淫羊藿苷对环磷酰胺化疗导致小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化障碍的保护作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.06.003

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (6): 777-784.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.06.003

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

淫羊藿苷对环磷酰胺化疗导致小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化障碍的保护作用

杨志烈^1，2，王成龙²，赵东峰²，常君丽²，杨成¹，杨燕萍²，王拥军²

¹滨州医学院中西医结合学院，山东省烟台市 264003；²上海中医药大学附属龙华医院，上海市 200032

收稿日期:2016-01-04 出版日期:2016-02-05 发布日期:2016-02-05
通讯作者: 杨燕萍，研究员，上海中医药大学附属龙华医院，上海市 200032 并列通讯作者：王拥军，教授，博士生导师，上海中医药大学附属龙华医院，上海市 200032
作者简介:杨志烈，男，1987年生，贵州省遵义市人，汉族，2016年滨州医学院毕业，硕士，主要从事骨与关节方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81373667和81202708)；国家重点基础研究发展计划(“973”计划)基金资助项目(2010CB530400)；上海中医药大学“085”一流学科建设(085ZY1217和085ZY1204)；教育部创新团队发展计划(IRT1270)；国家中医临床研究基地龙医学者、龙医团队计划项目(LYTD-23)；上海市科委“扬帆计划”项目(15YF1412200)；上海中医药大学龙华医院自然基金(14YR03)

Icariin protects against cyclophosphamide-induced obstacle of mouse bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into osteoblasts

Yang Zhi-lie^{1, 2}, Wang Cheng-long², Zhao Dong-feng², Chang Jun-li², Yang Cheng¹, Yang Yan-ping², Wang Yong-jun²

¹Institute of Integrated Chinese and Western Medicine, Binzhou Medical University, Yantai 264003, Shandong Province, China; ²Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China

Received:2016-01-04 Online:2016-02-05 Published:2016-02-05
Contact: Yang Yan-ping, Researcher, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China Corresponding author: Wang Yong-jun, Professor, Doctoral supervisor, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China
About author:Yang Zhi-lie, Master, Institute of Integrated Chinese and Western Medicine, Binzhou Medical University, Yantai 264003, Shandong Province, China; Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81373667, 81202708; the National Basic Research Program of China (973 Program), No. 2010CB530400; a grant for the “085” First-Class Disciplines Construction of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, No. 085ZY1217,

085ZY1204; the Innovation Team Development Program of Ministry of Education in China,

No. IRT1270; the Dragon Medical Scholar and Team Program of the National TCM Clinical Research Base, No. LYTD-23; the Sail Program of Shanghai Science and Technology Department, No. 15YF1412200; the Natural Science Foundation of Longhua Hospital of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, No. 14YR03

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

淫羊藿苷：属黄酮类化合物，为常用补肾中药淫羊藿的主要有效成分，现代药理学研究显示淫羊藿苷可促进骨形成，抑制骨吸收，具有很强的抗骨质疏松活性，在防治骨缺损、骨质疏松等骨疾病中具有广阔的应用前景。此外淫羊藿苷还具有抗炎、抗肿瘤和抗抑郁、抗神经元损伤、促神经突触生长等作用。

参与成骨细胞分化的信号通路：成骨细胞是人体骨组织的重要组成成分，也是参与骨形成的主要功能细胞，在骨骼生长发育及骨量维持方面扮演着关键角色。它来源于具有多向分化潜能的间充质干细胞，经细胞增殖、细胞外基质合成、成熟及矿化后最终发展成为骨细胞，从而促进骨形成及维持骨量。从分子生物学水平上看，目前已知多条信号通路参与了成骨细胞分化过程的调节，其中最重要的信号通路包括BMP-Smads、Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog、FGF等。这些信号通路在调控成骨细胞分化及骨生成方面起着重要作用，一旦其中一条或数条信号通路调节受阻，都会引起成骨细胞分化异常或骨形成障碍，进而导致相应骨代谢疾病的发生，如骨质疏松症、骨硬化症等。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0003-4736-1981 (杨志烈)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 环磷酰胺, 骨髓间充质干细胞, 成骨分化, 淫羊藿苷, 保护作用 , Wnt/β-catenin, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Osteoporosis caused by chemotherapy has become one of the serious side effects that impact the skeletal system. Icariin shows a strong anti-osteoporosis activity, which can have protective effect on osteoporosis induced by chemotherapy.
OBJECTIVE: To study the protective effect and mechanism of icariin against cyclophosphamide-induced obstacle of mouse bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into osteoblasts.
METHODS: MTT assay and alkaline phosphatase (ALP) staining were used to determine the optimal protective concentration of icariin against cyclophosphamide-induced obstacle of mouse bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into osteoblasts. mRNA expressions of osteoblast-specific transcription factors, OC, ALP, Runx2, and Wnt/β-catenin signaling pathway target genes, β-catenin, C-Myc, cyclin D1, were determined using RT-PCR method at different time after intervention with the optimal concentration of icariin. Expressions of Runx2, β-catenin, c-Myc, cyclin D1 regulated by the optimal concentration of icariin were detected using western blot assay at the protein level.
RESULTS AND CONCLUSION: Cell viability and ALP activity decreased significantly in the cyclophosphamide group compared with the control group, but there was no significant difference in cell viability between icariin group and cyclophosphamide group. Icariin at 100 μmol/L showed the best protective effect against cyclophosphamide-induced obstacle of osteogenic differentiation of bone marrow mesenhymal stem cells. Compared with the control group, cyclophosphamide chemotherapy reduced the expressions of ALP, OC, Runx2 at mRNA level and Runx2 at protein level, weakened the expressions of β-catenin, cyclin D1 at mRNA level and active β-catenin, Cyclin D1, c-myc at protein level, and increased the expression of DKK1. Compared with the cyclophosphamide group, 100 μmol/L icariin increased the expression of osteoblast-specific transcription factors and Wnt/β-catenin signaling pathway genes at mRNA and protein levels, and reduced the expression of DKK1 protein. These results show that cyclophosphamide can lead to osteogenic differentiation disorder of mouse bone marrow mesenchymal stem cells, and in contrast, icariin shows a protective effect and its optimal intervention concentration is 100 μmol/L. Additionally, the protective role of icariin is probably related to activation of Wnt/β-catenin signal pathway.

杨志烈，王成龙，赵东峰，常君丽，杨成，杨燕萍，王拥军. 淫羊藿苷对环磷酰胺化疗导致小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化障碍的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(6): 777-784.

Yang Zhi-lie, Wang Cheng-long, Zhao Dong-feng, Chang Jun-li, Yang Cheng, Yang Yan-ping, Wang Yong-jun . Icariin protects against cyclophosphamide-induced obstacle of mouse bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into osteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(6): 777-784.

图/表（结果） 4

2.1 不同浓度淫羊藿苷对环磷酰胺诱导下骨髓间充质干细胞活力的影响与正常对照组比较，环磷酰胺组(淫羊藿苷0 μmol/L组)表现为抑制了骨髓间充质干细胞活力，差异有显著性意义(P < 0.05)。与环磷酰胺组比较，不同浓度淫羊藿苷干预组的骨髓间充质干细胞活力差异无显著性意义，提示淫羊藿苷对环磷酰胺诱导下骨髓间充质干细胞活力无明显影响，见图1。

2.2 不同浓度淫羊藿苷对环磷酰胺导致骨髓间充质干细胞成骨分化障碍过程中碱性磷酸酶染色的影响与正常对照组比较，环磷酰胺组碱性磷酸酶染色面积和程度明显减弱，但给予0，50，100 μmol/L淫羊藿苷处理后，与环磷酰胺组比较，淫羊藿苷50，100 μmol/L组染色面积增加及染色程度增强，100 μmol/L淫羊藿苷组碱性磷酸酶染色表现最为明显，见图2。

2.3 淫羊藿苷对环磷酰胺导致骨髓间充质干细胞成骨分化障碍过程中成骨相关特异性因子表达的影响与正常对照组比较，环磷酰胺组成骨相关基因ALP、OC、Runx2的表达均受到明显抑制(P < 0. 05或P < 0. 01或 P。与环磷酰胺组比较，淫羊藿苷在不同时间点ALP、OC、Runx2 mRNA的表达水平明显提高，见图3。Western blot 检测结果如图4所示，与正常对照组比较，环磷酰胺组Runx2蛋白表达显著降低，而淫羊藿苷在24，48 h提高了Runx2蛋白表达。 < 0.001)

2.4 淫羊藿苷对环磷酰胺导致骨髓间充质干细胞成骨分化障碍过程中Wnt/β-catenin信号通路相关基因及蛋白表达的影响与正常对照组比较，环磷酰胺组Wnt/ β-catenin信号通路相关基因Wnt4、β-catenin、Cyclin D1的表达水平均出现明显抑制(P < 0.05或P < 0.01或P < 0.001)。与环磷酰胺组比较，淫羊藿苷处理组 Wnt4、β-catenin、Cyclin D1 mRNA表达水平均明显提高；与正常对照组比较，环磷酰胺组β-catenin、Cyclin D1、C-myc蛋白表达显著降低，而淫羊藿苷处理组在24，48 h明显增强了β-catenin、Cyclin D1、C-myc蛋白表达；与正常对照组比较，环磷酰胺组DKK1蛋白(Wnt通路抑制蛋白)表达明显升高，相比于环磷酰胺组，淫羊藿苷处理组DKK1蛋白表达显著降低，见图5，6。

参考文献

[1] Jonat W, Kaufmann M, Sauerbrei W, et al. Goserelin versus cyclophosphamide, methotrexate, and fluorouracil as adjuvant therapy in premenopausal patients with node-positive breast cancer: The Zoladex Early Breast Cancer Research Association Study. J Clin Oncol. 2002;20(24):4628-4635.
[2] Shapiro CL, Manola J, Leboff M. Ovarian failure after adjuvant chemotherapy is associated with rapid bone loss in women with early-stage breast cancer. J Clin Oncol. 2001;19(14):3306-3311.
[3] 于琼,吕思敏,崔燎,等. Micro-CT 和力学测试观察环磷酰胺诱导大鼠骨质疏松模型的时效特点[J].中国骨质疏松杂志,2015,21(9):1029-1034.
[4] 戚朦,刘文佳,马洋,等.亚精胺促进雌激素缺乏小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化并抑制其成脂分化[J].细胞与分子免疫学杂志,2015,31(6):787-791.
[5] 李晨睿,孟志远,牛银波,等.黄芩苷通过Wnt/β-catenin信号通路对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的促进作用[J].中国药理学通报,2015,31(7):919-924.
[6] Tang DZ, Hou W, Zhou Q, et al. Osthole stimulates osteoblast differentiation and bone formation by activation of beta-catenin-BMP signaling. J Bone Miner Res. 2010;25(6):1234-1245.
[7] 成魁,葛宝丰,甄平,等.口服淫羊藿苷可提高大鼠的峰值骨密度和骨质量[J].中国骨质疏松杂志,2014,20(2):120-124.
[8] 赵连梅,纪昕,单保恩,等.淫羊藿苷对化疗后小鼠骨髓和细胞免疫抑制作用的影响[J].细胞与分子免疫学杂志,2010, 26(10):976-979.
[9] 张荣耀,毕晓娟,马艳,等.全骨髓法培养C57小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性[J].中国组织工程研究,2014, 18(1):45-50.
[10] 王新禹,梁前进.环磷酰胺的毒副作用机制及应对措施[J]. 药学进展,2006,30(10):452-456.
[11] Ludeman SM. The chemistry of the metabolites of cyclophosphamide. Curr Pharm Des. 1999;5(8): 627-643.
[12] 陈玲燕,王雪丁,黄民.环磷酰胺的药物基因组学研究进展[J]. 药学学报,2014,49(7):971-976.
[13] Aubin JE. Advances in the osteoblast lineage. Biochem Cell Biol. 1998;76(6):899-910.
[14] Howlett CR, Cavé J, Williamson M, et al. Mineralization in in vitro cultures of rabbit marrow stromal cells. Clin Orthop Relat Res. 1986;(213):251-263.
[15] Kanno T, Takahashi T, Tsujisawa T, et al. Platelet-rich plasma enhances human osteoblast-like cell proliferation and differentiation.J Oral Maxillofac Surg. 2005;63(3):362-369.
[16] Ogino Y, Ayukawa Y, Tsukiyama Y, et al. The effect of platelet-rich plasma on the cellular response of rat bone marrow cells in vitro. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2005;100(3):302-307.
[17] 高寒,张荣华,朱晓峰,等. rhBMP-2对SD大鼠MSCs骨向分化的影响及机制研究[J].暨南大学学报:自然科学与医学版,2014,35(3):267-272.
[18] 杨锋,李小群,杨利学,等.右归丸含药血清对骨髓间充质干细胞成骨及成脂分化的影响[J].中华中医药杂志,2015, 30(1):263-266.
[19] Enomoto H, Furuichi T, Zanma A, et al. Runx2 deficiency in chondrocytes causes adipogenic changes in vitro. J Cell Sci. 2004;117(Pt 3):417-425.
[20] Otto F, Thornell AP, Crompton T, et al. Cbfa1, a candidate gene for cleidocranial dysplasia syndrome, is essential for osteoblast differentiation and bone development.Cell. 1997;89(5):765-771.
[21] Bragdon CR, Jasty M, Muratoglu OK, et al. Third-body wear of highly cross-linked polyethylene in a hip simulator. J Arthroplasty. 2003;18(5):553-561.
[22] 傅淑平,杨丽,洪浩,等.淫羊藿苷促SD大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化作用的实验研究[J].中国中西医结合杂志,2015,35(7):839-846.
[23] Hoffmann A, Preobrazhenska O, Wodarczyk C, et al. Transforming growth factor-beta-activated kinase-1 (TAK1), a MAP3K, interacts with Smad proteins and interferes with osteogenesis in murine mesenchymal progenitors.J Biol Chem. 2005;280(29):27271-27283.

24] Chen G, Deng C, Li YP. TGF-β and BMP signaling in osteoblast differentiation and bone formation. Int J Biol Sci. 2012;8(2):272-288.
[25] 杨丽,朱晓峰,王攀攀,等.骨碎补水提液对大鼠MSCs骨向分化的影响及机制研究[J].中药材,2013,36(8): 1287-1292.
[26] Day TF, Guo X, Garrett-Beal L, et al. Wnt/beta-catenin signaling in mesenchymal progenitors controls osteoblast and chondrocyte differentiation during vertebrate skeletogenesis. Dev Cell. 2005;8(5): 739-750.
[27] Liu AR, Liu L, Chen S, et al. Activation of canonical wnt pathway promotes differentiation of mouse bone marrow-derived MSCs into type II alveolar epithelial cells, confers resistance to oxidative stress, and promotes their migration to injured lung tissue in vitro.J Cell Physiol. 2013;228(6):1270-1283.
[28] Yu Q, Liu L, Duan Y, et al. Wnt/β-catenin signaling regulates neuronal differentiation of mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2013; 439(2):297-302.
[29] Logan CY, Nusse R. The Wnt signaling pathway in development and disease. Annu Rev Cell Dev Biol. 2004;20:781-810.
[30] Gaur T, Lengner CJ, Hovhannisyan H, et al. Canonical WNT signaling promotes osteogenesis by directly stimulating Runx2 gene expression. J Biol Chem. 2005; 280(39):33132-33140.
[31] 谢兴文,李盛华,赵永利,等. Wnt信号通路在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化机制的研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2011,17(12):1103-1106,1094.
[32] Zhou H, Shang L, Li X, et al. Resveratrol augments the canonical Wnt signaling pathway in promoting osteoblastic differentiation of multipotent mesenchymal cells. Exp Cell Res. 2009;315(17):2953-2962.
[33] Wang FS, Ko JY, Yeh DW, et al. Modulation of Dickkopf-1 attenuates glucocorticoid induction of osteoblast apoptosis, adipocytic differentiation, and bone mass loss. Endocrinology. 2008;149(4): 1793-1801.

引言

临床报道以环磷酰胺(cyclophosphamide，CPA)等联合辅助治疗癌症疗效确切，但随着化疗的推进，会出现严重的毒副作用，在骨骼系统主要表现为皮质骨和小梁骨的骨量丢失，最终导致骨质疏松^[1-2]。实验发现环磷酰胺可导致大鼠骨微结构退化，骨生物力学性能降低^[3]；而且骨质疏松症的发生发展与骨髓间充质干细胞成骨分化功能异常密切相关^[4]。骨髓间充质干细胞是一种多能干祖细胞，具有分化成多种不同间质细胞谱系的能力，当这种多潜能分化特性受损后，易导致骨吸收和骨形成偶联失衡，是引发骨代谢疾病的关键。

Wnt/β-catenin信号通路在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中扮演重要角色。近年来研究发现，多种植物药单体能调控Wnt/β-catenin信号通路的相关因子，对骨质疏松具有防治作用，如黄芩苷、补骨脂素等^[5-6]。淫羊藿苷(Icariin，ICA)属黄酮类化合物，为常用补肾中药淫羊藿的主要有效成分，现代药理学研究显示淫羊藿苷能促进骨髓间充质干细胞骨性分化，增加骨形成，具有很强的抗骨质疏松性^[7]，对环磷酰胺导致的骨髓有核细胞损害具有保护作用^[8]，但是淫羊藿苷对环磷酰胺导致的小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化障碍是否同样具有作用？如果存在这种保护作用，是否与其调节Wnt/ β-catenin 信号通路有关？

实验通过在体外建立环磷酰胺诱导小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化障碍模型，观察淫羊藿苷对其保护作用以及对Wnt/β-catenin信号通路的调控，为中西医结合防治临床肿瘤化疗患者所导致的骨相关疾病提供实验依据与理论指导。

材料方法

1.1 设计分组对照细胞学实验。

1.2 时间及地点实验于2014年5月至2015年12月在上海中医药大学附属龙华医院脊柱病研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 仪器 CFX96实时荧光定量PCR仪(BIO-RAD，USA)；ChemiDoc MP凝胶成像仪(BIO-RAD，USA)；DU 800 UV/Vis分光光度计(Beckman Coulter，USA)；CO₂培养箱(Thermo Scientific，USA)；全波长扫描多功能读数仪(Thermo Scientific，USA)；5417R高速冷冻离心机(Eppendorf，DEU)。

1.3.2 药品与试剂淫羊藿苷(上海友思生物技术有限公司，批号：140201，纯度>98%，50 mg/瓶)；环磷酰胺(中国恒瑞医药股份有限公司，批号13022825，0.2 g/瓶)；Trizol Reagent(Invitrogen，USA)；PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Premix Ex Taq(Takara，JPN)；PCR引物(华大基因生物有限公司，中国)；蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(Beyotime，CHN)；Penicillin-Streptomycin(P-S，Biowest，FRA)；碱性磷酸酶染色试剂(Thermo Scientific，USA)；MTT 试剂、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松、二甲基亚砜(Sigma-Aldrich公司)；Active β-catenin、Runx2(Abcam，GBR)；c-Myc、cyclin D1、β-actin抗体(CST，USA)；DKK1单克隆抗体(Abcam公司)；辣根过氧化物酶标记的二抗(碧云天公司，中国)。

1.3.3 细胞小鼠胚胎肝细胞株(BNL CL.2)购于中国科学院细胞库。

1.3.4 实验动物 6-8周龄，雄性C57BL/6小鼠30只，SPF级，体质量18-22 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号: 2015000500404，许可证号: SCXK(沪)2012-0002。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养采用全骨髓贴壁法及前期实验基础^[9]，分离培养C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞，第5天用无菌PBS溶液清洗2次后换液，待细胞生长至80%密度后，胰酶消化进行传代培养(此为第1代)。至第3代时进行实验，96孔板、24孔板、10 cm培养皿接种密度分别为1×10⁴，2×10⁵，2×10⁶个/孔(皿)。

1.4.2 药物配制淫羊藿苷(50 mg/瓶)以二甲基亚砜溶解为1×10^-¹ mol/L后，以α-MEM基本培养基稀释为2×10^-³ mol/L淫羊藿苷母液。1 mL/管分装密封，-20 ℃贮藏备用。

1.4.3 环磷酰胺条件培养基的制备因环磷酰胺在体外无细胞毒性，需经体内肝脏微粒体细胞色素P450酶氧化后分解生成酰胺氮芥，才能发挥细胞毒作用，故制备条件培养基用于体外研究。将小鼠胚胎肝细胞株(BNL CL.2)用DMEM完全培养基(含体积分数为10%胎牛血清，1% P-S)培养于25 cm培养皿；待细胞达70%密度后，DMEM基础培养基(含1%P-S，无胎牛血清)饥饿处理12 h，更换为含有环磷酰胺(4 000 μmol/L)的DMEM培养基(含体积分数为2%胎牛血清，1%P-S)培养24 h；收集培养基，4 500 r/min离心15 min，0.22 μm滤网过滤后分装，-20 ℃保存备用；以不含环磷酰胺条件培养基作为对照。

1.4.4 细胞活力检测细胞接种于96孔板培养，待铺满80%密度后更换环磷酰胺条件培养基培养，正常对照组用不含环磷酰胺条件培养基培养，干预72 h后更换为α-MEM培养基(含体积分数为5%胎牛血清)，淫羊藿苷组在环磷酰胺条件培养基培养的细胞培养皿中加入淫羊藿苷母液，使其终浓度为0，50，100 μmol/L，每个浓度6个复孔，正常对照组、环磷酰胺组加入等体积的基本培养基对照，2 d后MTT法检测。用酶标仪于490 nm波长处测定吸光度以代表细胞活力。

细胞存活率(%)=(A_给药组-A_空白组)/ (A_{正常对照组}-A_空白组)×100%

1.4.5 碱性磷酸酶染色细胞接种于 24 孔板培养，待达80%密度后更换环磷酰胺条件培养基培养，正常对照组用不含环磷酰胺条件培养基作对照，干预72 h后更换为成骨诱导液培养，淫羊藿苷组在成骨诱导液中加入淫羊藿苷母液，使其终浓度为0，10，50，100 μmol/L，正常对照组、环磷酰胺组加入等体积培养基，每3 d换液1次，于第6天弃旧液，无菌PBS洗2次，用体积分数为10%中性甲醛固定液固定10 min，加入碱性磷酸酶染色试剂，锡箔纸包裹避光，37 ℃孵育30 min，观察碱性磷酸酶染色情况，扫描保存结果。

1.4.6 RT-PCR分析按“1.4.5”方法处理后，使淫羊藿苷干预浓度为100 μmol/L，正常对照组、环磷酰胺组加入等体积培养基对照，按24，48 h倒序添加药物后，用Trizol提取总RNA，检测RNA质量及浓度后，按RT-PCR法测定试剂盒及Bio-Rad CFX96型实时荧光定量PCR仪操作步骤说明，检测相关基因的表达情况，反应条件：95 ℃预变性 1 min，95 ℃变性15 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40次循环。以 β-actin为内参，2^-^??Ct法统计分析，目的基因引物序列见表1。

1.4.7 Western blot分析细胞接种于10 cm培养皿，待铺满80%密度后更换环磷酰胺条件培养基培养，正常对照组用不含环磷酰胺条件培养基，干预72 h后，更换为完全培养液培养，淫羊藿苷组在完全培养基中加入淫羊藿苷母液，使其终浓度为100 μmol/L，正常对照组、环磷酰胺组加入等体积培养基对照，按24，48 h倒序添加药物后，每皿用400 μL细胞裂解液(含有PMSF 1 mmol/L)提取总蛋白。BCA法测蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜和封闭，Active β-catenin(活化的β-连环蛋白)、Runx2(核心结合因子)、cyclin D1(细胞周期蛋白D1)、c-Myc(原癌基因)、β-actin单克隆抗体(稀释比例为1∶1 000)，DKK1(稀释比例为1∶500)，4 ℃摇床过夜孵育。经漂洗、HRP多克隆二抗室温孵育1 h及再次漂洗后，加入高灵敏度底物ECL发光试剂盒(A︰B=1︰1)显色底物进行化学显色。

1.5 主要观察指标 ①细胞活力。②碱性磷酸酶染色观察结果。③RT-PCR及Western blot分析成骨转录特异性因子、Wnt/β-catenin 信号通路相关基因的mRNA及蛋白表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0软件处理实验数据。实验数据以x(_)±s表示，两两比较采用t 检验法，组间比较采用ANOVA-One Way检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

环磷酰胺是一种烷基化类抑制剂，经体内肝细胞色素P450酶作用后，能产生干扰核酸生成的效应^[10-12]，这是其发挥治疗作用的基础，也是导致机体组织细胞损伤的生物学基础。实验通过制备含有环磷酰胺条件培养基来干预骨髓间充质干细胞，模拟环磷酰胺在体内经肝脏代谢后对骨髓间充质干细胞的影响。实验结果发现，应用含环磷酰胺的条件培养基处理骨髓间充质干细胞后，骨髓间充质干细胞活力明显受到抑制(P < 0.05)，但不同浓度淫羊藿苷组对环磷酰胺诱导下骨髓间充质干细胞活力均无明显影响。

碱性磷酸酶是一种钙结合转运蛋白，主要分布于细胞膜，它能够在体外诱导骨髓间充质干细胞成骨过程中合成和表达，参与成骨分化的复杂过程，碱性磷酸酶不仅可作为成骨细胞活性和早期分化的特异性标志^[13]，而且它在增加矿盐分泌、促进基质钙化过程中亦发挥关键性作用^[14-16]。由此可知，碱性磷酸酶染色是评价成骨细胞早期骨性分化的重要方法^[17-18]，碱性磷酸酶的活性强弱可以反映骨髓间充质干细胞成骨性分化的程度。实验以环磷酰胺条件培养基处理骨髓间充质干细胞并经成骨诱导后进行碱性磷酸酶染色，结果显示：与正常对照组相比，环磷酰胺组显色明显减弱，提示环磷酰胺对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化具有抑制作用。Runx2、OC均为成骨细胞特异性转录因子，Runx2对骨组织骨性发育和骨细胞分化具有显著影响，有研究发现采用基因敲除技术的Runx2^-^/^-小鼠不仅表现为膜内与软骨内的骨性发育障碍，而且在成骨细胞骨性分化方面同样受到抑制，最终导致骨量丢失^[19-20]。此外，在成骨分化成熟过程中，由干细胞或未成熟成骨细胞表达的骨钙素^[21]，是反映骨性分化功能的特异性指标。实验结果证实：与正常对照组比较，环磷酰胺组明显降低了成骨分化特异性转录分子ALP、OC、Runx2 mRNA水平，且显著抑制Runx2蛋白表达，说明环磷酰胺导致了骨髓间充质干细胞的成骨分化障碍。

淫羊藿苷是常用补肾中药淫羊藿的主要有效成分，具有促大鼠骨髓间充质干细胞成骨性分化作用，能增强碱性磷酸酶的活性，提高成骨性相关因子OC和Runx2的基因表达水平^[22]。实验在建立环磷酰胺诱导骨髓间充质干细胞成骨分化障碍的基础上，观察淫羊藿苷发挥保护其成骨分化的作用。与环磷酰胺组相比，淫羊藿苷干预组碱性磷酸酶染色增强，提示淫羊藿苷具有明显促进骨髓间充质干细胞成骨分化的作用，且淫羊藿苷100 μmol/L时具有最佳效果，因此选用100 μmol/L淫羊藿苷作为后续实验的干预剂量，分别从mRNA与蛋白水平进一步验证淫羊藿苷是否具有促骨髓间充质干细胞成骨分化的活性作用。实验结果发现：相比于环磷酰胺组，淫羊藿苷干预组中Runx2、OC、ALP mRNA及Runx2蛋白的表达水平均明显提高，提示在环磷酰胺导致的骨髓间充质干细胞成骨分化障碍过程中，淫羊藿苷可能是通过上调相关成骨分化关键因子，从而发挥了保护骨髓间充质干细胞成骨分化的作用。骨髓中骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化是持续而复杂的过程，多重信号通路构成网路调控其成骨性分化^[23-25]，研究表明经典Wnt信号通路积极参与调控骨髓间充质干细胞分化^[26-28]，其中Wnt/β-catenin信号通路在调控骨髓间充质干细胞成骨分化方面具有重要作用，研究表明Wnt 信号介导β-catenin入核，可激活下游靶基因Runx2、c-myc、cyclin D1等表达，从而发挥相应的生物学效应^[29-31]。研究发现外源性Dikkopf-1(DKK1)能抑制骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化^[32-33]，同时DKK1基因敲除小鼠中骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化明显得到提高，说明DKK1具有抑制Wnt/β-catenin 信号转导的作用，是负性调节成骨分化的关键因子。实验结果发现淫羊藿苷主要通过增加Wnt4、β-catenin、Cyclin D1 mRNA表达水平，提高β-catenin、Cyclin D1、c-Myc蛋白表达量，并同时抑制负性调节成骨分化因子DKK1的表达。

综上所述，应用环磷酰胺条件培养基干预骨髓间充质干细胞后，导致骨髓间充质干细胞成骨分化障碍。淫羊藿苷可通过提高成骨特异性转录因子ALP、OC、Runx2 mRNA及Runx2蛋白表达，保护骨髓间充质干细胞成骨分化特性，其机制可能与激活Wnt/ β-catenin 信号有关。该实验为进一步体内实验奠定了基础，同时也为化疗导致骨质疏松的药物开发提供了数据支持。

淫羊藿苷对环磷酰胺化疗导致小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化障碍的保护作用

Icariin protects against cyclophosphamide-induced obstacle of mouse bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into osteoblasts

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.