内皮祖细胞移植联合早期运动改善脊髓损伤区血管再生及后肢功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.06.018

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

内皮祖细胞的鉴定方法：现在通常采用CD34、CD133及KDR/Fik-1等几种抗原联合进行鉴定。CD34是相对分子质量110 000的唾液酸黏蛋白，选择性表达于造血干细胞及某些激活的血管内皮细胞，其功能是作为内皮细胞及造血前体细胞相互作用的黏附分子。CD133是造血干细胞及祖细胞选择性表达的胆固醇结合糖蛋白，相对分子质量为120 000，它的确切功能目前尚且未知，但CD133的细胞能够分化成多种细胞表型，包括内皮细胞。

Allens法打击脊髓损伤：Allens法打击法以一定力量撞击脊髓组织及大鼠硬膜并继发一系列损伤反应致脊髓损伤的典型表现，这种模型对研究脊髓损伤后神经元、神经胶质细胞的病理变化、再生规律和相互作用、探索神经保护策略等有较大帮助。

背景：内皮祖细胞广泛应用于各种血管疾病治疗中，早期运动训练有助于脊髓损伤后运动功能的恢复，但单独的内皮祖细胞移植或早期运动训练然治疗效果目前还不甚理想。

目的：观察内皮祖细胞移植联合早期运动训练对大鼠脊髓损伤区血管再生及后肢功能的影响。

方法：将80只成年SD大鼠按改良Allen打击法建立脊髓损伤模型后，随机分为4组。①模型组大鼠尾静脉注入培养液。②内皮祖细胞组大鼠经尾静脉泵注内皮祖细胞(3×10⁶个)。③运动组大鼠采用滚筒训练和跑台训练两种运动功能训练方法训练2周。④联合组大鼠尾静脉注射内皮祖细胞后，采用滚筒训练和跑台训练2周。

结果与结论：①移植后2 周：联合组大鼠下肢运动功能和脊髓病理损伤恢复程度优于内皮祖细胞组及运动组，联合组大鼠CM-Dil阳性细胞比例、辣根过氧化物酶阳性神经纤维数量和毛细血管密度以及血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子表达水平高于内皮祖细胞组及运动组。②提示早期运动训练对脊髓损伤起到神经保护的作用，内皮祖细胞移植的同时联合早期运动训练能够促进脊髓损伤大鼠神经突触和血管的再生，改善其大鼠肢体运动功能，其机制可能与升高损伤区血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子表达有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0002-5632-822X (赵素香)

关键词: 干细胞, 移植, 内皮祖细胞, 早期运动训练, 脊髓损伤, 移植, 血管再生, 功能, 神经修复

Abstract:

BACKGROUND: Endothelial progenitor cells are widely used in the treatment of various vascular diseases, and early exercise training contributes to restore motor function after spinal cord injury. However, the therapeutic effects of endothelial progenitor cell transplantation or early exercise training alone are unfavorable.
OBJECTIVE: To observe the influence of transplantation of endothelial progenitor cells combined with early exercise training on blood vessel regeneration and hind limb function in rats after spinal cord injury.
METHODS: Eighty adult Sprague-Dawley rats were enrolled to establish spinal cord injury models using the modified Allen’s method, and then randomly divided into four groups. Rats were respectively given culture medium via the tail vein, injection of endothelial progenitor cells (3×106) via the tail vein, roller and treadmill trainings for 2 weeks, or injection of endothelial progenitor cells via the tail vein followed by 2 weeks of roller and treadmill trainings in the model, cell transplantation, exercise and combined groups.
RESULTS AND CONCLUSION: At 2 weeks after transplantation, the hindlimb motor function of rats in the combined group was better than that in the cell transplantation group and exercise group, and moreover, the percentage of CM-Dil positive cells, the number of horseradish peroxidase-positive nerve fibers, capillary density and expression of vascular endothelial growth factor and brain-derived neurotrophic factor were also significantly higher in the combined group than the cell transplantation group and exercise group. These findings indicate that early exercise training has a neuroprotective role in spinal cord injury; endothelial progenitor cell transplantation combined with early exercise training can promote regeneration of synapses and blood vessels and improve hindlimb motor function of rats, probably by increasing expression levels of vascular endothelial growth factor and brain-derived neurotrophic factor.

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图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析所有大鼠均进入结果分析。

2.2 运动功能术前全部大鼠的BBB评分、改良的Tarlov评分及斜板试验差异均无显著性意义(P > 0.05)。造模后2-4周后，内皮祖细胞组、运动组、联合组大鼠BBB评分、改良的Tarlov评分及斜板试验评分较模型组都明显增加(P < 0.05)，且联合组大鼠3项评分高于运动组和内皮祖细胞组(P < 0.05；表1)。

2.3 病理变化苏木精-伊红染色，模型组大鼠脊髓组织缺失所致脊髓空洞形成。内皮祖细胞组和运动组大鼠损伤区的脊髓空洞缩小，联合组大鼠脊髓空洞几乎消失(图1)。

移植后4周，模型组和运动组大鼠脊髓损伤区中未见CM-Dil阳性细胞，内皮祖细胞组大鼠脊髓损伤区中可见CM-Dil阳性细胞，占全部细胞的(17.54±4.32)%，联合组大鼠脊髓损伤区中CM-Dil阳性细胞最多，达(26.54±4.43)%(图2)。

2.4 神经纤维辣根过氧化物酶逆行神经示踪结果显示，模型组可见少量辣根过氧化物酶标记神经纤维阳性纤维，微血管密度较低。内皮祖细胞组和运动组辣根过氧化物酶阳性神经纤维和微血管密度其次。联合组神经纤维和微血管密度最多，各组差异有显著性意义(P < 0.05；图3，4；表2)。

2.5 血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子mRNA表达水平移植后4周，大鼠脊髓损伤区血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子mRNA表达情况联合组最多，内皮祖细胞组和运动组的血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子mRNA表达情况次之，模型组最少(P < 0.05；图5)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2013年9月至2015年7月在河北医科大学动物实验室完成。

1.3 材料成年健康雌性SD大鼠80只，鼠龄2个月，体质量200-250 g，购自河北省实验动物中心[许可证号SCXK(冀)20080004]。饲养环境温度18-22 ℃，湿度50%，自然光线。实验符合动物伦理学要求，实验方案经河北省实验动物中心动物实验伦理委员会批准。

内皮祖细胞由河北医科大学动物实验室提供。

1.4 方法

1.4.1 内皮祖细胞的体外培养及CM-Dil标记复苏冻存的内皮祖细胞，加入L-DMEM培养基(美国Gibco BRL公司)，在培养皿中接种少量悬浮液后置于培养箱中进行培养，当培养时间达72 h时，更换培养基，弃上清，隔天换液，同时察看细胞的生长情况，取生长良好的细胞，用于后继实验。该其避光后吸取5 µL用0.1 mol/L的PBS(上海信然生物技术有限公司)稀释的CM-Dil液(美国Sigma公司)，添加到1.5 mL的EP管中，再加入含体积分数5%胎牛血清(Hyclone公司)1 mL的完全培养液，将其混匀后，即可获得得CM-Dil 标记液。提取融合且贴壁达80%的内皮祖细胞，吸弃培养液后，将PBS清洗3次，添加上述标记液40 µL/cm²，在饱和湿度37 ℃、体积分数5% CO₂的恒温培养箱孵育20 min，吸弃标记液，添加含体积分数5%胎牛血清5 mL 37 ℃的完全培养液，孵育10 min吸弃后，再添加含体积分数5%胎牛血清完全培养液清洗3次后备用。

1.4.2 脊髓损伤动物模型的建立选择80只SD大鼠，在实验室中饲养2周后，用体积分数10%的水合氯醛按照350 mg/kg腹腔注射麻醉，俯卧位固定，按T₈_-₉棘突为切口中心，自大鼠背部正中逐层切开，咬除T₈_-₉棘突和部分椎板，充分显露T₇_-₁₀的椎板和棘突，将其暴露硬膜保持完整，作为损伤区。运用改良的Allen法打击^[14]，将由2.5 cm高度处10 g的重物自由落下，撞击脊髓组织及大鼠硬膜(术后双下肢瘫痪且大鼠尾巴痉挛摆动表明成功)。拿双氧水清洗伤口，然后逐层缝合背部切口。在术后每天挤尿2到3次，直至大鼠恢复排尿反射为止。

1.4.3 动物分组及干预将80只造模成功的大鼠按随机数字表法分为模型组、内皮祖细胞组、运动组和联合组，各20只。

内皮祖细胞组大鼠在造模后6 h经尾静脉注射1 mL内皮祖细胞(3×10⁶)。模型组注射1 mL L-DMEM培养液。运动组大鼠以滚筒训练和跑台训练联合进行的运动功能训练。脊髓损伤前3 d，将实验大鼠置于康复训练器材(天津普力奇健身器械有限公司)内进行适应性训练，于损伤后2 d起开始训练。滚筒训练：大鼠于转速5 r/min的网状滚筒训练器(重庆广亚体育设备制造有限公司)中进行攀爬和抓握等运动训练。跑台训练：跑台(深圳博研商用设备有限公司)速度在第1-4周时分别设定为350，400，600和800 cm/min。滚筒训练+跑台训练每次共 10 min，每天进行3次，间隔10 min，每周进行5次，共训练2周。联合组大鼠尾静脉注射1 mL内皮祖细胞(3×10⁶)同时进行早期运动训练。

1.4.4 下肢运动功能评价所有大鼠均在造模前及造模后1，3 d及1，2，3，4周进行运动功能评定。评定项目包括改良Tarlov评分，BBB评分和斜板试验。分别于移植前及移植后的1，2，3，4周采用BBB评分、改良Tarlov评分及斜板试验对各组大鼠进行运动功能评定。采取双盲法进行相关评分，评分均为2人合评。

BBB评分共22级^[12^，^15]：0级为后肢完全瘫痪，21级为功能正常，主要观察指标包括关节活动次数，运动负荷、范围，前肢、后肢及前爪、后爪、尾巴的协调程度。

改良Tarlov评分^[16]：0级，后肢无活动，不能负重；1级，后肢可见活动但不能负重；2级，后肢活动频繁或有力，不能负重；3级，后肢可支持体质量，能走一两步；4级，可行走，仅有轻度障碍；5级，行走正常。

斜板试验^[17]：大鼠放置在光滑的木板上，体轴垂直于板的垂直轴，每个试验斜板的角度增加5°，当最大角度时大鼠可停留5 s，则认为有功能价值。

1.4.5 苏木精-伊红染色及CM-Dil标记内皮祖细胞观察用2.5%氯胺酮20 mg/kg于大鼠腹腔注射麻醉，断头后迅速取损伤区脊髓组织，用多聚甲醛水溶液浸泡24 h后，经脱水、透明、浸蜡、包埋，连续冠状切片(片厚10 μm)，每隔100 μm连续取5张。苏木精-伊红染色、中性树胶封固。光镜(上海普丹光学仪器有限公司)及荧光显微镜(上海普丹光学仪器有限公司)下观察标本。

1.4.6 辣根过氧化物酶逆行神经示踪移植后4周，用生理盐水溶解辣根过氧化物酶(杭州俊丰生物工程有限公司)。每组随机取5只大鼠，以0.1 μL/10 min的速度注射50%辣根过氧化物酶1 μL，注射完毕后留针15 min。在T₁₂脊髓的背正中静脉左、右侧1 mm处进针，进针深度为1.5 mm。饲养3 d。在水合氯醛麻醉下，40 g/L多聚甲醛心脏灌注，并且取出T₃_-₁₁脊髓，浸入30%的4 ℃蔗糖溶液20 h，制成5 μm的冰冻切片，DAB染色。光镜下计数辣根过氧化物酶阳性神经纤维束数量。

1.4.7 RT-PCR检测血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子mRNA的表达移植后4周，每组取5只大鼠，断头后迅速取损伤区脊髓组织，以Trizol说明书法提取脊髓组织的总RNA，总RNA含量测定采用紫外分光光度计法，用RT-PCR两步法试剂盒(TaKaRa公司)将mRNA逆转录成cDNA，接着再将cDNA行PCR扩增。引物序列为：血管内皮生长因子(159 bp)上游5’-TAG GGA TTC AGT GGT GTC AGG-3’，下游5’-GAC CCA TTA CAA GCA TGA GGA-3’；脑源性神经营养因子(410 bp)上游5’-GCC TAT TCC TGC TGC TTT CAT T-3’，下游5’-TGC CTG ATG CCG TTC ATA AAT A-3’；β-actin (175 bp)上游5’-CCA TCA TGA AGT GTG ACG TTG-3’，下游5’-ACA GAG TAC TTG CGC TCA GGA-3’。行电泳时采用扩增产物，结果通过凝胶图像分析系统(北京东方三旌科技发展有限公司)进行吸光度测量的电泳，以血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子mRNA与β-actinmRNA吸光度的比值作为两者的表达水平。

1.5 主要观察指标下肢运动功能、病理变化以及血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子mRNA的表达水平。

1.6 统计学分析数据均采用SPSS 13.0软件包进行处理。所有实验数据以x(_)±s表示，两组间连续变量比较用t 检验，以 P为差异有显著性意义。 < 0.05

讨论

内皮祖细胞是造血干细胞的一个亚群，因此其有着和干细胞相似的特性，其能够在损伤等原因的刺激下分化为成熟的血管内皮细胞^[18-20]，也因此引起了人们研究的兴趣，目前国内外已有研究显示内皮祖细胞可以促进血管的新生，对内皮起到一定的修复作用，脊髓损伤修复过程中，损伤区血液供应的重新建立有着至关重要的作用^[21-24]。

脊髓损伤的病理生理过程主要包括2个阶段，即原发性损伤及与脊髓损伤后脊髓出血水肿造成的继发性损伤^[25-27]。临床中针对脊髓损伤后继发性损害的治疗较多，继发性损伤机制复杂，炎症反应是其重要机制中的一种，临床中治疗脊髓损伤后炎症反应多采用药物治疗，然而抗炎药物不良反应较多，也因此限制了其发展^[28-30]。大量研究表明，通过规律的运动训练可以产生同抗炎药物类似的抗炎作用^[23^，^31-33]。炎症反应多与炎症因子及炎症介质的释放有关，研究发现规律的运动训练可使白细胞释放得过炎症介质减少，从而减轻继发性损伤^[34-40]。

本实验通过对大鼠行不同干预后，观察大鼠脊髓损伤区血管再生及后肢功能的恢复情况，通过各种检查对大鼠的运动功能及血管再生情况进行评价，结果显示联合应用内皮祖细胞移植及运动组均优于其他3组，且差异具有显著性，而单独使用内皮祖细胞移植或早期运动训练的大鼠运功功能恢复及血管再生情况优于模型组，大鼠脊髓损伤区血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子表达情况，联合组最多，内皮祖细胞组和运动组的血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子表达情况次之，模型组最少，这些均与先前相关研究得出的结果是一致的^[41-48]。

综上所述，运动组对脊髓损伤起到神经保护的作用，早期运动训练联合内皮祖细胞移植治疗大鼠脊髓损伤能够促进脊髓损伤大鼠神经突触和血管的再生，改善其大鼠肢体运动功能。尽管目前本实验仍处于动物实验阶段，具体由动物实验走向临床运用治疗脊髓损伤尚需不断地努力探索，需要大量的相关性实验研究推动，但是早期运动训练联合内皮祖细胞移植治疗一定会为脊髓损伤患者带来新的希望。