成年大鼠脑膜组织中具有干细胞特性的细胞亚群体外可向神经元诱导分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.024

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (50): 8172-8176.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.024

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

成年大鼠脑膜组织中具有干细胞特性的细胞亚群体外可向神经元诱导分化

刘德¹，李向明²，谷席娟³

¹聊城市第三人民医院，山东省聊城市 252000；²山东大学第二医院，山东省济南市 250033；³聊城大学医院，山东省聊城市 252000

收稿日期:2015-10-30 出版日期:2015-12-03 发布日期:2015-12-03
通讯作者: 谷席娟，副主任医师，聊城大学医院，山东省聊城市 252000
作者简介:刘德，男，1973年生，山东省聊城市人，汉族，1973年滨州医学院毕业，副主任医师，主要从事神经外科脑肿瘤研究。
基金资助:
山东省科技攻关项目(2012GG10001020)；山东省自然科学基金青年基金项目(ZR2011HQ045)

Neuronal differentiation of cell subsets with stem cell characteristics in adult rat meningeal tissues

Liu De¹, Li Xiang-ming², Gu Xi-juan³

¹Liaocheng Third People’s Hospital, Liaocheng 252000, Shandong Province, China; ²Second Hospital of Shandong University, Jinan 250033, Shandong Province, China; ³Liaocheng University Hospital, Liaocheng 252000, Shandong Province, China

Received:2015-10-30 Online:2015-12-03 Published:2015-12-03
Contact: Gu Xi-juan, Associate chief physician, Liaocheng University Hospital, Liaocheng 252000, Shandong Province, China
About author:Liu De, Associate chief physician, Liaocheng Third People’s Hospital, Liaocheng 252000, Shandong Province, China
Supported by:
the Scientific Tackle Key Project of Shandong Province, No. 2012GG10001020; the Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2011HQ045

摘要/Abstract

摘要：

背景：神经干细胞具有多向分化潜能，可以分化为神经元和神经胶质细胞等，替代受损伤的脑细胞，达到修复神经损伤的目的。
目的：观察成年大鼠脑膜组织中具有干细胞特性细胞亚群的成神经诱导分化能力。
方法：取成年SD大鼠，麻醉后获取脑膜组织制备成细胞悬液，接种在培养皿中进行传代培养，进行Nestin免疫荧光染色。取第3代细胞，用含曲古抑菌素A的完全培养基进行成神经诱导培养，诱导7 d之后采用Westen blotting检测神经细胞相关标志性蛋白NF-200和BM88蛋白的表达。
结果与结论：培养24 h，脑膜细胞中有部分球形细胞发生悬浮，部分细胞出现贴壁生长现象。另外，还可以观察到部分散在球形细胞逐渐形成克隆球，随着体积的不断增大，生长速度呈现下降趋势。免疫细胞化学染色分析干细胞标记物Nestin呈强阳性表达，细胞核使用Hoechst染色之后，荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。成神经诱导7 d时相关标志性蛋白NF-200和BM88蛋白均呈明显表达。结果表明，成年SD大鼠脑膜组织中具有干细胞特性的细胞亚群在体外诱导后能够向神经元方向发生分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 分化, 脑膜组织, 大鼠, 成年, 诱导, 分化, 神经干细胞, 神经细胞, 山东省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Neural stem cells have the potential to differentiate into neurons and glial cells to replace the injured brain cells, so as to achieve the purpose of repairing nerve injury.
OBJECTIVE: To observe the neuronal differentiation ability of cell subsets with stem cell characteristics in the adult rat meningeal tissues.
METHODS: Under anesthesia, the meningeal tissues were obtained from adult Sprague-Dawley rats to make cell suspension followed by inoculation and subculture. Then, the Nestin immunofluorescence staining was performed. The third generation cells were cultured in vitro with complete culture medium containing trichostatin A. After 7 days of induction, western blot assay was used to detect the expression of NF-200 and BM88 proteins in neural cells.
RESULTS AND CONCLUSION: At 24 hours of culture, some spherical cells were suspended and some cells adherent. In addition, some spherical cells scattered gradually formed the clone spheres, and the growth rate decreased with the increasing volume. The positive expression of Nestin was detected by immunocytochemistry staining, and the cell nucleus was stained blue by Hoechst staining. BM88 and NF-200 proteins were all expressed at 7 days of neural induction. These findings indicate that the cell subsets with stem cell characteristics in the adult rat meningeal tissues can differentiate into neurons after in vitro induction.

中图分类号:

R394.2

刘德，李向明，谷席娟. 成年大鼠脑膜组织中具有干细胞特性的细胞亚群体外可向神经元诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(50): 8172-8176.

Liu De, Li Xiang-ming, Gu Xi-juan. Neuronal differentiation of cell subsets with stem cell characteristics in adult rat meningeal tissues[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(50): 8172-8176.

图/表（结果） 4

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。
1.2 时间及地点实验于2015年3至6月在聊城市第三人民医院完成。
1.3 材料健康成年SD大鼠5只，雌雄不限，体质量250- 300 g，由北京大学医学部实验动物科学部提供，许可证号：SCXK(京)2011-0012。研究相关内容和方法均经伦理部门审核并批准，实验设计方案、使用动物品种品系规格、处死动物的方法、项目进行中设计动物福利和伦理问题等均符合要求。
1.4 实验方法
1.4.1 脑膜组织处理和细胞培养获取大鼠脑膜组织，用DMEM培养基漂洗3次，彻底清除血渍，然后转移至0.25%胰酶中，用眼科剪将脑膜组织剪碎，通过机械吹打方式获得细胞悬液，用培养基终止消化，离心、清洗去除胰酶。将细胞培养于无血清DMEM/F12培养基(添加 20 μg/L表皮生长因子、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、B27)，调整细胞浓度为1×106 L-1，接种在培养皿中，置于37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中进行传代培养，每3 d换液1次，每天观察细胞生长情况，并照相保存。
1.4.2 免疫细胞化学染色取第3代细胞培养2 d之后用PBS清洗数次，40 g/L多聚甲醛4 ℃固定过夜，0.25%Triton X-100 37 ℃孵育0.5 h，牛血清清蛋白37 ℃孵育1 h， Nestin抗体4 ℃孵育24 h，37 ℃孵育2 h，PBS漂洗3次，每次10 min，Cy3 标记的荧光二抗(稀释度1∶400) 37 ℃孵育1 h，PBS漂洗3次，每次10 min，常规封固、荧光显微镜下观察及摄片。细胞核进行Hoechst染色。

1.4.3 曲古抑菌素A(TSA)处理诱导脑膜细胞收集正常培养的原代脑膜细胞，消化后按1×105 L-1细胞浓度接种于培养皿、24孔板内，观察细胞生长情况，待贴壁后换为含500 nmol/L曲古抑菌素A的完全培养基培养，每3 d更换1次诱导培养基。
1.4.4 Westen blotting检测神经细胞相关标志性蛋白表达诱导7 d，采用Westen blotting检测神经细胞相关标志性蛋白——NF-200蛋白和BM88蛋白表达。实验分为2组，即诱导分化组和正常脑膜细胞对照组。按照5∶1 的比例将蛋白上清液与上样缓冲液进行混合，置于100 ℃条件下进行变性处理5 min，冷却至室温，进行离心、电泳。用5%脱脂奶粉室温封闭，一抗1∶1 00稀释，4 ℃摇床孵育过夜，TBST漂洗5次，每次5 min。二抗1∶10 000稀释，室温条件下置于摇床孵育2 h之后再次用TBST漂洗5次，每次5 min，进行化学发光处理，最后利用凝胶成像系统进行摄像记录。
1.5 主要观察指标 ①不同时间原代培养脑膜细胞的生长情况。②Nestin免疫染色结果以及细胞核Hoechst染色情况。③神经细胞相关标志性蛋白表达。

讨论

人体内的神经细胞和心肌细胞、骨骼肌细胞一样属于永久细胞，即不可再生细胞^[8-9]。神经细胞一旦出现死亡则很难进行修复，因此无法获得理想的治疗效果^[10-13]。随着医学研究和干细胞理论的不断发展，神经干细胞开始被积极的应用于治疗各种中枢神经系统疾病^[14-17]。神经干细胞是神经系统中的一类具有自我更新能力，能够分化产生神经组织中不同细胞类型的细胞^[18-21]。对于神经系统的发育、神经组织稳态的维持和损伤的修复起着重要的作用，其功能失调与许多神经退行性疾病的发生和发展密切相关^[22]。
目前，脑膜细胞相关的干细胞特性等问题，仍然未得到很好的解决，且相关研究和报道相对较少。脑膜组织中存在大量具有干细胞特性的细胞亚群，且具有良好的稳定性。已有研究从成年SD大鼠的脑膜组织中分离获得具有干细胞特性的细胞亚群^[23]。本研究对其进行体外成神经诱导，分析其诱导成神经细胞的能力。实验通过克隆实验方式分离干细胞特性细胞亚群^[24]，将大鼠脑膜细胞培养于无血清DMEM/F12培养基(添加20 μg/L表皮生长因子+20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子)，培养24 h时少数球形细胞出现悬浮，部分细胞贴壁，贴壁生长的细胞大多单层片状生长。另外还可以观察到部分散在球形细胞呈悬浮半贴壁生长状态，发生分裂、增殖，并逐渐形成克隆球。在培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子作为刺激因子，能够在较短的时间内获得实验所需的神经干细胞^[25]。表皮生长因子可有效促进间质干细胞的增殖并维持细胞的分化潜能^[26-27]。添加表皮生长因子培养神经干细胞，可有效促进神经干细胞的增殖和自我更新。碱性成纤维细胞生长因子也是一种重要的生长因子，联合使用表皮生长因子与碱性成纤维细胞生长因子能更好的促进神经干细胞的增殖，并有效维持神经干细胞的分化潜能^[28]。对神经干细胞进行原代培养过程中，以往大多采用酶消化方式，但实际操作存在一定的问题，无法很好的把握酶作用最佳时间点，且所使用的消化酶容易对细胞产生一定的损害^[29]。因此，本实验选择机械分离的方式来分离培养神经干细胞，利用吸管进行吹打，制备成细胞悬液。
Nestin蛋白即为巢蛋白^[30-31]，属于一种神经元中间丝蛋白，是在中枢神经系统干细胞中发现的^[32-33]。Nestin蛋白的表达开始于神经胚形成时，被认为是神经干细胞特有标志物之一，是神经干细胞的重要阳性标志物^[34-42]。因此，实验选择Nestin作为特异性标志抗原对神经干细胞进行鉴定。本实验结果显示，Nestin免疫反应呈较强的阳性，且阳性产物大多分布于细胞膜以及细胞质，说明脑膜细胞中大多可以稳定表达相应的干细胞标记物。脑膜组织起源于中胚层，实验用含有曲古抑菌素A的完全培养基对脑膜干细胞进行诱导分化，经诱导分化后神经细胞相关标志性蛋白NF-200、BM88呈现出明显的表达。本研究所得到的相关结果以及相应的结论可能存在一定的片面性和不准确，还存在一定的不足之处，还需要在今后的研究中予以进一步完善和分析。
综上所述，分离成年SD大鼠脑膜组织，并对具有干细胞特性的细胞亚群进行体外培养和诱导，可以使其向神经元方向发生分化。脑膜组织中含有大量的具有干细胞特性的细胞亚群，因此，对各种中枢神经系统疾病进行治疗过程中，可以积极的尝试将其作为外源基因的载体以及药物筛选平台，进行基因治疗相关研究。

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