上皮间质转化在胃癌SGC7901细胞向胃癌干细胞转化过程中的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.008

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (10): 1426-1432.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.008

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上皮间质转化在胃癌SGC7901细胞向胃癌干细胞转化过程中的作用

邢会军¹，赵艳军²，侯雷¹，孙勇¹，刘朋¹，李春辉³

承德医学院附属医院，¹胃肠外科，²急诊科，³病理科，河北省承德市 067000

收稿日期:2016-01-12 出版日期:2016-03-04 发布日期:2016-03-04
通讯作者: 赵艳军，硕士，副主任医师，承德医学院附属医院急诊科，河北省承德市 067000
作者简介:邢会军，男，1966年生，河北省承德市人，汉族，硕士，副主任医师。主要从事胃肠肿瘤的研究。
基金资助:

河北省医学科学研究重点课题计划(ZL20140103)

Role of epithelial-mesenchymal transition in transformation of gastric cancer cells SGC7901 to gastric cancer stem cells

Xing Hui-jun¹, Zhao Yan-jun², Hou Lei¹, Sun Yong¹, Liu Peng¹, Li Chun-hui³

¹Department of Gastrointestinal Surgery, ²Department of Emergency, ³Department of Pathology, Affiliated Hospital of Chengde Medical University, Chengde 067000, Hebei Province, China

Received:2016-01-12 Online:2016-03-04 Published:2016-03-04
Contact: Zhao Yan-jun, Master, Associate chief physician, Department of Emergency, Affiliated Hospital of Chengde Medical University, Chengde 067000, Hebei Province, China
About author:Xing Hui-jun, Master, Associate chief physician, Department of Gastrointestinal Surgery, Affiliated Hospital of Chengde Medical University, Chengde 067000, Hebei Province, China
Supported by:
the Medical Science Research Project of Hebei Province, No. ZL20140103

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

上皮间质转化：是指上皮细胞失去其形态和功能后，逐渐转化为间质样细胞的过程，与肿瘤的侵袭、转移、复发以及耐药性密切相关。上皮间质转化的调控因素有很多，如E-钙黏蛋白、转化生长因子β、Wnt信号通路、微RNA及转录因子等。

上皮间质转化与肿瘤的关系：上皮间质转化过程抑制致癌基因引起的提前衰老。在上皮间质转化过程中的肿瘤可以拮抗化疗和免疫疗法，并且逃脱免疫系统的监视。最近的研究中发现上皮间质转化中的细胞可以获得类似于干细胞的特性，这些尚未分化的间质细胞从表达E-钙黏蛋白变为表达N-钙黏蛋白，并且表达Snail，蛋白酶，以及一些细胞全能性转录因子如Oct-4和Nanog。

背景：有研究发现上皮间质转化和肿瘤的侵袭、转移以及耐药性密切相关，但关于上皮间质转化在胃癌SGC7901细胞向胃癌干样细胞转化过程中的作用的研究较为少见。

目的：探讨上皮间质转化在胃癌SGC7901细胞向胃癌干样细胞转化过程中的作用。

方法：长春新碱诱导胃癌 SGC7901 细胞，并对长春新碱诱导的胃癌SGC7901细胞进行培养筛选制备胃癌干样细胞，鉴定细胞CD44表型、观察细胞形态变化、检测干细胞相关标志物、检测上皮间质转化相关分子。

结果与结论：①胃癌SGC7901 细胞传代后经过长春新碱诱导后细胞形态发生了改变，无血清悬浮培养后，见克隆样细胞球生成，同时CD44表型的细胞比例下降；②胃癌干样细胞中的SOX2和OCT4的表达水平以及间质标志物Snail1 mRNA、Twist mRNA和Vimentin mRNA表达水平均明显高于胃癌SGC7901细胞，但上皮细胞标志物E-钙黏蛋白mRNA表达水平明显低于胃癌SGC7901细胞；③结果表明胃癌SGC7901细胞能够成功转化为胃癌干样细胞，上皮间质转化参与了胃癌SGC7901细胞向胃癌干样细胞的转化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0001-5257-766X(邢会军)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 上皮间质转化, 胃癌, 胃癌干样细胞, 耐药, 复发, 转移, 长春新碱, 诱导

Abstract:

BACKGROUND: Studies have found that epithelial-mesenchymal transition is closely related with tumor invasion, metastasis, and drug resistance, but studies on the role of epithelial-mesenchymal transition in the transformation process of gastric cancer cells SGC7901 to gastric cancer stem-like cells are rarely reported.
OBJECTIVE: To explore the effect of epithelial-mesenchymal transition in the transformation process of gastric cancer cells SGC7901 to gastric cancer stem-like cells.
METHODS: Vincristine-induced SGC7901 cells were cultured and screened to prepare gastric cancer stem-like cells. CD44 phenotype, morphological changes, stem cell-related markers, and epithelial-mesenchymal transition related molecules were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: After passage, vincristine-induced SGC7901 cells presented with morphological changes, and clonal cell spheres generated after serum-free suspension culture. Meanwhile, the proportion of SGC7901 cells positive for CD44 was decreased. Expression levels of SOX2, OCT4, Snail1 mRNA, Twist mRNA and Vimentin mRNA were significantly higher in the gastric cancer stem-like cells than SGC7901 cells, but the expression level of E-caderin was lower in the gastric cancer stem-like cells than SGC7901 cells. These findings indicate that gastric cancer cells SGC7901 can be successfully transformed into gastric cancer stem-like cells, and the epithelial-mesenchymal transition is involved in this transforming progress.

邢会军，赵艳军，侯雷，孙勇，刘朋，李春辉. 上皮间质转化在胃癌SGC7901细胞向胃癌干细胞转化过程中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(10): 1426-1432.

Xing Hui-jun, Zhao Yan-jun, Hou Lei, Sun Yong, Liu Peng, Li Chun-hui. Role of epithelial-mesenchymal transition in transformation of gastric cancer cells SGC7901 to gastric cancer stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(10): 1426-1432.

图/表（结果） 5

2.1 胃癌SGC7901细胞和胃癌干样细胞的形态胃癌SGC7901细胞传代后呈四方形或者呈多角形，贴壁生长迅速，细胞之间粘连紧密；胃癌SGC7901细胞经过长春新碱诱导后细胞形态发生了改变，呈纺锤形或者圆形，细胞间的紧密连接丢失，将长春新碱诱导后的细胞进行无血清悬浮培养，可见克隆样细胞球生成(图1)。

胃癌SGC7901细胞的细胞核比较小，细胞质比较多，常染色体比较多；胃癌干细胞的细胞核比较多，细胞质比较少，未见明显核仁。

2.2 胃癌SGC7901细胞和胃癌干细胞的表面标志物的表达流式细胞仪检测结果显示，胃癌SGC7901细胞中具有CD44表型的细胞比例为99%，而经过无血清培养富集的克隆样生长的胃癌干细胞中具有CD44表型的细胞比例只有83.5%(图2)。

2.3 胃癌SGC7901细胞和胃癌干细胞的结构差异胃癌SGC7901细胞的细胞核比较小，细胞质比较多，常染色体比较多。

胃癌干样细胞的细胞核比较多，细胞质比较少，未见明显核仁(图3)。

2.4 胃癌SGC7901细胞和胃癌干样细胞的干细胞标志物的表达 Western blot结果显示，胃癌干样细胞中的SOX2和OCT4的表达情况明显高于胃癌SGC7901细胞(图4)。

2.5 胃癌SGC7901细胞和胃癌干样细胞上皮间质转化相关分子mRNA的表达由表1看出：胃癌干样细胞的间质标志物Snail1 mRNA、Twist mRNA和Vimentin mRNA的表达均明显高于胃癌SGC7901细胞的间质标志物Snail1 m RNA、Twist mRNA和Vimentin mRNA的表达(P < 0.05)；胃癌干样细胞的上皮细胞标志物E-钙黏蛋白的mRNA表达明显低于胃癌SGC7901细胞的上皮细胞标志物E-钙黏蛋白的mRNA表达(P < 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照细胞学实验。

1.2 时间及地点实验在2014年9月至2015年6月在承德医学院附属医院实验室完成。

1.3 材料胃癌SGC7901细胞购自承德医学院。

1.4 方法

1.4.1 长春新碱诱导胃癌SGC7901细胞将胃癌SGC7901细胞接种到RPMI1640培养基中进行培养，隔天进行一次换液，4 d开始传代培养，对生长良好的胃癌SGC7901细胞进行胰蛋白酶进行消化，制备胃癌SGC7901细胞悬液，接种到6孔板中进行培养，细胞生长至80%以上时更换含长春新碱的培养液，继续培养72 h，得到长春新碱诱导的SGC7901肿瘤细胞。

1.4.2 长春新碱诱导胃癌SGC7901细胞的培养筛选将长春新碱诱导后的SGC7901肿瘤细胞在DMEM/F12培养基中进行(无血清悬浮)培养，制备细胞悬液，接种到96孔板中培养，10 d左右形成细胞球，形成细胞球后每隔3 d进行一次半量换液。

35 d后收集细胞悬液进行离心，弃去上清液，PBS重悬细胞，离心，弃去上清液，加入Stem Pro^® Accutase^®(StemPro Accutase细胞分离试剂)重悬细胞，孵育后加入DMEM/F12培养基重悬细胞，离心，再加入DMEM/F12培养基重悬细胞，接种到培养瓶中培养，得到胃癌干样细胞。

1.4.3 胃癌SGC7901细胞以及胃癌干样细胞CD44表型的鉴定采用流式细胞仪法进行鉴定，分别去生长良好的胃癌SGC7901细胞和胃癌干样细胞进行消化，离心，细胞筛过滤后，制成细胞悬液，置入上样管和同型对照管，上样管中加入PE-抗人CD44抗体和FcR阻断剂，同型对照管中加入同型对照抗体和FcR阻断剂，进行孵育，PBS洗涤后进行流式细胞仪检测。

1.4.4 电镜观察胃癌SGC7901细胞以及胃癌干样细胞的形态将生长良好的胃癌SGC7901细胞以及胃癌干样细胞经过胰蛋白酶消化，离心，弃去上清液，PBS重悬，离心，弃去上清液，加入戊二醛固定，在用饿酸固定，电镜下观察。

1.4.5 Western blot检测胃癌SGC7901细胞和胃癌干样细胞的干细胞相关标志物将胃癌SGC7901细胞和胃癌干样细胞经裂解液裂解，测定蛋白浓度，配制积成胶和分离胶，在转移缓冲液中进行平衡，转膜，丽春红染色，PBS洗涤，脱脂奶粉封闭，一抗过夜孵育，PBST洗涤，HRP标记的抗兔IgG孵育，PBST洗涤，ECL显色，Bio-Rad成像系统采集图像。

1.4.6 qRT-PCR检测胃癌SGC7901细胞和胃癌干样细胞上皮间质转化相关分子mRNA的表达收集胃癌SGC7901细胞和胃癌干样细胞，提取cDNA，采用qRT-PCR的方法进行检测胃癌 SGC7901 细胞和胃癌干样细胞的间质标志物Snail1 mRNA、Twist mRNA和Vimentin mRNA以及上皮细胞标志物E-钙黏蛋白的mRNA表达水平。

1.5 主要观察指标胃癌 SGC7901 细胞和胃癌干样细胞的间质标志物Snail1 mRNA、Twist mRNA和Vimentin mRNA以及上皮细胞标志物E-钙黏蛋白的mRNA表达情况。

1.6 统计学分析采用SPSS软件进行处理，均数采用t 检验进行比较，取P=0.05为显著标准。

讨论

胃癌是中国比较高发的消化系统恶性肿瘤，目前主要的治疗方法是手术治疗，虽然胃癌根治性切除手术率比较高，但5年内的生存率依然在60%以下，围手术期进行辅助化疗能够提高患者的生存率，但围手术期辅助化疗仍然没有办法彻底清除肿瘤细胞，这是目前胃癌治疗过程中存在的主要问题^[21-22]，考虑可能原因为胃癌手术联合化疗后仍有少量微小病灶存在，而这些微小病灶采用传统的方法不能检测到，这些微小病灶可能为对化疗药物耐药，或者静息状态下的肿瘤细胞复发^[23-24]，因此复发的胃癌细胞具有长期寂静以及抵抗化疗药物的特性，和肿瘤干细胞具有一定的相似性，有研究发现治疗后残留的微小病灶含有一定数量的肿瘤干细胞，考虑癌症复发的根源在于肿瘤干细胞，肿瘤干细胞和组织干细胞相似，具有自我分化和不断更新能力，和肿瘤的转移、复发等关系密切^[25-28]。胃癌干细胞的来源有终末分化细胞重新获得干性以及分化潜能干细胞恶变两种，胃黏膜干细胞是胃癌干细胞的一种^[13^，^29-30]，能够代替不断衰老的胃黏膜细胞，维持干细胞的细胞池，具有不断自我更新能力^[16^，^31]，由于胃黏膜干细胞的寿命比较长，接触致癌因子的可能比较大，发生癌变的概率比较大。终末分化细胞重新获得干性是指终末分化细胞在各种因素的作用下，其基因表达发生变化，激活干性基因而使终末分化细胞重新获得干性，目前关于终末分化细胞重新获得干性研究比较多的为上皮间质转化^[32]。

上皮间质转化是指上皮细胞癌一定条件的作用下，由上皮表型转化剋间质表型的一种过程，上皮间质转化是上皮细胞为了适应周围环境的变化而发生的一种暂时性的转化过程，这种过程是可以逆转的，这种转化和创伤的修复，胚胎的生长发育，肿瘤的发生发展有密切关系^[33-34]。正常上皮细胞的稳定性是由细胞之间通过桥粒连接和黏附连接等细胞连接来维持的，并固定在基底膜上，上皮细胞在一定条件的作用下，会发生上皮间质转化，上皮间质转化过程中上皮细胞之间的连接发生断裂，连接蛋白发生降解，或者连接蛋白重新进行分布，使上皮细胞的稳定性被破坏，极性丧失，细胞的形态由扁平变为长梭形，周边形成伪足，角蛋白骨架转化为波形蛋白骨架，细胞收缩性增加，同时细胞的生物学行为也发生改变，上皮间质转化后侵袭和迁移能力增强，抗凋亡及抗衰老能力增加，上皮间质转化最主要的特征是侵袭和迁移能力的变化。上皮间质转化的分子机制为^[35-37]：①细胞间连接和转录因子：上皮细胞的稳定性和极性主要靠细胞间连接进行维持的，黏附连接的主要分子式E-钙黏蛋白，E-钙黏蛋白主要稳定上皮细胞的骨架稳定，转录因子能够和E-钙黏蛋白结合，抑制E-钙黏蛋白进行转录。②Wnt-β-连环蛋白通路和E-钙黏蛋白：Wnt-β-连环蛋白通路是上皮间质转化的主要调节途径，在无Wnt信号时，β-连环蛋白和α-连环蛋白以及E-钙黏蛋白结合并黏附在肌动蛋白细胞上参与细胞的稳定性和黏附性，当Wnt信号通路被激活时会破坏β-连环蛋白和α-连环蛋白以及E-钙黏蛋白的结合，破坏细胞稳定性和黏附性，促进上皮间质转化的发生。③β-连环蛋白和PI13K/AKT途径：上皮细胞间的黏附连接由E-钙黏蛋白和β-连环蛋白结合维持，PI13K/AKT途径是调节癌症细胞侵袭、转移、增殖以及凋亡的主要途径，PI13K/AKT途径激活后促进β-连环蛋白的核转位和积聚，促进上皮间质转化。④转化生长因子β和Smad蛋白：转化生长因子β是一种细胞因子，可以引起Smad蛋白的磷酸化，调控上皮间质转化的病理生理过程。

上皮间质转化参与肿瘤的发生发展，在组织纤维化以及胚胎的发生中发挥重要作用，和胃癌的发生发展关系比较密切，胃癌的发生过程经过胃部正常胃黏膜发展为慢性胃炎，发展为萎缩性胃炎，再发展为胃黏膜的上皮化生，再发展为胃黏膜的不典型增生以及胃癌，在胃癌的发生发展过程中，E-钙黏蛋白不断下降，E-钙黏蛋白的基因突变是胃癌发生的机制之一，表明上皮间质转化参与了胃癌的发生^[38-42]，随着上皮间质转化的不断发展，胃癌细胞的转移和侵袭能力增强，恶性程度不断升高，并获得耐药性和肿瘤干细胞样表型。进展期胃癌的主要特征是胃癌的转移和侵袭，胃癌细胞发生上皮间质转化是，细胞连接发生断裂，细胞骨架进行重排，使胃癌细胞的抗凋亡能力以及侵袭和转移能力增强，发生上皮间质转化的胃癌颗粒细胞比较容易离开胃癌原发部位，经各种途径向远处转移。上皮间质转化和胃癌的多药耐药性也密切相关，在胃癌化疗过程中，胃癌细胞产生耐药的过程有发生上皮间质转化的倾向，在上皮间质转化的过程中，胃癌细胞可以获得侵袭和迁移的能力，胃癌细胞的上皮间质转化具有干细胞样表型的特点使其能够抵抗药物的毒性，增加细胞的耐药性^[43-46]。本实验通过长春新碱诱导胃癌SGC7901细胞，并对长春新碱诱导的胃癌SGC7901细胞进行培养筛选制备胃癌干样细胞，鉴定2种细胞CD44表型、观察细胞形态变化、检测干细胞相关标志物、检测上皮间质转化相关分子。结果发现，胃癌SGC7901细胞传代后呈四方形或者呈多角形，贴壁生长迅速，细胞之间粘连紧密；胃癌SGC7901细胞经过长春新碱诱导后细胞形态发生了改变，呈纺锤形或者圆形，细胞间的紧密连接丢失，将长春新碱诱导后的细胞进行无血清悬浮培养，可见克隆样细胞球生成。胃癌SGC7901细胞中具有CD44表型的细胞比例在99.12%，而经过无血清培养富集的克隆样生长的胃癌干样细胞中具有CD44表型的细胞比例只有81.43%。胃癌SGC7901细胞的细胞核比较小，细胞质比较多，常染色体比较多；胃癌干样细胞的细胞核比较多，细胞质比较少，未见明显核仁。胃癌干样细胞中的SOX2和OCT4的表达情况明显高于胃癌SGC7901细胞中的SOX2和OCT4的表达情况。胃癌干样细胞的间质标志物Snail1 mRNA、Twist mRNA和Vimentin mRNA的表达均明显高于胃癌SGC7901细胞的间质标志物Snail1 mRNA、Twist mRNA和Vimentin mRNA的表达；胃癌干样细胞的上皮细胞标志物E-钙黏蛋白的mRNA表达明显低于胃癌SGC7901细胞的上皮细胞标志物E-钙黏蛋白的mRNA表达。

由此可见，胃癌SGC7901细胞能够被长春新碱成功诱导，被长春新碱诱导的胃癌SGC7901细胞具有干细胞样特性，长春新碱诱导的胃癌干细胞样细胞表面的间质标志物高于胃癌SGC7901细胞，长春新碱诱导的胃癌干细胞样细胞表面的上皮细胞标志物低于胃癌SGC7901细胞，表明上皮间质转化参与胃癌SGC7901细胞向胃癌干细胞样转化。

上皮间质转化在胃癌SGC7901细胞向胃癌干细胞转化过程中的作用

Role of epithelial-mesenchymal transition in transformation of gastric cancer cells SGC7901 to gastric cancer stem cells

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