SD大鼠骨髓间充质干细胞在-80℃低温条件下的冻存

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.009

摘要/Abstract

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文题释义：

细胞冻存：利用低温降低细胞代谢，使细胞处于停止生长的“休眠”状态，以便于细胞的长期储存。冻存的效果主要与降温步骤、冻存保护液的选择、冻存温度、复温速率及用于冻存的细胞生长状态有关。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作为保护剂。

二甲基亚砜：是一种渗透性保护剂，能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。

背景：以-80 ℃作为冻存温度条件，探索一种低消耗，简单易行的骨髓间充质干细胞贮存方法。

目的：筛选适于骨髓间充质干细胞冻存的最适保护液，并验证骨髓间充质干细胞经较长期低温冻存后的生物学特性。

方法：贴壁培养骨髓间充质干细胞，免疫荧光法鉴定骨髓间充质干细胞的生物学特性及纯度；以-80 ℃为温度条件，不同配比的低糖DMEM培养基、胎牛血清和二甲基亚砜作为冻存保护液，短期冻存骨髓间充质干细胞，选择适于骨髓间充质干细胞冻存的最适保护液；以选择出的保护液冻存骨髓间充质干细胞，分别于1，3，6个月复苏，并继续培养，传代；对传代细胞行免疫荧光鉴定，确定在-80 ℃下保护液对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响。

结果与结论：采用80%DMEM+体积分数为10%胎牛血清+10%二甲基亚砜作为冻存保护液，适于在-80 ℃条件下冻存骨髓间充质干细胞，复苏后的细胞能够在体外增殖，并正常传代，冻存后的骨髓间充质干细胞仍可保持原有的生物学活性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0003-1741-1546(陈凯)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 细胞培养, 骨髓间充质干细胞, 二甲基亚砜, 冻存保护液

Abstract:

BACKGROUND: We attempt to explore a low-cost, simple and effective way to cryopreserve bone marrow mesenchymal stem cells at -80 ℃.
OBJECTIVE: To screen the optimal cryopreservation fluid for bone marrow mesenchymal stem cells and to verify the biological features of bone marrow mesenchymal stem cells after long-term cryopreservation.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were cultured using adherent method and the biological features and purity of cells were detected using immunofluorescence method. Bone marrow mesenchymal stem cells were cryopreserved in the cryoprotectant medium containing low-sugar DMEM, fetal bovine serum and dimethyl sulfoxide at different proportions at -80 ℃ for a short term. Then, the optimal cryoprotectant was selected to storage the bone marrow mesenchymal stem cells. After 1, 3, 6 months of cryopreservation, the cells were resuscitated, cultured and passaged. Passage cells were identified immunofluorescence method to determine the biological features of bone marrow mesenchymal stem cells cryopreserved at -80 ℃.
RESULTS AND CONCLUSION: Cryoprotectant medium of 80% DMEM+10% fetal bovine serum+10% dimethyl sulfoxide was suitable for cryopreserving MSCs at -80 ℃, and resuscitated cells were able to proliferate in vitro, and passage normally, indicating the cryopreserved bone marrow mesenchymal stem cells still maintain the original biological activity.

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图/表（结果） 4

2.1 骨髓间充质干细胞冻存7 d的复苏率比较将骨髓间充质干细胞冻存7 d后复苏，各实验组以F10组(80%DMEM+体积分数为10%胎牛血清+10%二甲基亚砜)复苏率最高(表2)，将其余各组复苏率分别与F10组比较，结果显示，F20组与F10组差异有显著性意义(P < 0.05)，其余各组与F10组比较，差异有非常显著性意义(P < 0.01)，D30和D40组复苏时，显微镜下未见有活细胞存在，所有细胞均被锥虫蓝着色，对实验数据进行分析时，将其略去。各实验组以F0复苏率最低(图1)，仅为(6.33±3.18)%，说明胎牛血清对于冻存细胞的存活有保护作用，而胎牛血清体积分数过高可能不适于骨髓间充质干细胞在-80 ℃温度条件下冻存。二甲基亚砜浓度的影响较胎牛血清更为显著，D20组的复苏率仅为(17.00±1.73)%。数据分析结果显示适于骨髓间充质干细胞低温冻存的冻存保护液为F10组。

2.2 复苏细胞的形态观察 F10组冻存细胞复苏12 h后于显微镜下观察(图2)，细胞主要为圆形和梭形，部分贴壁，形态为梭形，折光性较差，细胞核大，具有1个或多个核仁，与冻存前的细胞形态相同；悬浮细胞为圆形，折光性强，培养3 d未能贴壁的细胞即为冻存中死亡的细胞，更换培养液时将未贴壁细胞倾出后，贴壁细胞形态更加清晰，少量残留的死细胞在随后培养过程中去除。

复苏后的骨髓间充质干细胞增殖速度很快，以(1.8-2.0)×10⁸ L^-1活细胞密度接种，四五天即可铺满培养瓶底的80%-90%，传代后的生长情况与正常培养细胞完全相同，培养6 d左右即可再次进行传代。

2.3 冻存时间对复苏效果的影响以选择出的冻存保护液(F10)冻存1，3，6个月的复苏率见表3和图3，各时间点复苏率均高于60%，各时间点的复苏率差异不显著，并未随冻存时间的延长而下降。

2.4 复苏骨髓间充质干细胞的生物学特性鉴定结果以参考文献[19]中的方法行免疫荧光鉴定，骨髓间充质干细胞冻存6个月复苏后CD29与CD44阳性表达(图4A，B)，于荧光显微镜下显示明亮的红色荧光，CD34阴性(图4C)，不显示荧光，其与冻存前骨髓间充质干细胞的抗原表达结果一致。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞水平体外观察实验。

1.2 时间及地点实验于2014年9月至2015年4月在河北工程大学分子生物学实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 4周龄雄性SD大鼠1只，体质量96 g，由河北医科大学实验动物中心提供。

1.3.2 主要试剂低糖DMEM培养基(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，谷氨酰胺(Biosharp)，青霉素和链霉素(华北制药厂)，胰酶(Sigma)，兔抗大鼠CD29、CD44、CD34及RBITC标记山羊抗兔IgG(北京博奥森生物技术有限公司)，二甲基亚砜(Amresco公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定参照文献[19]的方法对骨髓间充质干细胞进行分离、体外培养及生物学特性鉴定。

1.4.2 骨髓间充质干细胞的冻存与复苏

冻存保护液的设计：冻存保护液的组成成分及各成分的配比见表1。将配制好的冻存保护液分装至1.5 mL冻存管中，每管1 mL，每组3管，4 ℃预冷备用。

骨髓间充质干细胞冻存保护液的选择：以正常传代的方法消化、收集、计数体外培养的第3代骨髓间充质干细胞^[2]，将细胞移入预冷的1 mL冻存保护液中，每支冻存管中的细胞数量为1×10⁶个，轻轻吹打数次，使细胞在冻存液中均匀分布，封口膜封紧冻存管口后做好标记，每组2个重复，4 ℃平衡30 min，-20 ℃平衡1 h，置-80 ℃冰箱冻存。

1周后，将冻存管从-80 ℃冰箱中取出，立即置于37 ℃水浴中，轻轻摇动冻存管使冻存液快速融解，待冻存物融解至约90%时，用体积分数为75%乙醇擦拭冻存管，将液体移入37 ℃预热的10 mL基本培养基中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，少量完全培养基重悬细胞，锥虫蓝染色计数活细胞数目，调整活细胞浓度为(1.8-2.0)×10⁸ L^-1接种于50 mL培养瓶中，继续培养，换液与传代时间方法均与骨髓间充质干细胞的培养方法相同。

比较表1中8种冻存保护液的复苏率，选择复苏率最高的一种长期冻存骨髓间充质干细胞。

骨髓间充质干细胞的长期冻存与复苏：采用筛选出的冻存保护液，依上述方法冻存第4代骨髓间充质干细胞，分别于冻存1，3，6个月后复苏，按照上述方法计算复苏率。

冻存复苏骨髓间充质干细胞生物学特性的鉴定：对冻存6个月后复苏的骨髓间充质干细胞行免疫荧光鉴定^[2]，以验证骨髓间充质干细胞经较长期低温冻存后的生物学特性。

1.5 主要观察指标骨髓间充质干细胞表面标志物CD44、CD29的表达，造血类细胞表面抗原CD34的表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0软件以t 检验进行数据间比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

与其他体外培养物的冷冻保存相同，骨髓间充质干细胞的低温冻存效果主要与降温步骤、冻存保护液的选择、冻存温度、复温速率及用于冻存的细胞生长状态有关^[20]。有学者指出，降温的步骤是骨髓间充质干细胞冻存是否成功的关键之一^[21]。降温速率过快易引起细胞内冰晶损伤，而缓慢降温的方法可以有效减少内冰晶的形成^[22]。目前对体外培养细胞冻存的降温方法主要有阶段式降温法与程控降温仪降温法。程控降温仪降温效果也较好，但需要专业的设备才可进行；阶段式降温法不需特殊的仪器设备，操作简单，也常被研究者采用^[23-25]。实验采用阶段式降温法冷冻骨髓间充质干细胞，冻存7 d，1，3，6个月后复苏率均为60%以上。复苏后增殖情况与冻存前相比无显著差异，生物学特性保持不变，说明该方法适用于骨髓间充质干细胞的低温冻存。

二甲基亚砜是应用最为广泛的渗透性冷冻保护剂，可保护细胞免受高浓度电解质的损伤，避免了细胞过分脱水皱缩，而并不能防止细胞内结冰^[26-28]。尤需注意的是，二甲基亚砜具有一定的细胞毒性，浓度过高会导致细胞死亡^[29-31]。实验在其他条件完全相同的情况下，随着二甲基亚砜浓度的升高，复苏率也随之降低，二甲基亚砜浓度达30%及以上时，复苏时未见有活细胞存在，复苏率与二甲基亚砜的使用浓度呈现明显的剂量效应。另外，二甲基亚砜的细胞毒性在常温时较强，4 ℃下毒性则大为减弱，所以在冻存操作前将配制完成的冻存保护液置于4 ℃预冷，对骨髓间充质干细胞的低温存活有益。

血清也是冻存保护液中的重要组分。实验结果显示，较高血清浓度并不适于骨髓间充质干细胞的低温冻存，其原因可能是由于实验采用的冻存温度(-80℃)与液氮的温度(-196 ℃)相差较大，对细胞内生命活动的影响程度亦不尽相同。在-196 ℃条件下，细胞内的生命活动几乎处于停止状态，而-80 ℃低温条件可能只是对细胞内的生理生化反应起到有效减缓作用，冻存保护液中的血清浓度接近骨髓间充质干细胞的培养条件可能更有利于细胞在-80 ℃温度条件下存活。此外，保证一定的基本培养基浓度可能也对维持这种缓慢的生命活动有支持作用。

复温的速率也是影响骨髓间充质干细胞冻存成功与否的因素之一。由于胞外的溶液先于细胞内液融化，若冻存物复温缓慢则使得细胞处于高浓度溶质溶液中的时间增加，易引起溶质损伤，而且还有重新形成较大冰晶的可能，对复苏效果产生不利影响，所以在1.0-2.0 min恢复至常温为宜。

此外，用于冻存的骨髓间充质干细胞的生长状态也对冻存结果有较大影响。第3代及第4代骨髓间充质干细胞不仅活力较好，易于在低温条件下存活，且具有较高的纯度，以这个时期的细胞进行冻存效果较好。以较高活细胞浓度(1.8-2.0)×10⁸ L^-1接种复苏的细胞则是考虑到可能某些细胞虽未被锥虫蓝着色，但已受到轻微损伤，不能正常贴壁增殖而死亡。

实验采用80%DMEM+体积分数为10%胎牛血清+ 10%二甲基亚砜为冻存保护液，于-80 ℃低温条件下冻存骨髓间充质干细胞，分别于7 d及1，3，6个月后复苏，其复苏率均可达60%以上，未因冻存时间的延长而表现出显著差异(P > 0.05)。复苏后的骨髓间充质干细胞生长状况良好，可正常增殖并传代，且与冻存前相比，生物学特性未有改变。虽然与一些文献所报道的以液氮冻存骨髓间充质干细胞的效率相比较低^[32-34]，但考虑到骨髓间充质干细胞增殖能力较强，继续培养4-6 d即能以1︰3比例传代，亦可快速获得大量纯化的具有较高活力的骨髓间充质干细胞^[19]，而且采用一般实验室具备的常规仪器(低温冰箱)即可达到冻存所需的温度条件，避免了因液氮挥发造成的浪费。因此，从经济性、合理性考虑，实验所建立的方法较为适于骨髓间充质干细胞的冻存，为解决骨髓间充质干细胞的储备、节省材料和时间提供了简单有效的方法，而更长冻存时间跨度对复苏率和细胞活力的影响则需进一步研究加以证实。