早期运动训练联合神经干细胞移植对脊髓损伤模型大鼠后肢运动功能的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.06.017

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (6): 876-882.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.06.017

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早期运动训练联合神经干细胞移植对脊髓损伤模型大鼠后肢运动功能的影响

武玉江¹，侯英诺¹，张子檀²，刘中坡¹，聂志红¹，樊格林¹

邢台市人民医院，¹脊柱骨科，²麻醉科，河北省邢台市 054001

收稿日期:2015-12-19 出版日期:2016-02-05 发布日期:2016-02-05
通讯作者: 侯英诺，硕士，主治医师，邢台市人民医院脊柱骨科，河北省邢台市 054001
作者简介:武玉江，男，1963年生，河北省沙河市人，汉族，2007年河北医科大学毕业，副主任医师，主要从事脊柱外科手术治疗研究。
基金资助:
河北省科技计划项目(12277772)

Early exercise training combined with neural stem cell transplantation improves hindlimb motor function after spinal cord injury in rats

Wu Yu-jiang¹, Hou Ying-nuo¹, Zhang Zi-tan², Liu Zhong-po¹, Nie Zhi-hong¹, Fan Ge-lin¹

¹Department of Orthopedic Spine, ²Department of Anesthesiology, Xingtai People’s Hospital, Xingtai 054001, Hebei Province, China

Received:2015-12-19 Online:2016-02-05 Published:2016-02-05
Contact: Hou Ying-nuo, Master, Attending physician, Department of Orthopedic Spine, Xingtai People’s Hospital, Xingtai 054001, Hebei Province, China
About author:Wu Yu-jiang, Associate chief physician, Department of Orthopedic Spine, Xingtai People’s Hospital, Xingtai 054001, Hebei Province, China
Supported by:
the Scientific Research Plan of Hebei Province, No. 12277772

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

脊髓损伤后的神经干细胞移植：①神经干细胞分化后产生的神经元和胶质细胞可以分泌多种神经营养因子，改善脊髓局部的微环境并启动再生相关基因的顺序表达使轴突开始再生，它们同时产生多种细胞外基质，填充脊髓损伤后遗留的空腔，为再生轴突提供支持物。②补充损伤后缺失的神经元和胶质细胞。③使残存脱髓鞘的神经纤维和新生的神经纤维形成髓鞘，保持神经纤维的完整性。

运动对脊髓损伤功能改善的作用机制：运动训练不仅能明显促进脊髓损伤后运动功能恢复，而且神经功能也明显恢复，机制为：①运动可诱导再生环境中多种神经再生相关的神经生长营养因子表达。②运动对脊髓模式发生器的激活作用。③运动促进皮质功能重塑加强对脊髓活动的控制。

背景：研究表明，神经干细胞移植联合运动训练可以促进脊髓损伤大鼠后肢运动功能的恢复，但其作用机制尚未完全阐明。

目的：观察早期运动训练联合神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠后肢运动功能恢复的影响。

方法：60只SD大鼠建立脊髓损伤模型后随机分为3组：对照组20只，损伤后即刻给予常规处理；细胞移植组20只，损伤后给予神经干细胞移植；实验组20只，损伤后给予神经干细胞移植的同时联合早期运动训练。分别于损伤前及损伤后的1，7，14，21 d，通过BBB评分及斜板实验评估大鼠后肢运动功能的恢复情况；损伤后第14天利用Western blot法检测损伤脊髓组织caspase-3和髓过氧化物酶的表达；损伤后第 21天做常规苏木精-伊红染色切片，观察大鼠脊髓损伤组织结构改变。

结果与结论：①各组大鼠在损伤后第7，14，21天的BBB评分及斜板实验评分，细胞移植组优于对照组，实验组优于细胞移植组，各组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。②损伤后14 d对照组大鼠caspase-3表达明显升高，髓过氧化物酶表达也明显升高，细胞移植组大鼠caspase-3 和髓过氧化物酶的表达均高于实验组(P < 0.05)。③细胞移植组脊髓病理炎性反应减轻，实验组炎性反应进一步减轻，损伤区域结构改善，脊髓组织结构相对清晰、趋于完整。④神经干细胞移植联合早期运动训练能有效改善脊髓运动功能，其可能通过降低caspase-3 和髓过氧化物酶的表达，减轻对脊髓组织的继发性损害，以利于维持脊髓运动神经元功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0002-9078-4309 (武玉江)

关键词: 干细胞, 移植, 神经干细胞, 脊髓损伤, 大鼠, 运动功能

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that neural stem cell transplantation combined with exercise training can promote the recovery of hindlimb motor function from spinal cord injury in rats, but its mechanism of action has not been fully elucidated.
OBJECTIVE: To investigate the effects of early exercise training combined with neural stem cell transplantation on the recovery of hindlimb motor function in rats with spinal cord injury.
METHODS: Sixty Sprague-Dawley rats with spinal cord injury were randomly divided into three groups: control group (n=20, given conventional treatment after injury), cell transplantation group (n=20, given neural stem cell transplantation after injury), experimental group, (n=20, given neural stem cell transplantation combined with early exercise training after injury). Recovery of the hindlimb motor function was assessed by Basso, Beattie and Bresnahan scale and inclined plane test before and at 1, 7, 14, 21 days after injury. Western blot assay was used to detect caspase-3 and myeloperoxidase expression. Hematoxylin-eosin staining was done at 21 days after injury to observe the structure changes of the injured spinal cord.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scores of Basso, Beattie and Bresnahan scale and inclined plane test were significantly better in the experimental group than the cell transplantation group followed by the control group (P < 0.05). (2) In the control group, the expression of caspase-3 and myeloperoxidase was significantly increased at 14 days after injury. In the cell transplantation, the expression of caspase-3 and myeloperoxidase was significantly higher than the experimental group (P < 0.05). (3) Pathological inflammation was reduced most in the experimental group followed by the cell transplantation group. In the experimental group, the structure of injured spinal cord was improved and became relatively clear and intact. These findings indicate that neural stem cell transplantation combined with early exercise training can effectively promote the recovery of hindlimb motor function from spinal cord injury in rats, by reducing the expression of caspase-3 and myeloperoxidase and alleviating secondary lesion of the spinal cord.

武玉江，侯英诺，张子檀，刘中坡，聂志红，樊格林. 早期运动训练联合神经干细胞移植对脊髓损伤模型大鼠后肢运动功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(6): 876-882.

Wu Yu-jiang, Hou Ying-nuo, Zhang Zi-tan, Liu Zhong-po, Nie Zhi-hong, Fan Ge-lin . Early exercise training combined with neural stem cell transplantation improves hindlimb motor function after spinal cord injury in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(6): 876-882.

图/表（结果） 4

2.1 神经干细胞形态神经干细胞培养五六天时，细胞球体积增大，单个细胞数量急剧减少；培养八九天时，细胞球数量增多，有较多呈悬浮生长的克隆细胞球，立体感强，排列紧密，周围有明显的光晕，细胞悬液中极少有细胞间质、细胞碎片及空泡。传代后细胞数目迅速增加，神经干细胞呈球形，表面有明显的绒毛状突起，折光性好。第3代神经干细胞球生长旺盛，胞体饱满，细胞生长状态良好，见图1。

2.2 实验动物数量分析参加实验数量60只，进入结果分析数量60只，中途手术较成功无脱落死亡。

2.3 BBB评分及斜板实验评估结果各组大鼠在损伤前及损伤后第1天的BBB评分及斜板实验评分非常接近，差异无显著性意义(P > 0.05)，在损伤后第7，14，21天各个时相点的BBB评分及斜板实验评分，细胞移植组优于对照组，实验组优于细胞移植组，各组差异有显著性意义(P < 0.05)；各组大鼠BBB评分见表1，图2；各组大鼠斜板实验评分结果见表2，图3。

2.4 Western blot法检测caspase-3和髓过氧化物酶表达水平损伤后14 d对照组大鼠caspase-3表达明显升高，髓过氧化物酶表达也明显升高，与细胞移植组比较，实验组caspase-3和髓过氧化物酶表达水平明显下降，差异有显著性意义(P < 0.05)。早期运动训练可以降低caspase-3和髓过氧化物酶的表达水平。各组大鼠的caspase-3和髓过氧化物酶蛋白表达水平见图4。

2.5 脊髓组织病理学改变损伤后 21 d光镜下观察脊髓组织苏木精-伊红染色切片：对照组有炎性反应和出血，脊髓组织结构紊乱，大量炎性细胞浸润，见图5A；细胞移植组出血得到吸收，有很多毛细血管增生，炎性反应减轻，见图5B；实验组炎性反应进一步减轻，损伤区域结构改善，脊髓组织结构相对清晰、趋于完整，见图5C。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2013年9月至2015年7月在河北医科大学动物实验室完成。

1.3 材料健康SD大鼠60只，1月龄，体质量220- 235 g，雌雄不限，购于河北医科大学动物实验室，动物质量合格证号：SCXK(冀)20090028，饲养环境：室内温度20-22 ℃，常规饮食，自由进食及饮水。实验按照动物伦理学标准对SD大鼠进行处理，处置方法符合伦理学要求。

1.4 实验方法

1.4.1 神经干细胞体外培养将冻存液保存的神经干细胞(河北医科大学动物实验室)复苏后进行培养传代，将含有神经干细胞的细胞球悬液转移至神经干细胞完全培养液的离心管中，以1 500 r/min速度离心5 min。用20 μL微量移液器轻柔吹打，将神经干细胞球分散为单细胞悬液，补充新鲜完全培养液，以1×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于25 cm²细胞培养瓶中，在37 ℃，饱和湿度，体积分数为5%CO₂条件下开放悬浮培养，24 h后全量更换培养基，弃去部分杂质及未贴壁的细胞，此后每3 d换液，观察到神经干细胞铺满培养瓶底80%时进行传代，5-7 d传代1次。传代后，用0.25%胰酶进行消化，终止消化后，收集细胞，以1 000 r/min速度离心5 min，弃掉上清后，重悬细胞。传代时按1︰3比例进行。

1.4.2 建立脊髓损伤模型及实验分组参考改良的重物打击法建立脊髓损伤大鼠模型^[13]，首先将SD大鼠以3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉，取俯卧位固定于实验台上，腰背部剪毛，于大鼠背部正中做一切口，暴露脊髓组织，将重物从2.5 cm高度垂直落下并直接撞击大鼠脊髓组织，打击量为25 g•cm。术后用青霉素盐水冲洗伤口，逐层缝合组织。饲养于笼内让其自由进食及饮水。脊髓损伤建模成功的标准：大鼠尾巴出现痉挛性摆动，双下肢回缩样扑动及迟缓性瘫痪。

造模成功60只大鼠随机分为3组：①对照组(n=20)，损伤后即刻给予常规处理。②细胞移植组(n=20)，损伤后给予神经干细胞移植。③实验组(n=20)，损伤后给予神经干细胞移植的同时联合早期运动训练。

1.4.3 神经干细胞移植脊髓损伤后6 h显露出脊髓损伤区域，微量注射器自损伤处头尾两端向损伤处刺入，缓慢注入10 μL(1×10¹⁰ L^-1)神经干细胞悬液，3 min内注射完后留针5 min并用医用生物胶封闭针孔以防止细胞悬液顺针道外溢，逐层缝合伤口，移植1次。

1.4.4 运动训练采用滚筒训练和跑台训练两种运动功能训练方法。在脊髓损伤前3 d，将所有大鼠放入康复训练器材内，进行适应性训练，损伤后第2天开始进行训练。①滚筒训练：将大鼠置于转速为5 r/min 的网状滚筒训练器中，大鼠在滚筒训练器内进行抓握、攀爬等运动训练，3次/d，每次10 min，训练1周。②跑台训练：跑台速度第1周设定为350 cm/min，每次10 min，分3次进行，每天训练30 min，中间隔10 min，每周5次，训练1周；细胞移植组和对照组饲养于笼内，不做任何运动训练。

1.4.5 BBB评分及斜板实验评估各组大鼠后肢运动功能恢复情况

BBB评分：损伤前及损伤后1，7，14，21 d各个时相点对各组大鼠进行BBB评分检测。BBB评分标准为22个等级，根据大鼠后肢神经运动功能进行判断，0分为完全瘫痪，21分为完全正常，评分越高说明大鼠脊髓损伤后神经功能恢复越好。

斜板实验：损伤前及损伤后1，7，14，21 d各个时相点对各组大鼠进行斜板实验评估，将SD大鼠置于光滑木板上，让其身体轴线与平板纵轴保持平行，平板每次升高5°，以大鼠能停留5 s(期间保持不下滑)的最大角度为其功能值。

两种评分均采取双盲法2人合评，评定时间均统一为上午8：00进行，每组随机检测10只，共评5次，取其平均值作为实验评分结果。

1.4.6 Western blot法检测损伤脊髓组织caspase-3和髓过氧化物酶的表达损伤后第14天，每组随机取5只大鼠损伤部位脊髓组织，用组织剪剪碎，放入冻存管内置冰上，加入1 μL PMSF裂解液，摇匀置于冰上裂解 30 min，提取蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，5%浓缩胶40 V衡压1 h，10%分离胶恒压60 V 3.5 h，湿转14 V恒压14 h，37 ℃摇床封闭 2 h，分别加入兔抗caspase-3 一抗(TBST 稀释，1︰1 000) 及兔抗髓过氧化物酶一抗(TBST 稀释，1︰1 000) ，4 ℃ 湿盒过夜，PBS冲洗3次，每次5 min，滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(TBST 稀释，1︰1 000)，于室温下孵育60 min；TBST洗膜3次，DAB显色，应用Bio-Rad 凝胶成像系统扫描吸光度值，以Quantity one软件进行分析，通过目的蛋白条带与β-actin条带的吸光面积积分比值来评定蛋白表达水平。

1.4.7 苏木精-伊红染色观察组织病理变化于损伤后 21 d，各组随机取SD大鼠5只，腹腔注射10%水合氯麻醉后处死，取损伤部位脊髓组织经40 g/L多聚甲醛固定，做常规冰冻切片，厚度约20 μm，二甲苯脱蜡后，依次浸入梯度乙醇中脱水，蒸馏水清洗2 min，伊红染色7 min，再用蒸馏水清洗，浸入梯度乙醇脱水，伊红乙醇溶液染色，二甲苯透明，树胶封固，恒温箱中干燥后于显微镜下观察。

1.5 主要观察指标 ①BBB评分及斜板实验评估各组大鼠后肢运动功能恢复情况。②Western blot法检测损伤脊髓组织caspase-3和髓过氧化物酶的表达。③苏木精-伊红染色观察组织病理变化。

1.6 统计学分析采取SAS 8.0软件，由第二作者进行统计分析。所得数据以x(_)±s表示，采用Student's t test，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

多项研究表明，早期运动训练能促进脊髓损伤患者运动功能恢复，降低脊髓损伤后并发症的发生^[14-16]。该研究制作60只脊髓损伤模型，通过BBB评分及斜板实验评估运动训练对脊髓损伤大鼠的康复效果，通过Western blot法检测损伤脊髓组织中caspase-3和髓过氧化物酶的表达，并通过苏木精-伊红染色观察脊髓损伤组织结构变化^[17-20]。研究结果表明早期运动训练联合神经干细胞移植可以起到促进脊髓损伤大鼠后肢运动功能恢复的作用^[21-23]。

BBB评估检测方法及斜板实验法是目前公认的较为可靠、准确的评估运动功能方法^[24-26]。实验采取双盲法评估损伤后第7，14，21天各个时相点的BBB评分及斜板实验评分，细胞移植组优于对照组，实验组优于细胞移植组，差异有显著性意义(P < 0.05)，研究结果证明大鼠的运动功能可以恢复。

髓过氧化物酶是中性粒细胞激活的标志物，髓过氧化物酶在脊髓组织中的表达升高表明受损的脊髓组织受到炎性细胞的侵袭，而炎性反应会加重大鼠脊髓继发性损伤^[27-29]。caspase-3作为一种半胱氨酸蛋白酶，在正常组织中表达较弱，当损伤发生后caspase-3被激活，产生级联反应，进而诱导细胞凋亡，影响脊髓损伤后神经功能的恢复^[30-34]。通过Western blot法检测显示，损伤后14 d对照组大鼠caspase-3表达明显升高，髓过氧化物酶表达也明显升高，细胞移植组大鼠caspase-3和髓过氧化物酶的表达均高于实验组，表明早期运动训练联合神经干细胞移植能够减轻脊髓损伤后的炎性反应，减轻继发性损害程度，还可抑制细胞凋亡，发挥神经功能保护作用。

通过组织形态学结构观察受损组织的功能恢复情况，是较为直观的一种评估手段^[35-40]，实验对受损脊髓组织的病理切片行苏木精-伊红染色，结果观察到细胞移植组出血得到吸收，有很多毛细血管增生，炎性反应减轻，实验组炎性反应进一步减轻，损伤区域结构改善，脊髓组织结构相对清晰、趋于完整。

综上所述，神经干细胞移植联合早期运动训练能有效改善脊髓运动功能，其可能通过降低caspase-3和髓过氧化物酶的表达，减轻对脊髓组织的继发性损害，以利于维持脊髓运动神经元功能。该研究为脊髓损伤的治疗提供了实验依据，但关于运动训练促进功能恢复的具体机制尚未清楚，有待于进行深入探讨研究。

早期运动训练联合神经干细胞移植对脊髓损伤模型大鼠后肢运动功能的影响

Early exercise training combined with neural stem cell transplantation improves hindlimb motor function after spinal cord injury in rats

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