氧应激的影响高渗低氧预处理1周的骨髓间充质干细胞，相比对照组，对高渗应激和低氧应激的抵抗能力更强。PCR结果显示，应激处理前，预处理骨髓间充质干细胞，在caspase-3的表达趋势上略高于对照组，但差异无显著性意义；在体积分数2%高渗条件刺激和200 μmol/L氯化钴条件分别刺激后，caspase-3的表达量显著低于对照组(P < 0.05)。见图4。

2.3 体内实验结果

2.3.1 实验动物数量分析 50只大鼠均进入结果分析，无死亡和感染。

2.3.2 针刺法造成大鼠尾椎椎间盘退变模型的鉴定结果椎间盘针刺后4周，相比相邻节段对照组，针刺后椎间盘caspase-3表达略升高，但差异无显著性意义，白细胞介素1β，A4，A5，MMP3及MMP13基因表达升高(P < 0.05)。见图5。

2.3.3 高渗低氧预处理骨髓间充质干细胞与否治疗椎间盘退变的效果比较组织切片因需要经过脱钙，脱水处理，髓核内结构脱水挛缩，其中荧光显微镜下绿色荧光蛋白阳性者为骨髓间充质干细胞，见图6。相比干细胞治疗前，细胞移植组2周后，caspase-3和白细胞介素1β的表达以及A4，A5，MMP3及MMP13的基因表达显著降低(P < 0.05)，经高渗低氧预处理后的干细胞，作用更为显著(P < 0.05)，见图7。

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引言

随着现代生活工作方式的改变，因椎间盘退行性病变导致的下腰痛、颈肩痛等系列疾病的发病率不断增加^[1]。目前数据显示70%的人在一生中会受到下腰痛的困扰，严重影响着公众健康^[2]，造成了巨大的社会经济损失^[3]。椎间盘退变是在多种因素长期刺激下，髓核细胞凋亡，细胞外基质改变，炎性刺激和血管长入的复杂过程^[4]。临床上，椎间盘退变类疾病的治疗主要为缓解症状，却无法阻止其退变进程。大量研究表明，通过干细胞移植，可以分化为类髓核细胞增加椎间盘细胞和基质数量^[5]、抑制核因子κB通路减缓退变进程^[6]，调节基质金属蛋白酶12 (matrix metallopeptidase12，MMP12)和热休克蛋白47表达抑制椎间盘纤维化进程^[7]，影响Fas/FasL通路保护椎间盘内免疫豁免环境^[8]。总而言之，干细胞移植具有重要的临床应用前景。

从移植条件来看，成年人椎间盘是人体最大的无血管结构^[9]，通过被动扩散完成营养和物质更新^[10]。而椎间盘内特殊的高渗低氧环境^[11-12]，可对移植进入的干细胞造成应激损伤。对于普通培养的干细胞，突然增高的渗透压或低氧环境，可以激活多条通路^[13-14]，直接导致干细胞活性减低和凋亡增加。同时，细胞还可通过调节相关蛋白的表达^[15]，对高渗或低氧的不良环境产生适应性。干细胞对周围环境具有一定的适应能力^[16]，并在不同的渗透压环境下，分化方向不同^[17]。在治疗椎间盘退变中，干细胞移植后的局部环境对其生存情况的影响，尚缺乏足够的研究，对干细胞应用于椎间盘退行性病变的治疗，具有极其重要的影响。

因此实验假设，高渗低氧预处理骨髓间充质干细胞可减少因椎间盘内高渗低氧应激所致的细胞损伤，增加移植细胞存活率，提高治疗效果。实验先通过梯度实验确定预处理的条件，再比较干细胞预处理组和对照组对高渗低氧应激的适应能力的差异，最后将细胞移植到退变椎间盘动物模型体内，验证效果。

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2014年11月至2015年6月在解放军第二军医大学解剖学教研室完成。

1.3 材料雄性SPF级SD大鼠16只，体质量(200± 10) g；雄性SPF级GFP转基因SD大鼠2只，体质量(50± 10) g，均购自第二军医大学动物中心(动物许可证编号：2008001647623)，动物实验处理过程均符合实验动物伦理要求。

1.4 体外实验

1.4.1 原代骨髓间充质干细胞的提取参照文献中报道的方法完成间充质干细胞的提取和鉴定^[18]，简述如下：取SD大鼠2只，麻醉处死后，置于体积分数75%乙醇中浸泡消毒5 min，超净台内手术完整取出双侧股骨，钝性分离去除多余筋膜肌肉，于预冷DF-12培养基(Gibco，美国)内剪断双侧干骺端，使用2 mL注射器吸取无血清培养基反复冲洗，直至髓腔变白。将骨髓冲洗液移入50 mL离心管(Gibco，美国)中，以150×g速度离心5 min，弃去上清液，使用10 mL完全培养基(体积分数10%FBS，DF-12，1%三抗)重悬，接种于T75培养瓶(Thermo，美国)内，置于37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度孵育箱中培养。培养12 h后换液，随后隔天更换培养基。每次换液前，先使用PBS冲洗2遍。待集落明显时，进行传代培养。采用流式抗体 CD29，CD31，CD45，CD90 (BD，美国)对所用细胞进行纯度检测。使用骨髓间充质干细胞定向成骨、成脂诱导培养基(Cyagen，美国)对所取得的骨髓间充质干细胞进行定性分化诱导。

采用茜素红染色剂(谷歌生物，中国)和碱性磷酸酶染色试剂盒(斯丹赛，中国)进行成骨分化鉴定，使用油红O染色剂(谷歌生物，中国)进行成脂分化鉴定。检测方法按照试剂盒说明进行，固定后直接加入染色工作液，常温染色15 min后，洗涤封固后观察。

1.4.2 高渗、低氧培养液的配制母液配方按照已有的文献方法进行配比计算：将21.5 g的NaCl溶于100 mL双蒸水中，配成高渗母液。使用时按照体积分数进行配比。将100 mg氯化钴(Sigma，美国)溶于5 mL双蒸水中，配成84 mmol/L氯化钴母液。

1.4.3 不同浓度的高渗低氧对骨髓间充质干细胞的增殖活性的影响检测将3代骨髓间充质干细胞以5×10³个/孔，100 μL体积种于96孔板内，待细胞贴壁后更换不同干预培养基，其中高渗培养组，分别使用含有体积分数0%，0.1%，0.25%，0.5%，1%，1.5%高渗母液的完全培养基培养24 h。低氧培养组，分别使用还有0，100，150，200，250，300 μmol/L氯化钴的完全培养基培养24 h。实验重复3次，其中每种浓度使用3个复孔。培养24 h后使用CCK-8试剂盒(碧云天，中国)，严格按照试剂盒说明书的检测步骤操作，使用酶标仪(Bio Tek，美国)在紫外线450 nm处检测不同高渗及低氧环境下骨髓间充质干细胞的增殖情况。

1.4.4 高渗和低氧对骨髓间充质干细胞增殖及凋亡的影响检测根据浓度梯度实验结果，高渗低氧组选择体积分数1%高渗母液，100 μmol/L氯化钴为预处理条件，对照组为普通培养基。实验重复3次，每次使用3个复孔。按照上述方法，高渗低氧组和对照组培养24 h后，CCK-8法检测两组细胞增殖活性的差异，确定高渗和低氧对细胞增殖活性的影响。将3代骨髓间充质干细胞以1×10⁵/孔的密度种于6孔板内培养 24 h后，以流式细胞检测技术，使用AnnexinⅤ-PI细胞凋亡检测试剂盒(BD，美国)，检测两组细胞凋亡的差异，确定高渗和低氧对细胞凋亡的影响。

1.4.5 高渗低氧预处理，细胞耐受能力检测将3代骨髓间充质干细胞以1×10⁵/孔的密度种于6孔板内，分为对照组(普通培养基培养)、高渗组(体积分数1%高渗母液的完全培养基)，低氧组(体积分数1%高渗母液的完全培养基)和高渗低氧组(体积分数1%高渗母液和1%高渗母液的完全培养基)条件下培养1周。将培养基更换含体积分数2%高渗母液，含有200 μmol/L氯化钴，以及同时含有体积分数2%高渗母液和200 μmol/L氯化钴的混合培养基培养24 h，每组各有5个复孔。收集实验组和对照组干预后的细胞，使用AnnexinⅤ-PI细胞凋亡检测试剂盒(BD，美国)，严格按照试剂盒操作步骤操作，使用流式细胞仪(Beckman Coulter FAC500，美国)检测两组细胞不同处理后细胞凋亡的差异。

使用RT-PCR方法，设计合成大鼠细胞caspase-3引物(生工，上海)，引物序列见表1。按照PCR的操作步骤，经提取RNA，反转录成DNA，扩增检测等步骤，检测两组细胞不同处理后细胞caspase-3 mRNA的表达的差异。参照试剂盒说明书，使用TRIzol将软骨细胞和组织内RNA提取后，使用反转录试剂盒将其反转录为cDNA。使用MyiQ™仪器(Bio-Rad)，SYBR Green Real-time PCR master Mix试剂盒(Toyobo Biotech， Osaka，Japan)完成RT-PCR的测定，内参选择GAPDH。具体取样时间及分组见各实验步骤。测定结果使用2^-^??Ct方法计算，实验分别独立重复3次。

1.5 体内实验

1.5.1 椎间盘退变模型大鼠的构建依据Lssy椎间盘退变的造模方法^[19]，将200 g雄性SD大鼠5只，以体积分数10%水合氯醛腹腔麻醉后，手术暴露鼠尾椎间盘，以20 G针头自背侧方向刺穿纤维环，顺时针和逆时针360°旋转，充分止血消毒后缝合，于造模后第4周取材检验造模效果。

建模4周后取手术节段及处理阶段上下未处理节段，采用Trizol试剂从新鲜组织中提取总RNA，经反转录成DNA、扩增、检测等步骤，检测造模与否对椎间盘组织MMP13，MMP3，TIMP1，ADAMTS4(A4)，ADAMTS5(A5) mRNA表达的影响，以验证动物模型的建立情况。引物有上海生工有限公司合成，引物序列见表1。内参选择GAPDH，测定结果用2^-^??Ct方法计算，分别独立重复3次，基因表达相对对照组变化为观测指标。

1.5.2 细胞移植将预处理后细胞及对照细胞使用等渗透压胰酶和培养基消化中和，离心后使用PBS洗涤1次，随后调整细胞浓度至1×10¹⁰ L^-¹冰上备用。为进行示踪，所用骨髓间充质干细胞取自绿色荧光蛋白(GFP)转基因大鼠。

将雄性SD大鼠45只随机分为对照组，细胞移植组，高渗低氧治疗组，每组各15只。其中对照组为造模处理后注射2.5 μL培养基，细胞移植组为造模后注射2.5 μL普通培养基培养的骨髓间充质干细胞，高渗低氧治疗组为造模后注射2.5 μL高渗低氧培养基培养的骨髓间充质干细胞(1×10⁶)。参照已有文献方法^[20]，将造模成功后大鼠麻醉后，手术暴露穿刺椎间盘，以2.5 μL汉密尔顿微量进样器，小心刺入目标椎间盘内，缓慢注入2.5 μL细胞悬液，5 min后缓缓拔出。因针头极细且相对柔软，刺入时动作需轻柔。做好标记后消毒缝合。2周后，取样进行RT-PCR检测。

1.5.3 组织学观察将大鼠麻醉后，剪取鼠尾，轻轻挤压驱除血液，暴露目标椎间盘后，使用眼科剪，沿椎间盘上下缘，连同终板软骨一起取下。液氮保存或 100 g/L多聚甲醛固定后行组织切片前处理。将手术所取完整椎间盘，于40 g/L多聚甲醛中固定6 h，使用手术刀削去软骨终板后，进行冰冻切片(髓核脱水后会形成空洞，无法观察)，使用抗原修复液95 ℃下修复10 min，DAPI(1∶1 000)染色5 min，封固后荧光显微镜下观察。

1.6 主要观察指标 CCK法检测出的吸光度变化，以反映细胞不同条件下的活性凋亡率的变化，比较各组间对应激条件的不同反应。使用2^-^??Ct法计算PCR检测所得到的相应基因的表达倍数关系，反应各组在椎间盘退变上的差异。

1.7 统计学分析使用Graph Pad Prism 5软件制图。数据分析使用SPSS 21.0软件进行，计数资料使用x(_)±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析和LSD法，以P ≤ 0.05为显著性意义。

讨论

实验在细胞层面上，通过梯度高深低氧预处理干细胞后检测细胞活性，探索出一个较为适宜的处理条件，再模拟生理条件的高深低氧的应激刺激，证明在体外，干细胞经高渗低氧预处理后对更高程度的高渗低氧刺激适应抵抗力更强。在体内实验层面上，通过比较移植经高渗低氧预处理后的干细胞、未处理细胞和对照组，证明在体情况下，干细胞移植的治疗效果，且经预处理后效果更佳，与体外实验结果相符。实验证明细胞经低浓度的高渗低氧预处理后，对高浓度的刺激适应力更强，且体内移植治疗效果更佳。

实验存在以下局限性：首先对于高渗低氧环境的模拟存在局限性，目前无法明确退变后的椎间盘内渗透压情况和缺氧情况。与此同时，氯化钴模拟细胞低氧环境的作用机制是二价钴离子诱导细胞中低氧诱导因子及其调控基因表达，模拟常规氧气状态下的细胞缺氧状态，这与椎间盘内组织低氧的状态有所不同^[21]，但作为低氧诱导因子的稳定激活剂，氯化钴刺激后所带来的低氧诱导因子下游产物的表达^[22]，很可能是细胞抗缺氧能力提升的原因^[23]，在此次研究中定向性更好。且没有直接证据表明氯化钴在细胞内没有蓄积作用，因此1周培养之后，体外再次刺激以及大体移植后所得结果，可能受到残余钴盐的影响。其次细胞检测过程中所用试剂存在渗透压偏差。在高渗处理细胞的后续检测过程中，虽所用的体积分数0.25%胰酶及PBS等溶液经等比例渗透压调整，但各试剂盒相对低渗等不可控因素均可能对检测结果造成一定影响。检测试剂相对低渗，可导致检测得到损伤指标较实际情况偏高，即便如此，预处理组的结果显示各损伤指标仍低于对照组，在此大体检测中无法规避移植细胞本身的影响。然而考虑到移植初始细胞数量基本一致，故仍具有可比性，能够充分说明移植后椎间盘状态。综上而言，尽管有局限性存在，但对实验结果的可靠性影响不大。

在最佳的预先处理条件的选择上，应遵循对细胞活性影响轻微，处理后可显著提高高渗低氧适应性为原则。在梯度实验结果的基础上，实验选择了对细胞活性显著影响，但程度较轻微的体积分数1%高渗母液联合100 μmol/L氯化钴的作为预处理条件。这样一方面可以控制预处理时间，防止因长期培养和预处理而产生的细胞分化另一方面，因高渗低氧的干预存在浓度依赖性^[24-25]，故可通过增加干预浓度提高预处理效率。综上，为短期高效的达到预处理效果，在不显著降低细胞活性或增加细胞凋亡的情况下，选择较高浓度进行干预可能更为合适。

高渗应激对于普通细胞的损伤是明确的^[26]，在预处理后，干细胞对高渗低氧的耐受能力提高。在检测方法上，因检测时所用试剂渗透压变化影响检测结果，尽量选取RT-PCR对渗透压无明显影响的指标作为主要依据。RT-PCR检测代谢凋亡等相关指标，反应应激条件下细胞损伤情况。体内实验预处理后细胞治疗效果更佳，同细胞实验结果相印证，可能的机制为预处理后的移植细胞存活率增高，活性更好。

高渗透压培养可促进干细胞向髓核细胞分化^[27]，并可通过影响低分子量酪氨酸磷酸酶等蛋白活性^[28]，激活JNK等多条信号通路^[29]，调节自噬等途径影响细胞存活。低氧环境可影响干细胞的分化^[17]，并可调节低氧诱导因子等信号通路，影响低氧相关microRNA表达等途径影响细胞的活性和功能^[15]。高渗低氧的刺激均可影响细胞代谢，增强细胞的负向调控能力。

总之，干细胞具有较强的适应能力。在经低浓度的高渗低氧预处理时，骨髓间充质干细胞的代谢发生适应性的改变，当这种刺激长期存在是，细胞会达到另一种稳态，并对高渗低氧刺激产生较强的适应抵抗能力。虽其机制目前尚且不明，可能与相关信号转导通路的负反馈调节有关。实验结果说明，骨髓间充质干细胞在经过高渗低氧预处理后，对高渗应激和低氧应激的抵抗能力显著增强，经更强刺激后存活率更高，活性更好，移植到椎间盘内的治疗效果更佳。高渗低氧预处理干细胞在进行细胞移植治疗椎间盘退行性病变中具有明确优势，这为临床上进行干细胞移植治疗椎间盘退变类疾病时如何提高移植细胞的存活率和活性提供参考。

高渗环境结合氯化钴低氧预处理骨髓间充质干细胞移植治疗椎间盘退变

Pretreatments with hypertonic solution and cobalt chloride in bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for treatment of degenerative disc disease

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